本發(fā)明屬于生物，具體涉及以內(nèi)參基因gapdh為質(zhì)控的bvdv核酸檢測熒光定量rt-pcr試劑盒。

背景技術(shù)：

1、牛病毒性腹瀉病毒(bvdv)呈全球性分布，有2個基因型，即bvdv-1與bvdv-2，和豬瘟病毒(csfv)、羊邊界病毒同屬于黃病毒科瘟病毒屬。近年來，有研究新發(fā)現(xiàn)不同于bvdv-1、bvdv-2的bvdv毒株，被研究者劃分為bvdv-3，由于bvdv與csfv存在廣泛的交叉抗原和血清學交叉反應(yīng)，臨床上很難用血清學方法將其鑒別診斷。

2、熒光定量rt-pcr方法具有特異性強、敏感度高、檢測范圍廣泛的優(yōu)點，是一種重要的檢測方法?，F(xiàn)有檢測bvdv核酸的熒光定量rt-pcr方法，可同時檢測bvdv-1、bvdv-2核酸，但缺乏可同時檢測bvdv-1、bvdv-2和bvdv-3核酸的熒光定量rt-pcr試劑盒，也因無法鑒別csfv，僅用于牛鼻拭子和糞便樣品等牛源性樣品檢測，存在用于豬源性樣品檢測時可能出現(xiàn)“假陽性”的技術(shù)缺陷。此外，現(xiàn)有同時檢測bvdv-1、bvdv-2和bvdv-3核酸的熒光定量rt-pcr試劑盒，缺少內(nèi)參基因設(shè)計，無法監(jiān)測樣品在采集、運輸、樣品處理、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄或擴增反應(yīng)環(huán)節(jié)中的效果，無法避免“假陰性”的出現(xiàn)，無法監(jiān)控整個反應(yīng)過程是否順利進行。內(nèi)參基因是一種維持細胞最低限度功能不可缺少的基因，理想的內(nèi)參基因在不同類型細胞和組織中的表達應(yīng)無顯著差異，且不受試驗和臨床條件的影響。但由于內(nèi)參基因的表達具有物種及組織特異性，其表達的穩(wěn)定性是相對的，所以選擇合適的內(nèi)參基因?qū)怂岫匡@得尤為重要。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)是經(jīng)典的糖酵解酶，由于廣泛存在于眾多生物體中，幾乎在所有組織中都高水平表達。該酶在同種細胞或者組織中的蛋白質(zhì)表達量一般是恒定的，適合作為內(nèi)參基因進行對目的基因檢測的校正和標準化。因此，內(nèi)參基因?qū)φ赵O(shè)置可以避免“假陰性”的出現(xiàn)，監(jiān)控整個反應(yīng)過程是否順利進行。

3、因此，建立以內(nèi)參基因gapdh為質(zhì)控的bvdv核酸檢測熒光定量rt-pcr試劑盒及其制備方法，以避免“假陰性”“假陽性”的出現(xiàn)，檢測更多bvdv基因型，不僅有利于準確高效的bvdv監(jiān)測，而且對于保障動物疫苗質(zhì)量、保護畜牧業(yè)健康發(fā)展、促進我國農(nóng)產(chǎn)品出口等方面均具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供以內(nèi)參基因gapdh為質(zhì)控的bvdv核酸檢測熒光定量rt-pcr試劑盒，引入了一個表達較為穩(wěn)定的持家基因作為內(nèi)參基因進行對目的基因檢測的校正和標準化，避免現(xiàn)有試劑盒可能出現(xiàn)“假陰性”“假陽性”的技術(shù)缺點，以提高試劑盒準確性、靈敏度和重復(fù)性，并且可同時檢測不同樣品中bvdv-1、bvdv-2和bvdv-3核酸。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、以內(nèi)參基因gapdh為質(zhì)控的bvdv核酸檢測熒光定量rt-pcr引物和探針組合，包括：

4、1)擴增bvdv?5′-utr的引物對序列為：

5、上游引物bvdv-f：5′-cagtgagttcvttggatngccg-3′(基因組位置150-171nt)；

6、下游引物bvdv-r：5′-trggttaagatgtrcygtggg-3′(基因組位置255-275nt)；

7、2)檢測bvdv?5′-utr擴增產(chǎn)物的taqman探針序列為：bvdv-p：5′-fam-tgagtacagggdagtcgtcaatggttcg-bhq1?-3′(基因組位置178-205nt)；

8、3)擴增豬內(nèi)參基因gapdh的引物對序列為：

9、上游引物gapdh-f：5′-ccccaacgtgtcggttgt-3′(基因組位置：488-505nt)；

10、下游引物gapdh-r：5′-cttcaccaccttcttgatgtcatc-3′(基因組位置：543-566nt)；

11、4)檢測豬內(nèi)參基因gapdh擴增產(chǎn)物的taqman探針序列為：

12、gapdh-p：5′-vic-atctgacctgccgcctggagaaacc-bhq1?-3′(基因組位置：508-532nt)。

13、所述的熒光定量rt-pcr試劑盒為兩步法taqman探針法試劑盒、兩步法sybr?greeni法試劑盒等等。

14、一種以內(nèi)參基因gapdh為質(zhì)控的bvdv核酸檢測熒光定量rt-pcr試劑盒，其包括擴增bvdv?5′-utr的上游引物bvdv-f和下游引物bvdv-r以及擴增豬內(nèi)參基因gapdh的上游引物gapdh-f和下游引物gapdh-r。

15、進一步地，所述的兩步法taqman探針法試劑盒至少包括以下組分：

16、試劑盒對照：bvdv病毒液陽性對照或者bvdv重組質(zhì)粒陽性對照，gapdh重組質(zhì)粒，陰性對照；

17、cdna合成體系：primescript?rt?master?mix和無酶水；

18、taqman熒光pcr反應(yīng)體系：premix?ex?taq，上游引物bvdv-f，下游引物bvdv-r，taqman探針bvdv-p，上游引物gapdh-f，下游引物gapdh-r，taqman探針gapdh-p，roxreference?dye?ii，無酶水。

19、進一步地，所述的兩步法sybr?green?i法試劑盒至少包括以下組分：

20、試劑盒對照：bvdv病毒液陽性對照或者bvdv重組質(zhì)粒陽性對照，gapdh重組質(zhì)粒，陰性對照；

21、cdna合成體系：primescript?rt?master?mix和無酶水；

22、sybr熒光pcr反應(yīng)體系：tb?green?premix?ex?taqⅱ，上游引物bvdv-f，下游引物bvdv-r，上游引物gapdh-f，下游引物gapdh-r，rox?reference?dye?ii，無酶水。

23、進一步地，所述試劑盒中：

24、bvdv病毒液陽性對照：為bvdv病毒液，經(jīng)甲醛37℃滅活后分裝備用。

25、bvdv重組質(zhì)粒陽性對照：為含有bvdv?5′-utr基因目的片段【基因組位置(1-385nt)】的重組質(zhì)粒；

26、gapdh重組質(zhì)粒：為含有內(nèi)參基因gapdh目的片段【基因組位置(335-719nt)】的重組質(zhì)粒。非豬源性樣品加入gapdh重組質(zhì)粒后，再進行核酸提取；豬源性樣品不必加入gapdh重組質(zhì)粒，直接進行核酸提取。

27、陰性對照：為無酶水、已知bvdv陰性且gapdh陰性的細胞培養(yǎng)液、或者已知bvdv陰性且gapdh陰性的動物組織懸液中的一種。

28、進一步地，所述試劑盒中：

29、bvdv病毒液陽性對照：為bvdv?av69株mdbk細胞傳代產(chǎn)物，其病毒滴度為102.5faid50/0.1ml至106.5faid50/0.1ml，經(jīng)甲醛37℃滅活后分裝備用。

30、bvdv重組質(zhì)粒陽性對照：為含有bvdv?5′-utr基因目的片段【基因組位置(1-385nt)】的重組質(zhì)粒，10?000拷貝數(shù)/μl至500?000拷貝數(shù)/μl。

31、gapdh重組質(zhì)粒：為含有內(nèi)參基因gapdh目的片段【基因組位置(335-719nt)】的重組質(zhì)粒，10?000拷貝數(shù)/ul至500?000拷貝數(shù)/ul。

32、優(yōu)選地，bvdv重組質(zhì)粒陽性對照：為含有bvdv-1oregon?c24v株(genbank登錄號：af091605)5′-utr基因目的片段的重組質(zhì)粒，或者含有bvdv-2sh-28株(genbank登錄號：hq258810.1)5′-utr基因目的片段的重組質(zhì)粒，或者含有bvdv-3th/04_khonkaen株(genbank登錄號：nc_012812.1)5′-utr基因目的片段的重組質(zhì)粒。

33、本發(fā)明具有以下有益效果：

34、1.本發(fā)明建立了以內(nèi)參基因gapdh為質(zhì)控的并且可同時檢測不同樣品中bvdv-1、bvdv-2和bvdv-3核酸的熒光定量rt-pcr試劑盒。而現(xiàn)有專利主要用于檢測bvdv-1、bvdv-2核酸，極少數(shù)用于同時檢測bvdv-1、bvdv-2和bvdv-3核酸的熒光定量rt-pcr試劑盒，也因無法鑒別csfv，僅用于牛鼻拭子和糞便樣品等牛源性樣品檢測，存在用于豬源性樣品檢測時可能出現(xiàn)“假陽性”的技術(shù)缺陷，見應(yīng)用例2。因此，本發(fā)明可以檢測更多bvdv基因型，見應(yīng)用例1。

35、2.本發(fā)明提供了以內(nèi)參基因gapdh為質(zhì)控的bvdv核酸檢測熒光定量rt-pcr試劑盒，引入了一個表達較為穩(wěn)定的持家基因gapdh作為內(nèi)參基因進行對目的基因檢測的校正和標準化，可監(jiān)測樣品在采集、運輸、樣品處理、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄或擴增反應(yīng)的全部過程，如果內(nèi)參基因?qū)φ諢o擴增曲線，則提示樣品在采集、運輸、樣品處理、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄或擴增反應(yīng)環(huán)節(jié)中存在問題，該樣品檢測結(jié)果無效，避免樣品“假陰性”的出現(xiàn)，見應(yīng)用例3。

36、現(xiàn)有專利試劑盒按照牛gapdh的mrna特異性核苷酸序列，研制了牛gapdh內(nèi)標檢測引物，其檢測組織樣品來源于牛，無法擴增豬gapdh基因，無法了解豬源性組織樣本在采集、運輸、處理、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、擴增反應(yīng)等多個過程中是否存在“假陰性”，不適用于豬源性組織樣本檢測，且無法檢測bvdv-3，見應(yīng)用例3。即使極少數(shù)可同時檢測bvdv-1、bvdv-2和bvdv-3核酸的現(xiàn)有熒光定量rt-pcr試劑盒，因為缺少內(nèi)參基因設(shè)計，導(dǎo)致無法避免樣品“假陰性”的出現(xiàn)，無法監(jiān)控樣品在整個反應(yīng)過程是否順利進行，見應(yīng)用例2。

37、本發(fā)明填補了在基于內(nèi)參基因gapdh同時進行bvdv-1、bvdv-2和bvdv-3核酸檢測的熒光定量rt-pcr試劑盒上的技術(shù)空白，對于保障動物疫苗質(zhì)量、保護畜牧業(yè)健康發(fā)展、促進我國農(nóng)產(chǎn)品出口等方面均具有重要意義。

38、3.本發(fā)明試劑盒具有較高的靈敏度，對bvdv-1av69株、bvdv-2重組質(zhì)粒模板、bvdv-3重組質(zhì)粒模板的最低檢出限分別為10-0.5faid50/0.1ml、1拷貝數(shù)/ul、10拷貝數(shù)/ul。本發(fā)明試劑盒的最低檢出限低于現(xiàn)有專利，靈敏度高于現(xiàn)有專利，見應(yīng)用例1-3。并且，本發(fā)明試劑盒檢測具有良好的線性關(guān)系和較高的擴增效率，有利于準確高效的bvdv監(jiān)測。

39、4.本發(fā)明的引物和探針組可以用于多種熒光定量rt-pcr試劑盒，可根據(jù)實際檢測需求選擇試劑盒，具有檢測成本低、實用價值高、應(yīng)用前景廣的優(yōu)勢，見應(yīng)用例1-3。