本發(fā)明涉及一種動物胚胎的培養(yǎng)液及其應(yīng)用，尤其涉及胚胎冷凍前降脂的培養(yǎng)液及其制備方法和在提高胚胎冷凍-解凍后的存活率或孵化囊胚率中的應(yīng)用，屬于動物胚胎的培養(yǎng)液領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、體內(nèi)胚胎是指雌性動物配種后，體內(nèi)的卵母細胞受精發(fā)育形成的胚胎。首次配種后第6天，使用沖胚液沖洗子宮角，并在體式顯微鏡下鏡檢沖胚液，可獲得胚胎齡為第6天的胚胎，發(fā)育時期以桑葚胚為主。

2、豬胚胎中高脂質(zhì)含量是物種相關(guān)的細胞特性。然而，高脂質(zhì)含量也被認為是制約豬胚胎冷凍效率提升的重要因素。胚胎冷凍保存技術(shù)主要通過將早期胚胎在極低溫度的條件下保存，能夠長期維持其活力和發(fā)育潛力。目前，冷凍胚胎的移植已在20多個物種上獲得存活后代；牛、羊的胚胎冷凍已成熟的應(yīng)用于商業(yè)化引種。胚胎冷凍保存中，胞內(nèi)大量的脂質(zhì)阻礙了冷凍保護劑的滲透，限制了胚胎玻璃化的效果，是豬胚胎冷凍后細胞活性與發(fā)育潛能喪失的主要原因之一，造成了豬的胚胎冷凍效率低于牛、羊等家畜的現(xiàn)狀，是豬繁殖與種質(zhì)資源保護中亟待突破的難題。在保證胚胎發(fā)育潛能不受損的前提下，實現(xiàn)胚胎降脂，改善降脂后的胚胎冷凍效果，是豬胚胎冷凍保存亟待解決的問題。

3、胚胎降脂主要分為侵入式顯微操作與非侵入式脂質(zhì)調(diào)控。早期的侵入式顯微操作方法是，通過高速離心使脂質(zhì)極化并經(jīng)顯微注射針抽出，以此達到去脂的目的。盡管該方法去脂效果顯著，但高速離心導(dǎo)致胚胎發(fā)育不良，顯微注射造成的透明帶破損會損害細胞發(fā)育潛能，亦會增加病原污染風(fēng)險。因此，利用胚胎生物學(xué)活性，實現(xiàn)非侵入式的降脂，是兼顧豬胚胎降脂與凍胚存活發(fā)育的最佳解決辦法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供一種胚胎冷凍前降脂的培養(yǎng)液。

2、本發(fā)明的目的之二是提供一種胚胎冷凍前降脂的培養(yǎng)液的制備方法。

3、本發(fā)明的目的之三是將所述的培養(yǎng)液應(yīng)用于降低胚胎內(nèi)的脂質(zhì)含量或提高胚胎冷凍-解凍后的存活率和孵化囊胚率等方面中。

4、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的主要技術(shù)方案包括：

5、本發(fā)明一方面提供了一種用于動物胚胎冷凍前降脂的培養(yǎng)液。

6、一種優(yōu)選的具體實施方案，所述的培養(yǎng)液是在動物胚胎培養(yǎng)液中加入苯扎貝特和膽酸制備得到。

7、一種優(yōu)選的具體實施方案，所述的動物胚胎培養(yǎng)液是ncsu23培養(yǎng)液，具體組成為：每100ml培養(yǎng)液中含有以下成分：0.6356g氯化鈉、0.2106g碳酸氫鈉、0.0356g氯化鉀、0.0162g磷酸二氫鉀、0.0294g七水合硫酸鎂、0.0250g二水合氯化鈣、0.1000g?d-葡萄糖、0.0876g牛磺酸、0.0546g亞?；撬?、1.0000ml青霉素鏈霉素溶液，0.4000g牛血清白蛋白，余量是水，ph值是7.2；其中，青霉素鏈霉素溶液的濃度是10000iu/ml。

8、一種優(yōu)選的具體實施方案，所述培養(yǎng)液中苯扎貝特的含量為每100ml培養(yǎng)液中含有40-60μm；優(yōu)選的，培養(yǎng)液中苯扎貝特的含量為每100ml培養(yǎng)液中含有50μm。

9、一種優(yōu)選的具體實施方案，所述培養(yǎng)液中膽酸的含量為每100ml培養(yǎng)液中含有40-60μm；優(yōu)選的，培養(yǎng)液中膽酸的含量為每100ml培養(yǎng)液中含有50μm。

10、本發(fā)明另一方面提供了一種動物胚胎冷凍前降脂的培養(yǎng)液的制備方法，包括：配置動物胚胎培養(yǎng)液，向動物胚胎培養(yǎng)液中加入苯扎貝特和膽酸，即得。

11、本發(fā)明另一方面是將所述的培養(yǎng)液應(yīng)用于降低胚胎內(nèi)的脂質(zhì)含量、或提高胚胎冷凍-解凍后的存活率和孵化囊胚率等方面中。

12、一種優(yōu)選的具體實施方案，該培養(yǎng)液的具體應(yīng)用步驟包括：(1)將所述培養(yǎng)液置于37-39℃、4-6％二氧化碳環(huán)境下預(yù)熱0.5-2h；(2)將動物胚胎轉(zhuǎn)移至預(yù)熱后的培養(yǎng)液中，置于37-39℃、4-6％二氧化碳環(huán)境下孵育5-7h。

13、一種優(yōu)選的具體實施方案，步驟(1)中將所述培養(yǎng)液置于38.5℃、5％二氧化碳環(huán)境下預(yù)熱1h；步驟(2)中將動物胚胎轉(zhuǎn)移至預(yù)熱后的培養(yǎng)液中，置于38.5℃、5％二氧化碳環(huán)境下孵育6h。

14、一種優(yōu)選的具體實施方案，將孵育后的動物胚胎用胚胎培養(yǎng)液洗2-4次，再用于冷凍。

15、一種優(yōu)選的具體實施方案，所述的動物胚胎是豬胚胎，優(yōu)選為發(fā)育時期為桑葚胚期的豬體內(nèi)胚胎。

16、本發(fā)明向動物胚胎培養(yǎng)液中加入苯扎貝特和膽酸，得到了一種動物胚胎冷凍前降脂的培養(yǎng)液，因苯扎貝特和膽酸具有協(xié)同降脂的作用，相比于原有的動物胚胎培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液能夠顯著降低胚胎內(nèi)脂質(zhì)含量并最終有效提高胚胎冷凍-解凍后的存活率和孵化囊胚率。本發(fā)明具有方法簡便、對操作人員的技術(shù)要求低等優(yōu)點，在實際應(yīng)用中有高可重復(fù)性。

技術(shù)特征：

1.用于動物胚胎冷凍前降脂的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液是在動物胚胎培養(yǎng)液中加入苯扎貝特和膽酸制備得到。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于，所述的動物胚胎培養(yǎng)液是ncsu23培養(yǎng)液；所述的ncsu23培養(yǎng)液的組成為：每100ml培養(yǎng)液中含有以下成分：0.6356g氯化鈉、0.2106g碳酸氫鈉、0.0356g氯化鉀、0.0162g磷酸二氫鉀、0.0294g七水合硫酸鎂、0.0250g二水合氯化鈣、0.1000g?d-葡萄糖、0.0876g牛磺酸、0.0546g亞牛磺酸、1.0000ml青霉素鏈霉素溶液，0.4000g牛血清白蛋白，余量是水，ph值是7.2；其中，所述青霉素鏈霉素溶液的濃度是10000iu/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于，每100ml培養(yǎng)液中含有40-60μm苯扎貝特和40-60μm膽酸。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)液，其特征在于，每100ml培養(yǎng)液中含有50μm苯扎貝特和50μm膽酸。

5.一種權(quán)利要求1-4任何一項所述的培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，包括：配置動物胚胎培養(yǎng)液；向所述動物胚胎培養(yǎng)液中加入苯扎貝特和膽酸，即得。

6.權(quán)利要求1-4任何一項所述的培養(yǎng)液在降低動物胚胎脂肪含量中的應(yīng)用、或者在提高動物胚胎冷凍-解凍后的存活率或孵化囊胚率中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，包括：(1)將所述培養(yǎng)液置于37-39℃、4-6％二氧化碳環(huán)境下預(yù)熱0.5-2h；(2)將動物胚胎轉(zhuǎn)移至預(yù)熱后的培養(yǎng)液中，置于37-39℃、4-6％二氧化碳環(huán)境下孵育5-7h。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(1)中將所述培養(yǎng)液置于38.5℃、5％二氧化碳環(huán)境下預(yù)熱1h；步驟(2)中將動物胚胎轉(zhuǎn)移至預(yù)熱后的培養(yǎng)液中，置于38.5℃、5％二氧化碳環(huán)境下孵育6h。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，將孵育后的動物胚胎用胚胎培養(yǎng)液洗2-4次，再用于冷凍。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的動物胚胎是豬胚胎，優(yōu)選為發(fā)育時期為桑葚胚期的豬體內(nèi)胚胎。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了動物胚胎冷凍前降脂的培養(yǎng)液及其制備方法和應(yīng)用。所述培養(yǎng)液是在NCSU23培養(yǎng)液中加入苯扎貝特和膽酸制備得到。本發(fā)明還公開了所述培養(yǎng)液的制備方法，包括：配置NCSU23培養(yǎng)液，向NCSU23培養(yǎng)液中加入苯扎貝特和膽酸，即得。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液相比于常規(guī)NCSU23培養(yǎng)液，因所添加的苯扎貝特和膽酸具有協(xié)同降脂的作用，該培養(yǎng)液能夠顯著降低胚胎內(nèi)脂質(zhì)含量并最終有效提高胚胎冷凍?解凍后的存活率和孵化囊胚率。本發(fā)明的培養(yǎng)液在動物胚胎降脂與凍胚存活發(fā)育等方面具有應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：徐皆歡,戴建軍,潘紅梅,何孟纖,李荷然,張德福,高駿,孫玲偉,吳彩鳳,張樹山
受保護的技術(shù)使用者：上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6