本發(fā)明涉及一種補(bǔ)加表沒(méi)食子兒茶素增強(qiáng)ε-聚賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)方法，屬于發(fā)酵工程。

背景技術(shù)：

1、ε-聚賴氨酸(ε-poly-l-lysine，ε-pl)是通過(guò)ε-nh2與α-cooh連接縮合形成的一種新型生物聚合物，一般包含25-35個(gè)l-賴氨酸殘基，一般呈淡黃色粉末狀存在，略帶苦澀味，具有較強(qiáng)吸濕性，易溶于水，微溶于乙醇，具有良好的熱穩(wěn)定性，且ph適用范圍較廣(ph<9)。ε-pl分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特，具有許多優(yōu)良的性能，如良好抗菌性、熱穩(wěn)定性、可食用性、水溶性、生物降解性、對(duì)人類和環(huán)境無(wú)毒害性等。ε-pl還具有較廣的抑菌譜，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、酵母、霉菌、某些病毒和病原菌等都具有不同程度的抑制作用；同時(shí)，ε-pl對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌的最小抑菌濃度(mic)均低于100μg/ml，具有良好的抑菌效果。

2、基于ε-pl的上述優(yōu)點(diǎn)，ε-pl具有廣泛的潛在應(yīng)用前景。優(yōu)異的抗菌性能使ε-pl最早用于食品的防腐，目前，ε-pl已經(jīng)在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)被用作食品防腐添加劑。此外，ε-pl還可以應(yīng)用于抗菌材料、化妝品、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等行業(yè)。

3、白色鏈霉菌(streptomycesalbulus)是一種高好氧的微生物，ε-pl的生產(chǎn)主要就是是通過(guò)白色鏈霉菌的好氧發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由于野生型菌株生產(chǎn)ε-pl的能力較低，通常會(huì)對(duì)ε-pl的產(chǎn)生菌應(yīng)用傳統(tǒng)的物化誘變、核糖體工程、基因組重排、常壓室溫等離子體以及基因工程等方法，進(jìn)行ε-pl高產(chǎn)菌的選育。如日本學(xué)者h(yuǎn)iraki等最早于1998年采用抗性篩選結(jié)合誘變方法，選育出了一株誘變株，使ε-pl的產(chǎn)量較野生株提高了10倍。liu和wang等人則分別采用多次鏈霉素抗性選育，分別獲得了產(chǎn)量提高1.79倍和2.75倍的誘變菌株。

4、隨著對(duì)ε-pl合成途徑機(jī)理的深入解析，出現(xiàn)了越來(lái)越多利用基因工程方法改造白色鏈霉菌以提高其生產(chǎn)ε-pl能力的研究。如hamano等(2007年)從s.albulus中克隆了ask基因并進(jìn)行了突變，再在s.albulus中進(jìn)行同源表達(dá)，使改造后的工程菌能夠在一定程度上提高ε-pl的產(chǎn)量。隨后，汪澤等(2020年)在s.albulusm-z18中同源過(guò)表達(dá)pls基因，使其pls轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了16.8倍。wang等(2021年)采用kasop*啟動(dòng)子結(jié)合噬菌體衣殼蛋白的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)ε-pl合成酶基因(pls)進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，使ε-pl產(chǎn)量提高了88.2％。fumihito等(2023年)則對(duì)二氨基庚二酸(dap)途徑中的兩個(gè)基因dapb和dape進(jìn)行同源過(guò)表達(dá)，使所得工程菌株的ε-pl產(chǎn)量提高了14％。

5、但僅僅利用基因工程方法進(jìn)行工程菌的改造以提升ε-pl產(chǎn)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，因此，kahar等(2001年)建立了ε-pl發(fā)酵生產(chǎn)兩階段的ph調(diào)控方法，而建立和改進(jìn)ε-pl發(fā)酵工藝的研究也越來(lái)越多。如wang等(2018年)利用葡萄糖和甘油為混合碳源，采用改進(jìn)的“ph沖擊”和優(yōu)化供氧的方法，獲得了70.3g/l的ε-pl產(chǎn)量。liu等(2021年)采用了細(xì)胞固定化結(jié)合原位分離技術(shù)(ispr)，在分批發(fā)酵中使ε-pl產(chǎn)量提升至3.51g/l。zeng等(2022年)則利用灰霉病菌(botrytis?cinerea)提取物誘變白色鏈霉菌，最終使ε-pl產(chǎn)量提高了1.34倍。最近，zhu等人(2024年)構(gòu)建了過(guò)表達(dá)l-賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因lysp和ε-pl聚合酶基因pls工程菌株，在補(bǔ)料分批發(fā)酵中補(bǔ)加外源l-賴氨酸條件下，得到了目前的最高產(chǎn)量81.4±5.2g/l。

6、專利cn116751822a中提供了一種添加茶多酚促進(jìn)聚賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的方法，它按照添加茶多酚濃度在0.5-2.5g/l范圍進(jìn)行分批發(fā)酵，能有效生產(chǎn)ε-pl，ε-pl產(chǎn)量和菌體濃度分別達(dá)到了43.4g/l和42.0g/l，產(chǎn)物產(chǎn)率達(dá)到了5.21g/(l·d)；但其ε-pl發(fā)酵生產(chǎn)成本仍然偏高，因此，本領(lǐng)域亟需一種提高ε-pl生產(chǎn)效率、降低其生產(chǎn)成本的發(fā)酵方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種補(bǔ)加表沒(méi)食子兒茶素(egc)增強(qiáng)ε-聚賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)方法。表沒(méi)食子兒茶素(epigallocatechin，egc)是一種有機(jī)多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗過(guò)敏和抗糖尿病等多種生理活性。研究表明，這類多酚化合物具有強(qiáng)大的抗氧化能力，能有效清除細(xì)胞內(nèi)的自由基，從而發(fā)揮保護(hù)作用，這對(duì)于維護(hù)人體健康和細(xì)胞正常生理代謝具有重要意義。而表沒(méi)食子兒茶素對(duì)白色鏈霉菌的生理代謝和ε-pl生物合成有何影響，目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

2、因此本發(fā)明通過(guò)在ε-聚賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵過(guò)程中添加一定濃度的表沒(méi)食子兒茶素成分，利用白色鏈霉菌進(jìn)行分批或補(bǔ)料分批發(fā)酵，有效提高了ε-聚賴氨酸產(chǎn)量并降低了其生產(chǎn)成本，一定程度上縮短了ε-聚賴氨酸的發(fā)酵時(shí)間，同時(shí)本發(fā)明探究了表沒(méi)食子兒茶素對(duì)生產(chǎn)菌生理生化機(jī)制的影響。

3、為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種補(bǔ)加表沒(méi)食子兒茶素增強(qiáng)ε-聚賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)方法，具體方案如下：

4、本發(fā)明發(fā)酵方法使用的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了0.4～2.0g/l的表沒(méi)食子兒茶素。

5、進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括葡萄糖30～50g/l，酵母粉2～6g/l，硫酸銨6～10g/l，硫酸鎂0.2～0.6g/l，磷酸氫二鉀0.5～0.9g/l，磷酸二氫鉀1.0～1.50g/l，硫酸亞鐵0.015～0.035g/l和硫酸鋅0.02～0.05g/l。

6、進(jìn)一步地，ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)菌株為白色鏈霉菌、吸水鏈霉菌、禾粟鏈霉菌、稠李鏈霉菌或灰褐鏈霉菌。

7、進(jìn)一步地，所述發(fā)酵的過(guò)程是將所述生產(chǎn)菌株按照4-12％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為26-33℃，轉(zhuǎn)速為130-490rpm，溶氧為10-30％條件下進(jìn)行發(fā)酵。

8、進(jìn)一步地，所述的發(fā)酵為分批發(fā)酵或補(bǔ)料分批發(fā)酵。

9、進(jìn)一步地，分批發(fā)酵時(shí)，包括如下步驟：當(dāng)ph從初始的6.5～7.6自然下降至3.6-4.0，通過(guò)流加ph調(diào)節(jié)劑維持ph在3.6-4.0直至分批發(fā)酵結(jié)束。

10、進(jìn)一步地，補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)，包括采用如下步驟進(jìn)行ph調(diào)控：當(dāng)ph從初始的6.5～7.6自然下降到4.5-5.6，流加ph調(diào)節(jié)劑將ph在4.5-5.6維持6-10h；然后，待ph自然下降至3.4-3.9，流加ph調(diào)節(jié)劑維持ph在3.4-3.9直至補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)束。

11、進(jìn)一步地，補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)，包括如下步驟：當(dāng)發(fā)酵液中殘留的葡萄糖濃度降為8.0g/l以下時(shí)，流加葡萄糖溶液使發(fā)酵液中葡萄糖濃度控制在7～11g/l，并流加氮源溶液使發(fā)酵液中氨基氮濃度維持在0.5～1.0g/l；并在發(fā)酵的72～160h之間，流加表沒(méi)食子兒茶素溶液維持發(fā)酵液中表沒(méi)食子兒茶素濃度為0.4～2.0g/l。

12、進(jìn)一步地，所述葡萄糖溶液的濃度為300～700g/l；所述氮源溶液為50～90g/l硫酸銨和70～100g/l酵母粉的混合氮源溶液，表沒(méi)食子兒茶素溶液的濃度為30～70g/l。

13、有益效果

14、(1)本發(fā)明通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加表沒(méi)食子兒茶素生產(chǎn)ε-聚賴氨酸，添加的表沒(méi)食子兒茶素價(jià)格較低，節(jié)約了成本。

15、(2)本發(fā)明發(fā)酵方法提高了ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量，在相同條件下，本發(fā)明添加的表沒(méi)食子兒茶素?fù)u瓶和罐分批發(fā)酵ε-聚賴氨酸的最高產(chǎn)量，比作為對(duì)照的對(duì)比例1提高了15.9％，比對(duì)比例4提高了35.227％；在補(bǔ)料分批發(fā)酵中，本發(fā)明ε-聚賴氨酸最高產(chǎn)量達(dá)42.8g/l，產(chǎn)率達(dá)到5.59g?l/d，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。

16、(3)本發(fā)明發(fā)酵方法簡(jiǎn)單可行，在補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中，獲得最高ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的發(fā)酵時(shí)間為184h，此時(shí)ε-聚賴氨酸最高產(chǎn)量達(dá)42.8g/l，ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)率達(dá)5.59g?l/d，這就在一定程度上縮短了發(fā)酵時(shí)間；同時(shí)，因本發(fā)明補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中達(dá)到最高產(chǎn)量的時(shí)間較早，在實(shí)際生產(chǎn)中，可以節(jié)省發(fā)酵過(guò)程設(shè)備(如發(fā)酵罐攪拌、氣體供應(yīng)、冷卻和加熱等)運(yùn)行所需的能耗，進(jìn)一步節(jié)約了成本。

17、(4)本發(fā)明發(fā)酵方法使用的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量較低，本發(fā)明的葡萄糖和酵母提取物的濃度分別為40g/l和4g/l，即本發(fā)明在原料上更具成本優(yōu)勢(shì)。

18、(6)本發(fā)明發(fā)酵方法對(duì)氧的需求量(溶氧)為10-30％，說(shuō)明在本發(fā)明發(fā)酵過(guò)程對(duì)攪拌速率和空氣流量的需求也相對(duì)較低，能耗也相應(yīng)降低。