本發(fā)明涉及微生物固化，具體的說是一種結構穩(wěn)定、工藝簡便，能夠克服現(xiàn)有包埋微生物制劑存在的微生物逸出的問題的具有核殼結構的微生物包埋制劑制備方法。

背景技術：

1、全球絕大多數(shù)細菌仍處于未培養(yǎng)狀態(tài)，目前已發(fā)表細菌的物種數(shù)不超過全球總量的0.2%。而未培養(yǎng)類群在全球碳、氮、硫及其它元素循環(huán)，合成新穎的天然活性產(chǎn)物，以及對其周圍生物和環(huán)境都起著至關重要的作用。雖然分子技術可以提供大量未培養(yǎng)微生物的功能預測信息，但想要確切地了解和研究其特定代謝途徑、基因功能及其生態(tài)學意義，就需要獲得其純培養(yǎng)菌株。目前微生物未培養(yǎng)的關鍵因素之一為無法在實驗室條件下模擬細胞間的共生或寄生關系，及其相互作用所分泌的各種信號分子，可利用底物，代謝產(chǎn)物及其中間體、小分子化合物和酶等。而緩解該問題的共培養(yǎng)分離培養(yǎng)方法則發(fā)展緩慢，且現(xiàn)有的共培養(yǎng)方法中仍存在很多弊端。因此，亟需開發(fā)新型的共培養(yǎng)技術來減輕未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)障礙。

2、通過夾心平板法可以設計兩種不相互接觸的共生菌株的純培養(yǎng)方法，但該方法無法應用于海洋微生物的富集培養(yǎng)過程。

3、現(xiàn)階段微生物固定化技術已運用到環(huán)境治理領域，例如采用物理化學方法將微生物固定在載體上，制備成生物膜用于處理污水中的有機物。包埋技術是利用載體將固體、液體或氣體包埋形成微囊的方法，是一種常用的細胞固定化技術。包埋法是將微生物細胞限制在非不溶性的約束結構（聚合物網(wǎng)格結構）之中，同時也能夠讓基質(zhì)進行擴散和滲透，該法操作簡單，且對微生物細胞活性幾乎沒有破壞，整個細胞均可在聚合物網(wǎng)格之中生長和凋亡，同時疏松的結構可以保證底物滲入和產(chǎn)物擴散。將微生物包埋到微膠囊用于環(huán)境治理，不僅可以實現(xiàn)多種功能性微生物的環(huán)境治理能力，還能實現(xiàn)分工合作，減少競爭帶來的影響。

4、目前常用的包埋載體主要有如瓊脂、海藻酸鈉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等有機載體。理想的包埋載體應具有對微生物細胞無毒，傳質(zhì)性能好，不易被微生物分解，強度高，可長期使用且成本較低等特點。目前采用的包埋技術，通常直接將微生物與包埋材料混合，制備的微膠囊存在微生物逸出等問題。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中存在的缺點和不足，提出了一種結構新穎且制備技術可控，能夠完全避免微生物暴露引起的二次污染，充分發(fā)揮功能微生物作用的具有核殼結構的微生物包埋制劑制備方法及其應用。

2、本發(fā)明通過以下措施達到：

3、一種具有核殼結構的微生物包埋制劑制備方法，其特征在于，分別制備包埋載體、核液，將制好的核液與包埋載體分別經(jīng)蠕動泵泵入同軸針頭裝置，通過同軸針頭裝置滴入滅菌的鈣鹽溶液中，保持對滅菌的鈣鹽溶液磁力攪拌，并反應0.5~24h，得到菌株球；其中，所述制備包埋載體具體為：將海藻酸鹽加去離子水溶解，水浴或油浴加熱并磁力攪拌，得溶膠體系，所述海藻酸鹽水溶膠的質(zhì)量分數(shù)為1.5%~5%；水浴或油浴溫度為30℃~100℃，時間為0.5~10h，滅菌，獲得海藻酸鹽溶膠；

4、所述制備核液具體為：在超凈臺中，取已滅菌的海藻酸鹽溶膠，加入設定菌株及菌株生長必備的特異性營養(yǎng)物質(zhì)，加入粒徑小于100nm的碳顆粒，攪拌均勻，碳顆粒與海藻酸鈉的質(zhì)量比為1/100~1，碳顆粒為無孔碳納米顆?；蛱技{米纖維或、石墨粉或石墨烯或碳納米管或多孔碳納米顆粒。

5、本發(fā)明中鈣鹽溶液為鈣鹽溶解于去離子水中制成，質(zhì)量分數(shù)為0.01~0.5?mol/l，鈣鹽為氯化鈣、硝酸鈣、硫酸鈣，進一步，鈣鹽水溶液的濃度優(yōu)選為0.1~0.4?mol/l。

6、本發(fā)明中所述海藻酸鹽為海藻酸鈉、海藻酸鉀或其他海藻酸鹽及其混合物，海藻酸鹽溶膠的質(zhì)量分數(shù)優(yōu)選為2%~4%，水或油浴溫度優(yōu)選為50℃~70℃，時間優(yōu)選為2~6h，這是由于海藻酸鹽的濃度過低粘度太小不易成型，粘度太高配制及成型困難，溫度過高會使海藻酸鹽變質(zhì)。

7、本發(fā)明中利用制好的核液和包埋載體來制備菌株球的反應時間優(yōu)選為1~10h，通過同軸針頭裝置滴入鈣鹽溶液的速度優(yōu)選為0.5-1滴/s，過快會導致球形不好，過慢影響微生物的活性。

8、本發(fā)明將含有菌株d737t的菌懸液及大腸桿菌dh5α提取的核酸片段與含0.1%vgcf（碳納米纖維）的1.5%海藻酸鈉溶膠的混合液作為菌株球的核液，將3%海藻酸鈉溶膠作為殼液，通過蠕動泵將殼液與芯液同時泵入同軸針頭中，在針頭處匯合并滴入0.1mol/l的氯化鈣溶液中，在4℃的條件下反應4h后，獲得菌株球。

9、本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，采用一步成型的方法，制備核殼結構的微生物包埋菌劑，結構新穎且制備技術可控，核殼結構能夠完全避免微生物暴露引起的二次污染，發(fā)揮功能微生物的作用，具體地說，通過本發(fā)明能夠?qū)⒉煌δ艿奈⑸锇窬鷦┗旌?，可發(fā)揮多種功能并因微生物之間沒有接觸而避免種間競爭造成功能微生物死亡等問題，此外，根據(jù)功能微生物的特點及需求，調(diào)節(jié)核液的濃度及菌劑含量，制備特異性核溶膠，添加必要的營養(yǎng)物質(zhì)及支撐材料提高結構的機械強度，為后續(xù)根據(jù)微生態(tài)制劑的使用環(huán)境，制備特異性的殼溶膠，并通過一步成型法將其制備成微生態(tài)制劑，以在環(huán)境治理中發(fā)揮有效作用提供支撐。

技術特征：

1.一種具有核殼結構的微生物包埋制劑制備方法，其特征在于，分別制備包埋載體、核液，將制好的核液與包埋載體分別經(jīng)蠕動泵泵入同軸針頭裝置，通過同軸針頭裝置，滴入滅菌的鈣鹽溶液中，保持對滅菌的鈣鹽溶液磁力攪拌，并反應0.5~24h，得到菌株球；其中，所述制備包埋載體具體為：將海藻酸鹽加去離子水溶解，水浴或油浴加熱并磁力攪拌，得溶膠體系，所述海藻酸鹽水溶膠的質(zhì)量分數(shù)為1.5%~5%；水浴或油浴溫度為30℃~100℃，時間為0.5~10h，滅菌，獲得海藻酸鹽溶膠；

2.根據(jù)權利要求1所述的具有核殼結構的微生物包埋制劑制備方法，其特征在于，鈣鹽溶液為鈣鹽溶解于去離子水中制成，質(zhì)量分數(shù)為0.01~0.5?mol/l，鈣鹽為氯化鈣、硝酸鈣、硫酸鈣。

3.根據(jù)權利要求2所述的具有核殼結構的微生物包埋制劑制備方法，其特征在于，鈣鹽水溶液的濃度為0.1~0.4?mol/l。

4.根據(jù)權利要求1所述的具有核殼結構的微生物包埋制劑制備方法，其特征在于，所述海藻酸鹽為海藻酸鈉、海藻酸鉀或其他海藻酸鹽及其混合物，海藻酸鹽溶膠的質(zhì)量分數(shù)為2%~4%，水或油浴溫度為50℃~70℃，時間為2~6h。

5.根據(jù)權利要求1所述的具有核殼結構的微生物包埋制劑制備方法，其特征在于，利用制好的核液和包埋載體來制備菌株球的反應時間為1~10h，通過同軸針頭裝置滴入鈣鹽溶液的速度為0.5-1滴/s。

6.根據(jù)權利要求1所述的具有核殼結構的微生物包埋制劑制備方法，其特征在于，將含有菌株d737t的菌懸液及大腸dh5α提取的dna與含0.1%碳納米纖維vgcf的1.5%海藻酸鈉溶膠的混合液作為菌株球的核液，將3%海藻酸鈉溶膠作為殼液，通過蠕動泵將殼液與芯液同時泵入同軸針頭中，在針頭處匯合并滴入0.1mol/l的氯化鈣溶液中，在4℃的條件下反應4h后，獲得菌株球。

技術總結
本發(fā)明涉及微生物固化技術領域，具體的說是一種結構穩(wěn)定、工藝簡便，能夠克服現(xiàn)有包埋微生物制劑存在的微生物逸出的問題的具有核殼結構的微生物包埋制劑制備方法,其特征在于，分別制備包埋載體、核液，將制好的核液與包埋載體分別經(jīng)蠕動泵泵入同軸針頭裝置，通過同軸針頭裝置滴入滅菌的鈣鹽溶液中，保持對滅菌的鈣鹽溶液磁力攪拌，并反應0.5~24h，得到菌株球；其中，所述制備包埋載體具體為：將海藻酸鹽加去離子水溶解，水浴或油浴加熱并磁力攪拌，得溶膠體系，所述海藻酸鹽水溶膠的質(zhì)量分數(shù)為1.5%~5%；水浴或油浴溫度為30℃~100℃，時間為0.5~10h，滅菌，獲得海藻酸鹽溶膠。

技術研發(fā)人員：穆大帥,孫春水,迂文星
受保護的技術使用者：山東大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/9