本發(fā)明涉及基因工程，具體涉及一種嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體d180s及其用途。

背景技術(shù)：

1、幾丁質(zhì)又可以叫殼多糖、甲殼素、甲殼質(zhì)、聚乙酰氨基葡糖，由n-乙酰-d-氨基葡萄糖(n-acetyl-d-glucosamine)通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成，其廣泛存在于海洋甲殼動(dòng)物外殼、軟體動(dòng)物內(nèi)骨骼、昆蟲翅膀、及藻類細(xì)胞壁內(nèi)。幾丁質(zhì)是一類重要的多糖，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，在自然界中的儲(chǔ)存量巨大，屬于第二大類天然高分子化合物，僅次于纖維素。

2、β-n-乙酰-d-氨基葡萄糖苷酶(glcnacases，β-n-acetyl-d-glucosaminidases，ec3.2.1.52)能夠水解含n-乙酰氨基葡萄糖的低聚糖和蛋白質(zhì)(zhang?et?al.applmicrobiol?biot,2018,102(1):93–103)。內(nèi)切幾丁質(zhì)酶將幾丁質(zhì)水解生成殼寡糖，β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶可進(jìn)一步水解殼寡糖生成n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)。glcnac可應(yīng)用于功能性食品、能源及化妝品等領(lǐng)域。

3、β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶在低溫環(huán)境下活性較低，極大地限制了它的使用。嗜冷酶在0℃仍有活性，能在低溫要求的生物技術(shù)領(lǐng)域表現(xiàn)出強(qiáng)活性，同時(shí)能提高溫度以溫和的條件使酶失活而控制工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程；嗜鹽酶可應(yīng)用于海產(chǎn)品加工等領(lǐng)域，在高鹽環(huán)境下加工食品還可以防止微生物的污染、節(jié)省滅菌等所消耗的能源，其受鹽激活的特點(diǎn)也有利于通過(guò)調(diào)整鹽濃度來(lái)控制催化反應(yīng)。因此，開發(fā)出一種耐鹽嗜鹽的β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶有利于其在食品加工、釀造、洗滌、造紙、污水處理、環(huán)境污染等行業(yè)中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體，具有更低的最適溫度，為能更好的應(yīng)用于低溫含鹽環(huán)境要求下的生物技術(shù)領(lǐng)域中。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體d180s，該突變體d180s的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，該突變體d180s在0℃有78.41％的酶活，其活性可以被鹵素鹽和nano3激活。本發(fā)明提供的突變體d180s可被應(yīng)用與低溫含鹽環(huán)境要求下的生物技術(shù)領(lǐng)域中，包含洗滌、造紙或污水處理等行業(yè)，還可用于釀造等食品行業(yè)。

3、本發(fā)明還提供了上述突變體d180s的編碼基因，該編碼基因的核苷酸序列如seqid?no.2所示。

4、本發(fā)明還提供了一種包含上述編碼基因的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒選自pet系列的載體，優(yōu)選pet-22b(+)。

5、本發(fā)明還提供了一種包含上述編碼基因的重組菌，該重組菌選自大腸桿菌，優(yōu)選自bl21(de3)。

6、本發(fā)明提供的嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體d180s，解決了野生β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶低溫活性差以及加鹽調(diào)控活性不敏感的問(wèn)題，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

7、本發(fā)明提供的突變體d180s與重組野生β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶opt-hj5nagnc相比，突變體d180s的熱活性以及在不同濃度鹵素鹽和nano3中的活性發(fā)生了改變。突變體d180s最適溫度為5℃，在低溫條件下活性提高，此外，鹵素鹽和nano3對(duì)該酶的酶活有激活作用。純化的重組野生酶opt-hj5nagnc的最適溫度為45℃，在0℃僅有2.3％的酶活；突變體d180s的最適溫度為5℃，在0℃還有78.41％的酶活。在終濃度為0.1-3.5mnacl、nabr、nano3和0.1-1m?nai中分別進(jìn)行酶促反應(yīng)，重組野生酶opt-hj5nagnc的活性均受到不同程度的抑制，d180s的活性被不同程度地激活，其中nacl和nabr對(duì)d180s的激活作用最明顯：在不含鹽的體系中，d180s的比活力約為2.26u/mg，在終濃度為1.5m的nacl中，d180s的比活力最高，活性提高約234倍；在終濃度為0.5m的nabr體系中，d180s的比活力最高，活性提高約232倍；在終濃度為0.7m?nano3中，d180s的比活力最高，活性提高約66倍；在終濃度為0.3m?nai中，d180s的比活力最高，活性提高約29倍。此外，在終濃度為0.4m的naf體系中，d180s的比活力最高，活性提高約44倍。本發(fā)明中所測(cè)的5種陰離子對(duì)d180s的激活作用大小為cl->br->no3->f->i-。

8、本發(fā)明提供的突變體d180s可應(yīng)用于低溫含鹽環(huán)境要求下的生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其可應(yīng)用于食品、釀造、洗滌、造紙、污水處理等行業(yè)，應(yīng)用價(jià)值顯著。在食品行業(yè)，嗜鹽酶可應(yīng)用于海產(chǎn)品加工、泡菜和醬汁制作以及咸味食品中，另外工業(yè)上還用嗜鹽酯酶和脂肪酶合成不飽和脂肪酸和短鏈脂肪酸作為膳食補(bǔ)充劑；在釀造行業(yè)，嗜鹽酶可應(yīng)用于高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵，發(fā)酵出來(lái)的醬油顏色好、風(fēng)味突出、鮮香味足；在洗滌行業(yè)，nacl是洗滌劑的一種成分，應(yīng)用在洗滌劑中的酶能在含鹽條件下保持活性才能發(fā)揮作用，來(lái)源于aspergillusniger?mh079049.1的嗜鹽脂肪酶已經(jīng)被用到洗滌劑配方中(alabdalallah?etal.scientific?reports,2021,11(1):19670)；在污水處理行業(yè)，nacl是高鹽污水尤其是高鹽食品加工廢水中的主要無(wú)機(jī)鹽，在高鹽污水中添加嗜鹽酶，可以提高污水的生物處理效率。

技術(shù)特征：

1.一種嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體d180s，其特征在于，該突變體d180s的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，該突變體d180s在0℃有78.41％的酶活，其活性可以被鹵素鹽和nano3激活。

2.如權(quán)利要求1所述嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體d180s的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3.包含如權(quán)利要求2所述編碼基因的重組質(zhì)粒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒選自pet-22b(+)。

5.包含如權(quán)利要求2所述編碼基因的重組菌。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組菌，其特征在于，所述的重組菌選自大腸桿菌bl21(de3)。

7.如權(quán)利要求1所述嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體d180s在低溫含鹽環(huán)境要求下的生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的生物技術(shù)領(lǐng)域包含食品、洗滌、造紙或污水處理行業(yè)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的食品行業(yè)包含釀造。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種嗜冷的鹽激活β?N?乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體D180S及其應(yīng)用，涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。該突變體D180S的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，該突變體D180S的最適pH為6.0，最適溫度為5℃，與氨基酸序列如SEQ?ID?NO.5所示的重組野生β?N?乙酰氨基葡萄糖苷酶相比，最適溫度下降了40℃。重組野生β?N?乙酰氨基葡萄糖苷酶opt?HJ5NagNC隨反應(yīng)體系中鹽濃度升高而酶活降低，而NaCl、NaBr、NaI、NaF和NaNO<subgt;3</subgt;均能不同程度的激活D180S的活性，該突變體可應(yīng)用于低溫含鹽環(huán)境要求下的生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其可應(yīng)用于食品、釀造、洗滌、造紙、污水處理等行業(yè)。

技術(shù)研發(fā)人員：張蕊,寧娟,周峻沛,黃遵錫,吳倩,楊樂(lè)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：云南師范大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6