本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用，涉及到一株能夠降解高濃度木質(zhì)纖維素來源抑制物的菌株及其活力維持方法，該菌株有極大潛力應(yīng)用于木質(zhì)纖維素生物煉制的脫毒過程。

背景技術(shù)：

1、木質(zhì)纖維素生物煉制通常包括預(yù)處理、糖化、脫毒和發(fā)酵等過程。預(yù)處理可打破木質(zhì)纖維素生物質(zhì)天然的致密結(jié)構(gòu)，有利于后續(xù)的酶水解。但預(yù)處理過程中會產(chǎn)生大量微生物生長抑制物，主要包括木糖過度降解產(chǎn)生的糠醛、葡萄糖過度降解產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛、以及半纖維素乙?；厢尫懦龅囊宜岬?。

2、通常來說，提高預(yù)處理強(qiáng)度能顯著提高酶水解得率，但同時也會增加抑制物的生成。此外一些工農(nóng)業(yè)廢棄物，如糠醛生產(chǎn)副產(chǎn)品玉米芯殘?jiān)?，也含有高濃度抑制?乙酸含量超過5％，w/w)。這些抑制物會嚴(yán)重抑制后續(xù)發(fā)酵菌株的正常生長和代謝，因此這些生物質(zhì)如果需要進(jìn)行后續(xù)的生物轉(zhuǎn)化，必須采用有效的脫毒手段去除其中的抑制物。

3、采用特定的微生物可以對木質(zhì)纖維素水解液中的抑制物進(jìn)行去除。相比于物理和化學(xué)方法，生物脫毒具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、毒性副產(chǎn)物少、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。但現(xiàn)有的生物脫毒菌株仍難以滿足對高強(qiáng)度預(yù)處理原料和糠醛渣原料中抑制物的有效去除。例如，唐傳生物科技有限公司的張厚瑞等人(cn?101735958、cn?102010833)公開了一種在半纖維素水解液中培養(yǎng)東方伊薩酵母或西方伊薩酵母來進(jìn)行糠醛和乙酸的部分降解，但降解能力有限，且只能在預(yù)處理液(半纖維素水解液)中進(jìn)行。武漢科技大學(xué)左振宇等人(cn118086415?a)公開了一種使用皮狀絲孢酵母對生物質(zhì)水解液進(jìn)行生物脫毒的方法，但皮狀絲孢酵母只能將一些特定的抑制物轉(zhuǎn)化為低毒性化合物(journal?of?biotechnology,2022,343:32-37)；此外，該方法僅在低固體含量下(小于15％，w/w)進(jìn)行了實(shí)施，糖濃度較低，同時也意味著菌株無法耐受高濃度抑制物。華東理工大學(xué)鮑杰等人(cn?102191279)公開了一種使用樹脂枝孢菌對預(yù)處理后固態(tài)木質(zhì)纖維素物料中的抑制物進(jìn)行生物降解的方法，但該方法僅針對固態(tài)原料，無法實(shí)現(xiàn)對水解液的脫毒，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。華東理工大學(xué)鮑杰等人(cn

4、110713939b)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)的可對多種木質(zhì)纖維素來源抑制物進(jìn)行完全降解的野生型生物脫毒菌株宛氏擬青霉fn89(paecilomyces?variotii?fn89)，僅能實(shí)現(xiàn)對低濃度混合抑制物的降解(糠醛僅0.1g/l、乙酸僅4.0g/l)?，F(xiàn)有的生物脫毒菌株必須采用有效的手段提高其抑制物耐受性，才有可能實(shí)現(xiàn)對含有高濃度抑制物生物質(zhì)有效的生物脫毒，促進(jìn)其生物轉(zhuǎn)化。

5、公開與該技術(shù)背景部分中的信息僅旨在增加對本發(fā)明背景的總體理解，而不應(yīng)被視為以任何形式承認(rèn)或暗示該信息構(gòu)成本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于上述所報(bào)道生物脫毒菌株的不足，本發(fā)明以從含有高濃度抑制物的工業(yè)玉米芯糠醛渣中分離得到的一株宛氏擬青霉(paecilomyces?variotii)為出發(fā)菌株，在含有高濃度混合抑制物的培養(yǎng)基中經(jīng)過長達(dá)70代(共210天)的適應(yīng)性進(jìn)化后，獲得了一株穩(wěn)定代謝高濃度混和抑制物的進(jìn)化菌株，命名為宛氏擬青霉zw70(paecilomyces?variotiizw70)。相比于以前的生物脫毒菌株，該菌株代謝高濃度混合木質(zhì)纖維素來源抑制物的能力更強(qiáng)。為了避免菌株經(jīng)長期使用或保藏后活力退化，方法中還同時建立了菌株的活化方法，保證了其在工業(yè)應(yīng)用中長期使用時代謝高濃度抑制物能力的穩(wěn)定性。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、首先從工業(yè)玉米芯來源糠醛渣原料中分離得到了一株對木質(zhì)纖維素原料具有一定降解能力的絲狀真菌。經(jīng)its序列鑒定為宛氏擬青霉(paecilomyces?variotii)。隨后在含有抑制物的合成培養(yǎng)基中對該菌株經(jīng)過長周期的適應(yīng)性進(jìn)化，最終了獲得具有穩(wěn)定降解高濃度木質(zhì)纖維素來源抑制物的脫毒菌株宛氏擬青霉zw70(paecilomyces?variotiizw70)。鑒于脫毒菌株在長期使用后或在冰箱長期凍存后極易造成脫毒性能的退化，

4、本發(fā)明上述分離自工業(yè)玉米芯來源糠醛渣原料的絲狀真菌，經(jīng)its序列比對后，鑒定為宛氏擬青霉paecilomyces?variotii。

5、進(jìn)一步，所述分離自工業(yè)玉米芯來源糠醛渣原料的絲狀真菌的長周期的適應(yīng)性進(jìn)化方法，包括如下步驟：

6、(1)孢子液制備：將野生型宛氏擬青霉在pda平板劃線，37℃下培養(yǎng)4天，產(chǎn)生大量灰黃色孢子；使用0.05％(w/w)tween?80清洗平板并收集孢子液，用于后續(xù)傳代培養(yǎng)；孢子液濃度為108-109個/ml；

7、(2)長周期進(jìn)化所用培養(yǎng)基的制備：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有2g/l?kh2po4,1g/l(nh4)2so4,1g/l?mgso4·7h2o,1g/l?yeast?extract,0.5g/l?cacl2和15g/l葡萄糖；進(jìn)化過程共分為五個階段，在不同階段向培養(yǎng)基中添加不同濃度的乙酸、5-羥甲基糠醛和糠醛混和抑制物，第一階段乙酸5g/l、5-羥甲基糠醛0.5g/l、糠醛0.5g/l；第二階段乙酸7.0g/l、5-羥甲基糠醛1.0g/l、糠醛0.5g/l；第三階段乙酸9.0g/l、5-羥甲基糠醛1.5g/l、糠醛0.5g/l；第四階段乙酸11.0g/l、5-羥甲基糠醛1.5g/l、糠醛0.5g/l；第五階段乙酸15.0g/l、5-羥甲基糠醛1.5g/l、糠醛0.5g/l；

8、(3)長周期適應(yīng)期進(jìn)化：宛氏擬青霉孢子液按照1％(v/v)的比例接種到100ml第一階段進(jìn)化培養(yǎng)基中，初始ph調(diào)節(jié)至4.5，37℃，300rpm培養(yǎng)3天；隨后按照10％(v/v)接種量連續(xù)傳代70次；

9、(4)單菌落分離：傳代培養(yǎng)液在pda平板經(jīng)劃線分離，得到單菌落。

10、本發(fā)明所述的一株降解高濃度木質(zhì)纖維來源抑制物的生物脫毒菌株，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間為2024年8月28日，保藏編號為cctcc?m?20241863。

11、本發(fā)明還提供所述一株降解高濃度木質(zhì)纖維來源抑制物的生物脫毒菌株代謝高抑制物的活力維持方法，包括以下幾點(diǎn)：

12、(1)活化所用培養(yǎng)基的制備：在pda培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基中含有2g/l?kh2po4,1g/l(nh4)2so4,1g/l?mgso4·7h2o,1g/l?yeast?extract,0.5g/l?cacl2，15g/l葡萄糖，15.0g/l乙酸、1.5g/l?5-羥甲基糠醛和0.5g/l糠醛，制備成活化用固體平板；

13、(2)菌種活化：使用接種環(huán)直接刮取保藏在冰箱的平板、甘油種、或長期使用的菌種，在活化培養(yǎng)平板上劃線，在37℃下培養(yǎng)3-5天，每次挑取較大單菌落進(jìn)行劃線傳代培養(yǎng)3次。

14、(3)經(jīng)傳代培養(yǎng)活化后的進(jìn)化菌株仍可以實(shí)現(xiàn)在合成培養(yǎng)基和木質(zhì)纖維素水解液中對高濃度抑制物的高效降解。

15、本發(fā)明提供的恢復(fù)該菌株脫毒活力并對含有高濃度抑制物的木質(zhì)纖維素水解液進(jìn)行生物脫毒的方法，更具體包括步驟：

16、(1)用于菌種活力恢復(fù)培養(yǎng)基的制備：將活化的菌株進(jìn)一步在含有高濃度木質(zhì)纖維素混合抑制物的pda固體培養(yǎng)基平板中進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，用于恢復(fù)其代謝高濃度抑制物的能力。作為優(yōu)選，培養(yǎng)基中添加的混合抑制物為15.0g/l乙酸、1.5g/l?5-羥甲基糠醛和0.5g/l糠醛。

17、(2)菌種活力恢復(fù)：將長期使用后脫毒能力退化或在冰箱長期保存后的宛氏擬青霉zw70(paecilomyces?variotii?zw70)劃線于含有抑制物的pda平板上，37℃恒溫培養(yǎng)3～4天。挑取較大菌落進(jìn)行重復(fù)傳代培養(yǎng)3-4次。

18、(3)生物脫毒種子液培養(yǎng)：真菌孢子覆蓋的傳代平板上加入10ml的0.05％(v/v)tween80水溶液，然后用滅菌的細(xì)胞涂布棒刮取、收集孢子液。將1ml孢子液接種到100ml不含抑制物的真菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在37℃恒溫和300rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24小時。作為優(yōu)選，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有2g/l?kh2po4,1g/l(nh4)2so4,1g/l?mgso4·7h2o,1g/l?yeast?extract,0.5g/lcacl2和15g/l葡萄糖。

19、(4)生物脫毒：將種子培養(yǎng)液以10％(v/v)接種量接種到含有抑制物的木質(zhì)纖維素水解液中。

20、步驟(4)中的質(zhì)纖維素原料包括但不限于秸稈、木屑、玉米芯糠醛渣等常見木質(zhì)纖維素原料。作為優(yōu)選，為小麥秸稈

21、步驟(4)中的脫毒條件為28-48℃、200-750rpm、0.5-2.0vvm。作為優(yōu)選，其培養(yǎng)條件為37℃、750rpm轉(zhuǎn)速、1vvm通氣量。

22、步驟(4)中生物脫毒時，進(jìn)化菌株zw70在抑制物存在的情況下其醇脫氫酶、醛脫氫酶等與乙酸和酚醛抑制物降解有關(guān)的基因活力相比于出發(fā)菌株顯著上升。作為優(yōu)選，adh,acs,ach1,和acka基因上調(diào)表達(dá)最為顯著。

23、步驟(4)中生物脫毒結(jié)束時，在木質(zhì)纖維素水解液中檢測不到木質(zhì)纖維素來源抑制物。作為優(yōu)選，其中乙酸、5-羥甲基糠醛和糠醛抑制物濃度降低至液相無法檢測出，同時可發(fā)酵糖的損失低于5％。

24、步驟(4)中經(jīng)生物脫毒的木質(zhì)纖維素水解液可用于多種生物基化學(xué)品的發(fā)酵生產(chǎn)。作為優(yōu)選，包括但不限于乳酸、乙醇、油脂、糖酸、氨基酸等。

25、本發(fā)明所述的進(jìn)化菌株具有穩(wěn)定降解高濃度木質(zhì)纖維素來源抑制物的能力，在于以下幾點(diǎn)：

26、(1)進(jìn)化菌株在含有高濃度抑制物的合成培養(yǎng)基中可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的生長和對高濃度抑制物的快速降解。

27、(2)進(jìn)化菌株在各類木質(zhì)纖維素水解液中均可以實(shí)現(xiàn)對其中高濃度抑制物的快速降解，其木質(zhì)纖維素包括但不限于秸稈、木屑、玉米芯糠醛渣等常見木質(zhì)纖維素原料。

28、本發(fā)明提供的一株能夠降解高濃度木質(zhì)纖維素來源抑制物的菌株及其活力維持方法。通過在含有高濃度糠醛和乙酸抑制物的工業(yè)玉米芯來源糠醛渣中的微生物進(jìn)行分離純化，獲得了一株對各類木質(zhì)纖維素來源抑制物均有一定代謝能力的真菌，經(jīng)its序列比對、鑒定為宛氏擬青霉paecilomyces?variotii。為了提高其抑制物代謝能力，對其在含有高濃度抑制物的合成培養(yǎng)基中開展了長達(dá)70代(共210天)的連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。最終獲得的穩(wěn)定進(jìn)化菌株命名為宛氏擬青霉zw70(paecilomyces?variotii?zw70)(保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2024年8月28日，保藏編號為cctcc?m?20241863)。獲得的進(jìn)化菌株對木質(zhì)纖維素來源混和抑制物的降解能力從初始濃度5g/l的乙酸鈉、、0.5g/l的5-羥甲基糠醛和0.5g/l的糠醛分別增加到15g/l的乙酸鈉、1.5g/l的5-羥甲基糠醛和0.5g/l的糠醛。為防止該菌株在長期傳代使用或保存期間脫毒性能的退化，進(jìn)一步提出了通過在含有高濃度抑制物的固體培養(yǎng)基下持續(xù)傳代，用以維持菌株活力的方法。本發(fā)明為木質(zhì)纖維素生物煉制過程提供了一株穩(wěn)定的高效降解高濃度抑制物的脫毒菌株，并且可有效防止菌株退化，極具工業(yè)應(yīng)用潛力。

29、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下積極效果：

30、本發(fā)明所提供的宛氏擬青霉進(jìn)化菌株zw70(paecilomyces?variotii?zw70)相比于出發(fā)菌株和其他脫毒菌株具有對木質(zhì)纖維來源高濃度抑制物更強(qiáng)的耐受性和降解能力。該發(fā)明還針對工業(yè)應(yīng)用菌株在長期使用和保藏過程中表現(xiàn)不穩(wěn)定的現(xiàn)象提出了應(yīng)對方法，可有效防止菌株退化。脫毒過程無需添加外源營養(yǎng)物、幾乎無可發(fā)酵糖的損失，具有顯著的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用潛力。

31、生物保藏說明：

32、菌株命名為宛氏擬青霉zw70(paecilomyces?variotii?zw70)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2024年8月28日，保藏編號為cctcc?m?20241863。