本發(fā)明涉及了一種功能蛋白分子的構(gòu)建及結(jié)合金屬離子交聯(lián)、或底物酶促反應(yīng)交聯(lián)的應(yīng)用方法，尤其是涉及了一種利用表皮蛋白結(jié)合金屬離子交聯(lián)、或底物酶促反應(yīng)交聯(lián)，并利用這種體內(nèi)外聯(lián)合作用制造高性能復(fù)合絲的方法。
背景技術(shù)：
1、蠶絲纖維是人們最早利用、產(chǎn)量最大的天然絲材料，由于它具有吸濕性強、手感舒適及透氣性好等優(yōu)點，所以被譽為“纖維皇后”。傳統(tǒng)的蠶絲纖維主要應(yīng)用于紡織業(yè)，隨著加工技術(shù)的改進(jìn)和交叉學(xué)科的發(fā)展，目前已開發(fā)出許多功能性的絲纖維，拓展了應(yīng)用領(lǐng)域，如應(yīng)用于傷口愈合、生物傳感器、能量收集等。
2、但蠶絲的抗拉強度低于凱夫拉和尼龍，此外蠶絲作為紡織材料存在易褪色、易皺等缺陷，這些問題限制了蠶絲纖維的進(jìn)一步應(yīng)用與推廣。為了解決蠶絲纖維存在機械性能不足等問題，國內(nèi)外研究人員嘗試使用不同的方法來改良蠶絲品質(zhì)。主要方法包括物理化學(xué)法、添食法和基因操作法。
3、物理化學(xué)處理方式主要有熱處理、調(diào)整紡絲速度以及輻射處理等；添食法即將石墨烯、納米顆?；蚪饘僭氐炔牧咸砑釉谏Ｈ~或人工飼料中喂養(yǎng)家蠶或者直接注射到家蠶體內(nèi)，以此改良蠶絲纖維的性能；基因操作法是采用基因操控技術(shù)將外源基因，主要是蜘蛛絲基因?qū)爰倚Q，對家蠶進(jìn)行遺傳改造，培育新品種，獲得具有高性能的蠶絲材料。上述幾種改良方法，或者是依靠對蠶絲蛋白分子本身的處理改善蠶絲性能，或者是通過導(dǎo)入外源蛋白分子改善蠶絲性能，存在操作繁瑣、效果不佳的諸多問題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決背景技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于開發(fā)表皮蛋白與蠶絲蛋白間接或直接結(jié)合，在蠶體內(nèi)預(yù)先設(shè)置功能分子，并通過功能分子與金屬離子交聯(lián)、或與底物交聯(lián)的方法，建立體內(nèi)外聯(lián)合作用以開發(fā)新型高性能復(fù)合絲的方法。
2、本發(fā)明大幅度提升了蠶絲經(jīng)濟價值，開創(chuàng)蠶桑生產(chǎn)新局面，具有極大的經(jīng)濟效益和廣闊的應(yīng)用前景。
3、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下：
4、所述方法是先利用基因操作將外源基因?qū)爰倚Q基因組內(nèi)并培育成新轉(zhuǎn)基因家蠶品種，然后再在蠶體外針對家蠶分泌出的蠶絲物質(zhì)進(jìn)行選擇和理化處理，進(jìn)而改善蠶絲性能，生產(chǎn)性能優(yōu)異的復(fù)合絲。
5、所述方法具體是先利用轉(zhuǎn)基因或者基因編輯的基因操作技術(shù)將外源基因?qū)爰倚Q基因組或精準(zhǔn)同源整合到家蠶基因組特定位點，再培育獲得穩(wěn)定遺傳的新型家蠶品種，合成分泌復(fù)合絲蛋白，然后利用離子交聯(lián)方法或者底物酶促反應(yīng)方法對復(fù)合絲蛋白進(jìn)行理化處理以改變復(fù)合絲蛋白的性質(zhì)。
6、所述基因編輯包含talen或crispr。
7、所述外源基因是指家蠶表皮蛋白基因，具體為rr-1、rr-2、rr-3、cpg、cph或glycine-rich中的一種基因：
8、所述的家蠶表皮蛋白基因rr-1的基因序列和蛋白序列分別為seq?id?no.1和seqid?no.2；
9、所述的家蠶表皮蛋白基因rr-2的基因序列和蛋白序列分別為seq?id?no.3和seqid?no.4；
10、所述的家蠶表皮蛋白基因rr-3的基因序列和蛋白序列分別為seq?id?no.5和seqid?no.6；
11、所述的家蠶表皮蛋白基因cpg的基因序列和蛋白序列分別為seq?id?no.7和seqid?no.8；
12、所述的家蠶表皮蛋白基因cph的基因序列和蛋白序列分別為seq?id?no.9和seqid?no.10；
13、所述的家蠶表皮蛋白基因glycine-rich的基因序列和蛋白序列分別為seq?idno.11和seq?id?no.12。
14、所述基因操作是將家蠶表皮蛋白基因?qū)爰倚Q基因組中，或精準(zhǔn)同源整合到家蠶的絲素重鏈基因、絲素輕鏈基因、絲素p25基因、絲膠1基因中。
15、所述理化處理是將復(fù)合絲蛋白在體外進(jìn)一步處理，具體是復(fù)合絲蛋白在體外或在繅制過程中添加鋅金屬離子，使復(fù)合絲蛋白分子與鋅離子發(fā)生交聯(lián)，進(jìn)而改善復(fù)合絲性能，獲得提高了力學(xué)機械性能的復(fù)合絲。
16、所述理化處理是將復(fù)合絲蛋白在體外進(jìn)一步處理，具體是復(fù)合絲蛋白在體外或在繅制過程中添加底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，使復(fù)合絲蛋白發(fā)生交聯(lián)以改善復(fù)合絲性能，所述底物為n-乙酰多巴胺(nada)或n-β丙酰多巴胺(nbad)，所述酶為漆酶2。
17、本發(fā)明是利用轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)，結(jié)合體外理化處理，使家蠶生產(chǎn)制備力學(xué)機械性能優(yōu)良的復(fù)合絲的應(yīng)用。
18、更具體地，方法是先通過基因工程方法生物合成目的家蠶表皮蛋白基因序列作為外源基因，然后采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建外源基因載體，通過顯微注射將外源基因載體導(dǎo)入家蠶卵內(nèi)并整合到家蠶基因組內(nèi)，或精準(zhǔn)同源整合到家蠶的特定基因中，對家蠶進(jìn)行多代培育，通過熒光顯微鏡篩選獲得g1代陽性個體，g1代陽性個體分別與野生型交配或陽性個體自交得到g2代，g3代后均篩選陽性個體并采用陽性個體自交留種，到g8代育成穩(wěn)定遺傳的品種；
19、然后利用g8代的家蠶進(jìn)行生產(chǎn)分泌蠶絲，此蠶絲為復(fù)合絲蛋白，在蠶絲添加鋅離子使蠶絲蛋白分子與鋅離子發(fā)生交聯(lián)，或者與底物n-乙酰多巴胺(nada)或n-β丙酰多巴胺(nbad)混合，最后添加漆酶2催化，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，從而改善復(fù)合絲的性能。
20、所述的目的基因序列為所述的家蠶表皮蛋白對應(yīng)的基因堿基序列，最終獲得能夠穩(wěn)定遺傳的復(fù)合絲性能優(yōu)異的新型家蠶品種。
21、所述的陽性個體是指顯現(xiàn)熒光并且正確表達(dá)外源基因的個體。
22、所述的野生型是指未導(dǎo)入外源基因載體的家蠶卵培育成的個體。
23、所述的組蛋白分子對應(yīng)的外源基因載體是采用以piggybac為骨架的轉(zhuǎn)基因載體或者應(yīng)用于talen或crispr基因編輯的同源重組載體；
24、所述的外源基因載體包括外源基因表達(dá)框和熒光篩選標(biāo)記基因表達(dá)框；
25、外源基因表達(dá)框包括外源基因和表達(dá)框的啟動子，外源基因為權(quán)利要求2所述的家蠶表皮蛋白基因rr-1、rr-2、rr-3、cpg、cph或glycine-rich的蛋白序列對應(yīng)的基因堿基序列，外源基因表達(dá)框的啟動子采用絲素蛋白重鏈、絲素蛋白輕鏈、絲素蛋白p25或者絲膠蛋白等基因的啟動子；
26、熒光篩選標(biāo)記基因表達(dá)框包括熒光篩選標(biāo)記基因和表達(dá)框的啟動子，熒光篩選標(biāo)記基因采用綠色熒光蛋白基因(gfp)或者紅色熒光蛋白基因(dsred)，熒光篩選標(biāo)記基因表達(dá)框的啟動子采用ie-1、a3或者3xp3啟動子。
27、所述的復(fù)合絲蛋白的組成包含了家蠶表皮蛋白基因rr-1、rr-2、rr-3、cpg、cph或glycine-rich中的1個基因構(gòu)成的蛋白分子成分和蠶絲蛋白成分，本發(fā)明采用基因操作結(jié)合理化處理的體內(nèi)外聯(lián)合作用，增強了復(fù)合絲的力學(xué)機械性能。
28、隨著測序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了大量的表皮蛋白基因序列。根據(jù)表皮蛋白的氨基酸基序(motif)特征，可以分成若干蛋白家族。大多數(shù)的表皮蛋白含有r&r保守基序，而r&r基序的表皮蛋白還可以進(jìn)一步細(xì)分為3個亞家族：rr-1,rr-2和rr-3。
29、家蠶表皮蛋白基因在染色體上大多以串聯(lián)集群形式分布，2008年的研究推測在家蠶基因組中一共有220個的表皮蛋白基因，甚至可能有247個表皮蛋白基因，根據(jù)其基序特征可以被分為8個家族，屬于rr-2亞家族的表皮蛋白數(shù)量最多。
30、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，由rr-1、rr-2、rr-3、cpg、cph或glycine-rich表皮蛋白構(gòu)成的重組絲，并經(jīng)結(jié)合理化處理的復(fù)合絲應(yīng)力性能、應(yīng)變性能、耐磨性能、抗皺性能顯著提高，可以開發(fā)新型復(fù)合絲，拓展蠶絲新用途。
31、本發(fā)明是創(chuàng)造性地將表皮蛋白與蠶絲構(gòu)建復(fù)合絲，再經(jīng)過理化處理獲得了能夠提高家蠶復(fù)合絲力學(xué)機械性能的蛋白序列。
32、本發(fā)明具有的有益效果是：
33、本發(fā)明開發(fā)了一種蠶絲蛋白人工設(shè)計、合成功能基因及其提高家蠶復(fù)合絲力學(xué)機械性能的方法，并開發(fā)了多種基因的新功能，利用這種基因獲得了復(fù)合絲再經(jīng)理化處理復(fù)合絲力學(xué)性能顯著增強，這種發(fā)明能極大的改良蠶絲品質(zhì)，創(chuàng)造很好的經(jīng)濟效益。