本發(fā)明屬于分子生物學(xué)方法鑒定植物性別的，具體涉及一種用于鑒別開心果性別的分子標(biāo)記、引物對和方法。

背景技術(shù)：

1、開心果，學(xué)名阿月渾子(pistacia?vera?l.)是雌雄異株植物，雌雄個體的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)性狀有明顯差異。開心果雌株結(jié)果量大，是重要的堅果來源。然而，開心果樹的雌雄異株特性，造成了其在育種層面具有天然的不便利性。雜交新品種的性別往往需要長時間的種植才能鑒定。因此，開心果樹早期性別鑒定一直是開心果苗木生產(chǎn)和栽培應(yīng)用的一項重要需求。

2、目前，開心果性別鑒別的傳統(tǒng)方法主要依靠形態(tài)學(xué)特征，如樹或花朵的形態(tài)、顏色等。但這些方法需要等到開心果進(jìn)入開花結(jié)果期才能進(jìn)行，時效性差，無法滿足早期鑒定的需求。此外，還有一些基于生理生化指標(biāo)方法的探索，但這些方法的穩(wěn)定性和正確率都十分有限。

3、2022年，kafkas等在國際期刊《plant?communications》上發(fā)表了題為“thepistachio?genomes?provide?insights?into?nut?tree?domestication?and?zw?sexchromosome?evolution”的研究論文，破譯了開心果的zw型和zz型基因組，提出開心果zw型性染色體形成和演化的模型。這些結(jié)果為設(shè)計高效準(zhǔn)確的開心果性別鑒定分子標(biāo)記提供了基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)中開心果性別鑒定方法存在的嚴(yán)重不足，本發(fā)明提供了一種用于鑒別開心果性別的分子標(biāo)記、引物對和方法，以實現(xiàn)對開心果性別的快速、準(zhǔn)確鑒定。

2、一種用于鑒別開心果性別的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記來源于開心果14號染色體的性別決定區(qū)的關(guān)鍵核苷酸序列，所述的核苷酸序列為w.marker.1，w.marker.2和z.marker.1所示。

3、本發(fā)明提供的用于鑒定開心果性別的核苷酸序列來自已經(jīng)公開發(fā)表開心果基因組的14號染色體。該染色體的sdr區(qū)域符合zw性別決定系統(tǒng)，能將完全區(qū)分開心果雌性和雄性個體。因此，可根據(jù)此區(qū)域的高保守區(qū)段設(shè)計合成特異性的核酸分子探針，建立快速、準(zhǔn)確鑒定開心果性別的分子生物學(xué)方法。

4、一種用于鑒別開心果性別的引物對，其特征在于，w性別決定區(qū)域的檢測可以任意選擇引物對1和2其中一個，z性別決定區(qū)域的檢測選擇引物對3：

5、引物對1：(seq.w.1)

6、上游引物tgcccttttgtgttatttcttttatt，

7、下游引物agagtctatcaccgagcttcttctg；

8、引物對2：(seq.w.2)

9、上游引物atggaatatcaatatgaagattgcacg，

10、下游引物tcaaatgtcatgactttgttttgatatg；

11、引物對3(seq.z.1)：

12、上游引物aggattcctgataggttcattcggaa，

13、下游引物atcaccttcttccaaattattatccctcg。

14、本發(fā)明用于鑒別開心果性別的引物對是以開心果性別決定區(qū)(w區(qū)域和z區(qū)域)特征核苷酸序列為基礎(chǔ)的專一性核酸分子探針，利用primer3網(wǎng)頁工具設(shè)計得出。該分子探針具有高特異性和高專一性，能分別與開心果性別決定區(qū)域反應(yīng)，鑒定基因組中的w和z性別決定區(qū)域。

15、一種鑒定開心果果樹性別的方法，包括以下步驟：

16、(1)用葉片為材料提取開心果果樹樣本基因組dna；

17、(2)以步驟(1)基因組dna作為模板，使用如權(quán)利要求3所述引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

18、(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr步驟(2)產(chǎn)物，seq.w.1或seq.w.2將擴(kuò)增出749bp或428bp條帶，代表樣本具有w性別決定區(qū)段；seq.z.1將擴(kuò)增出1182bp條帶，代表樣本具有z性別決定區(qū)段。綜合兩個結(jié)果，可以判斷樣本為雌性(zw)或雄性(zz)。

19、采用pcr方法，利用seq.w.1、seq.w.2和seq.z.1引物，針對目的片段核苷酸序列w.marker.1、w.marker.1和z.marker.1，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。通過pcr方法可以快速、準(zhǔn)確地鑒別開心果性別，而且僅需少量葉片樣品。

20、為保證較高的pcr擴(kuò)增成功率，條件為：

21、94℃預(yù)變性6min；

22、35個循環(huán)反應(yīng)：94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸s；

23、72℃開心果7min；

24、4℃保存。

25、為提高開心果性別鑒定的準(zhǔn)確性，應(yīng)優(yōu)先選擇新鮮健康的開心果嫩葉片，避免病變、蟲蛀和葉脈部分。待檢測的開心果果樹可為幼苗、幼樹等，或未見花果的大樹。

26、本發(fā)明具有的有益效果：

27、本發(fā)明所提供的引物對為開心果性別專一性核酸分子探針，在樣品性別來源未知的情況下，可以通過檢測樣品基因組中是否存在探針對應(yīng)的目標(biāo)核苷酸序列，鑒定出其性別，為開心果性別鑒定提供了快速、準(zhǔn)確的方法，將有助于開心果的雜交品種早期鑒定和其他育種工作。

技術(shù)特征：

1.一種用于鑒別開心果性別的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記來源于開心果14號染色體的性別決定區(qū)的關(guān)鍵核苷酸序列，所述的核苷酸序列為w.marker.1，w.marker.2和z.marker.1所示。

2.如權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記在鑒別開心果性別中的應(yīng)用。

3.一種用于鑒別開心果性別的引物對，其特征在于，w區(qū)域鑒定使用引物對1和2，z區(qū)域鑒定使用引物對3：

4.如權(quán)利要求3所述引物對在鑒別開心果性別中的應(yīng)用。

5.一種鑒別開心果性別的方法，其特征在于，包括如下步驟：

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，pcr擴(kuò)增體系為：

7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，pcr擴(kuò)增條件為：

8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，待檢測的開心果樹為幼苗或未見花的樹，使用新鮮的葉片樣本進(jìn)行檢測。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種用于鑒別開心果性別的分子標(biāo)記、引物對和方法。所述分子標(biāo)記來源于開心果染色體的一段核苷酸序列。引物對Seq.W.1和Seq.W.2為開心果雌性(ZW)個體專一性核酸分子探針，而引物對Seq.Z.1為開心果雄性(ZZ)專一性陰性對照核酸分子探針。采用常規(guī)PCR方法，使用引物對進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在，可以判斷開心果植株的性別。本發(fā)明提供的引物對為開心果雄性個體專一性分子探針，僅需少量葉片樣品即可滿足鑒定需求；準(zhǔn)確、靈敏度高，若樣品能夠擴(kuò)增出2條指定長度的PCR擴(kuò)增帶，則判斷為雌性個體；若僅能擴(kuò)增出1條陰性PCR擴(kuò)增帶，則判斷為雄性個體；方法簡單，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，快捷高效。

技術(shù)研發(fā)人員：張博文,劉淏晟,白偉寧,辛國
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京師范大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9