本發(fā)明涉及生物檢測，具體涉及一種鑒定川陜哲羅鮭性別的pcr引物、試劑盒及鑒定方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、川陜哲羅鮭（ hucho?bleekeri?kimura）是鮭形目（salmoniformes）、鮭科（salmonidae）、哲羅鮭屬（ hucho）魚類，又名虎嘉魚、布氏哲羅鮭、四川哲羅鮭、貝氏哲羅鮭、貓魚等。川陜哲羅鮭是青藏高原地區(qū)唯一的大型土著鮭科魚類，為第四紀(jì)冰川時期殘留種，是哲羅鮭屬魚類分布最南的種類，在學(xué)術(shù)、生態(tài)、人文、經(jīng)濟方面具有重要研究價值，同時也是中國特有魚種和長江上游重要的冷水魚類種質(zhì)資源。上世紀(jì)60年代以來，受人類活動等因素影響，川陜哲羅鮭的大部分棲息生態(tài)環(huán)境遭到破壞，分布區(qū)域明顯縮小、野生種群規(guī)模銳減。目前，僅大渡河上游和太白河部分水域還有一定數(shù)量分布。由于種群數(shù)量稀少，2021年，川陜哲羅鮭被《國家重點保護野生動物名錄》列為國家ⅰ級重點保護野生動物，被《世界自然保護聯(lián)盟紅皮書》列為極度瀕危等級。

2、川陜哲羅鮭沒有第二性征，外部特征不足以進行性別鑒定，并且川陜哲羅鮭性成熟時間較長，性成熟年齡一般都在3年以上。這對于野生川陜哲羅鮭資源的保護、增殖放流及其人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了極大的困難。因此，性別鑒定成為川陜哲羅鮭野生資源保護及人工養(yǎng)殖過程中的熱點和焦點問題。目前獲取川陜哲羅鮭性別相關(guān)信息通常是進行解剖，取出性腺進行觀察或者組織切片鑒定，這種方法的準(zhǔn)確性受到個體大小及性腺發(fā)育階段的影響，且需要活體解剖后才能進行。因此，急需要開發(fā)出一種快速高效且對川陜哲羅鮭傷害較小的性別鑒定方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種鑒定川陜哲羅鮭性別的pcr引物、試劑盒及鑒定方法和應(yīng)用，以解決現(xiàn)有性別鑒定方法檢測速度慢且對川陜哲羅鮭傷害較大的問題。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：提供一種用于川陜哲羅鮭性別鑒定的pcr引物，pcr引物的上游引物序列如seq?id?no.1所示，下游引物序列如seq?id?no.2所示。

3、本發(fā)明提供一種用于川陜哲羅鮭性別鑒定的試劑盒，包括上述的pcr引物。

4、本發(fā)明提供一種川陜哲羅鮭性別的鑒定方法，包括以下步驟：以待測的川陜哲羅鮭總dna為模板，采用上述的pcr引物或上述的試劑盒進行pcr擴增，對pcr產(chǎn)物進行檢測。

5、進一步，pcr擴增的反應(yīng)體系為：2×es?taq?master?mix?(dye)?25μl、上游引物f1.5μl、下游引物r?1.5μl、模板/樣品?1.0μl以及rnase?free?water?21.0μl。

6、進一步，pcr擴增的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸8min。

7、進一步，若pcr引物擴增出大小為343bp的條帶，則判定待測川陜哲羅鮭為雄性，若pcr引物沒有擴增出大小為343bp的條帶，則判定待測川陜哲羅鮭為雌性。

8、本發(fā)明提供一種上述鑒定方法在鑒定川陜哲羅鮭性別中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明提供一種上述pcr引物在鑒定川陜哲羅鮭性別中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明還提供一種上述試劑盒在鑒定川陜哲羅鮭性別中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明基于川陜哲羅鮭的sdy基因開發(fā)出了一種新的用于檢測川陜哲羅鮭性別的pcr引物。使用本發(fā)明的引物可以特異性擴增川陜哲羅鮭sdy基因片段，雄性個體有一條343bp的特異性擴增片段，雌性個體無343bp的特異性擴增片段，因此可以簡單、精確地對川陜哲羅鮭的性別進行區(qū)分。本發(fā)明的鑒定方法可以在不需要殺死川陜哲羅鮭的情況下，只需要剪取鰭條就可以鑒定川陜哲羅鮭的性別，同時對于性腺沒有成熟的幼魚也可以提前進行性別鑒定。為川陜哲羅鮭性別控制育種、野生資源保護和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供幫助。

技術(shù)特征：

1.一種用于川陜哲羅鮭性別鑒定的pcr引物，其特征在于，所述pcr引物的上游引物序列如seq?id?no.1所示，下游引物序列如seq?id?no.2所示。

2.一種用于川陜哲羅鮭性別鑒定的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的pcr引物。

3.一種川陜哲羅鮭性別的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：以待測的川陜哲羅鮭總dna為模板，采用權(quán)利要求1所述的pcr引物或權(quán)利要求2所述的試劑盒進行pcr擴增，對pcr產(chǎn)物進行檢測。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的川陜哲羅鮭性別的鑒定方法，其特征在于，所述pcr擴增的反應(yīng)體系為：2×es?taq?master?mix?(dye)?25μl、上游引物f?1.5μl、下游引物r?1.5μl、模板/樣品?1.0μl以及rnase?free?water?21.0μl。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的川陜哲羅鮭性別的鑒定方法，其特征在于，所述pcr擴增的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸8min。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的川陜哲羅鮭性別的鑒定方法，其特征在于，若所述pcr引物擴增出大小為343bp的條帶，則判定待測川陜哲羅鮭為雄性，若所述pcr引物沒有擴增出大小為343bp的條帶，則判定待測川陜哲羅鮭為雌性。

7.權(quán)利要求3-6任一項所述的鑒定方法在鑒定川陜哲羅鮭性別中的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求1所述的pcr引物在鑒定川陜哲羅鮭性別中的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求2所述的試劑盒在鑒定川陜哲羅鮭性別中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種鑒定川陜哲羅鮭性別的PCR引物、試劑盒及鑒定方法和應(yīng)用，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明基于川陜哲羅鮭的sdy基因開發(fā)出了一種新的用于檢測川陜哲羅鮭性別的PCR引物。使用本發(fā)明的引物可以特異性擴增川陜哲羅鮭sdy基因片段，雄性個體有一條343bp的特異性擴增片段，雌性個體無343bp的特異性擴增片段，因此可以簡單、精確地對川陜哲羅鮭的性別進行區(qū)分。本發(fā)明的鑒定方法可以在不需要殺死川陜哲羅鮭的情況下，只需要剪取鰭條就可以鑒定川陜哲羅鮭的性別，同時對于性腺沒有成熟的幼魚也可以提前進行性別鑒定。為川陜哲羅鮭性別控制育種、野生資源保護和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供幫助。

技術(shù)研發(fā)人員：衛(wèi)秦瑤,楊玖賢,陳葉雨,李華,譚平,楊煥超,劉釗,文典,陳彥伶,王渝棟,涂全宇,喻燚,劉桂良,杜軍
受保護的技術(shù)使用者：四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6