本申請涉及分子生物學，特別是涉及一種用于單基因遺傳病相關基因檢測的文庫構建方法、核酸產品及試劑盒。

背景技術：

1、單基因遺傳病是指由某種特定基因的突變引起的疾病。這些基因突變可以遺傳給后代，導致患上相同的疾病或癥狀。單基因遺傳病可根據(jù)遺傳模式細分為常染色體顯性遺傳，如軟骨發(fā)育不全；常染色體隱性遺傳，如耳聾；x連鎖顯性遺傳病、如x連鎖智力障礙；x連鎖隱性遺傳病，如杜氏肌營養(yǎng)不良癥；y連鎖遺傳病，如無精子癥。目前已知單基因病有9000多種，其綜合發(fā)病率高于1/100，多數(shù)單基因病致畸、致殘、致死，僅5％有有效藥物，且費用昂貴。

2、目前可用于單基因遺傳病檢測的技術有sanger測序、毛細管電泳和高通量測序。其中，sanger測序的通量有限，適合檢測已知基因的變異，常作為致病基因或致病位點明確的單基因遺傳病的檢測手段或作為高通量測序的驗證技術；毛細管電泳主要針對已明確由短串聯(lián)重復序列數(shù)目異常引起的單基因遺傳??；而高通量測序對目標區(qū)域或基因靶向檢測主要采取的方式是：雜交捕獲(液相和固相)和多重pcr。雜交捕獲能夠對更大的目標區(qū)域進行捕獲，基于探針的雜交捕獲技術較容易對探針進行優(yōu)化，從而獲得較好的均一性，對多種變異類型具有較好的兼容性，因此基于探針的雜交捕獲技術適用于較大的基因panel，液相雜交捕獲測序可適用于幾kb到上百mb的基因組目標區(qū)域的檢測，可檢測snv，indel，cnv等變異。但是液相捕獲存在實驗操作繁瑣、檢測周期長、gc/at高含量區(qū)覆蓋度低等問題，而且針對單一疾病或幾個基因的檢測相對而言成本較高；且基于液相雜交捕獲的wes檢測，檢測主要集中在編碼區(qū)以及剪切區(qū)。而采用多重pcr都是短擴增子引物，針對多個基因全覆蓋檢測需要成百上千對擴增引物，且隨著檢測基因或位點越多panel引物設計難度大，合成費用較高，與此同時，其存在交叉擴增、引物二聚體、競爭性擴增以及擴增不均一等問題，同時受到gc/at含量的影響。

3、因此，亟需一種能對單基因遺傳病相關基因突變進行高效準確檢出的相關技術和產品。

技術實現(xiàn)思路

1、基于此，本申請?zhí)峁┝艘环N用于單基因遺傳病相關基因檢測的文庫構建方法、核酸產品及試劑盒，可用于同時檢測多種單基因遺傳病，且具有高靈敏度、高通量、低成本。

2、根據(jù)本申請第一方面，提供了一種用于檢測單基因遺傳病相關基因突變的核酸產品，包括用于擴增atp7b基因的長鏈pcr引物、用于擴增g6pd基因的長鏈pcr引物、用于擴增hbb基因的長鏈pcr引物、用于擴增pah基因的長鏈pcr引物、用于擴增mmachc基因的長鏈pcr引物、用于擴增slc26a4基因的長鏈pcr引物和用于擴增gjb2基因的長鏈pcr引物中的至少一種。

3、在其中一個實施例中，所述用于擴增atp7b基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:1～10所示，所述用于擴增g6pd基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:11～14所示，所述用于擴增hbb基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:15～16所示，所述用于擴增pah基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:17～28所示，所述用于擴增mmachc基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:29～32所示，所述用于擴增slc26a4基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:33～42所示，所述用于擴增gjb2基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:43～44所示。

4、本申請的第二方面提供了上述的核酸產品在制備單基因遺傳病的檢測試劑盒中的應用。

5、本申請的第三方面提供了一種用于檢測單基因遺傳病的試劑盒，所述試劑盒包括上述的核酸產品。

6、在其中一個實施例中，所述試劑盒還包括pcr反應試劑。

7、在其中一個實施例中，所述pcr反應試劑包括pcr緩沖液、dna聚合酶、鎂離子和dntps中的一種或多種。

8、在其中一個實施例中，所述試劑盒還包括dna提取試劑。

9、本申請的第四方面提供了一種用于單基因遺傳病相關基因檢測的文庫構建方法，包括以下步驟：

10、提取待測生物樣本的基因組dna；

11、以所述基因組dna為模板，采用上述的核酸產品進行pcr擴增，得到第一擴增產物；

12、以所述第一擴增產物為模板，進行第二pcr擴增，制得第二擴增產物；以及

13、根據(jù)所述第二擴增產物構建所述用于檢測單基因遺傳病相關基因檢測的文庫；

14、所述第二pcr擴增所用的引物包括通用引物和特異性引物中的至少一種。

15、在其中一個實施例中，制得第二擴增產物后，對所述第二擴增產物進行純化，取純化后的產物進行質檢，取質檢通過的產物構建所述單基因遺傳病相關基因的基因文庫。

16、在其中一個實施例中，所述第一pcr擴增的條件包括：94℃～96℃反應1min～3min，96℃～98℃反應10s～30s，65℃～70℃反應1min～8min，循環(huán)30次～40次。

17、本申請同時對單基因遺傳病7個致病基因：atp7b、g6pd、hbb、pah、mmachc、slc26a4和gjb2基因進行捕獲建庫。本申請用于檢測單基因遺傳病相關基因突變的核酸產品可以和atp7b基因、g6pd基因、hbb基因、pah基因、mmachc基因、slc26a4基因和gjb2基因靶核酸序列更特異性、更靈敏、更準確的結合，既可以檢測cds區(qū)和剪切區(qū)相關變異，也可以檢測深度內含子區(qū)和utr區(qū)相關變異，還可以進行包含在擴增子里面外顯子的缺失檢測，同時也大幅降低了引物間交叉擴增、配對、競爭性擴增以及擴增不均一等問題，更好地解決高gc/at區(qū)域富集的問題。

18、利用pcr反應在待測dna片段兩端加上接頭的方法，采用兩輪pcr反應成功構建單基因遺傳病相關基因檢測的文庫，具有文庫構建周期短，比對率高，均一性好，重復性好，操作簡便等優(yōu)點，可以為臨床醫(yī)生綜合評估受檢者的患病風險、定制個性化醫(yī)療和生活干預措施，以期顯著降低單基因遺傳病的風險提供指導。

技術特征：

1.一種用于檢測單基因遺傳病相關基因突變的核酸產品，其特征在于，包括用于擴增atp7b基因的長鏈pcr引物、用于擴增g6pd基因的長鏈pcr引物、用于擴增hbb基因的長鏈pcr引物、用于擴增pah基因的長鏈pcr引物、用于擴增mmachc基因的長鏈pcr引物、用于擴增slc26a4基因的長鏈pcr引物和用于擴增gjb2基因的長鏈pcr引物中的至少一種。

2.根據(jù)權利要求1所述的用于檢測單基因遺傳病相關基因突變的核酸產品，其特征在于，所述用于擴增atp7b基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:1～10所示，所述用于擴增g6pd基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:11～14所示，所述用于擴增hbb基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:15～16所示，所述用于擴增pah基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:17～28所示，所述用于擴增mmachc基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:29～32所示，所述用于擴增slc26a4基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:33～42所示，所述用于擴增gjb2基因的長鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:43～44所示。

3.權利要求1或2所述的核酸產品在制備單基因遺傳病的檢測試劑盒中的應用。

4.一種用于檢測單基因遺傳病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1～2任一項所述的核酸產品。

5.根據(jù)權利要求4所述的用于檢測單基因遺傳病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括pcr反應試劑。

6.根據(jù)權利要求5所述的用于檢測單基因遺傳病的試劑盒，其特征在于，所述pcr反應試劑包括pcr緩沖液、dna聚合酶、鎂離子和dntps中的一種或多種。

7.根據(jù)權利要求4～6任一項所述的用于檢測單基因遺傳病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dna提取試劑。

8.一種用于單基因遺傳病相關基因檢測的文庫構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

9.根據(jù)權利要求8所述的文庫構建方法，其特征在于，制得第二擴增產物后，對所述第二擴增產物進行純化，取純化后的產物進行質檢，取質檢通過的產物構建所述單基因遺傳病相關基因的基因文庫。

10.根據(jù)權利要求8～9任一項所述的文庫構建方法，其特征在于，所述第一pcr擴增的條件包括：94℃～96℃反應1min～3min，96℃～98℃反應10s～30s，65℃～70℃反應1min～8min，循環(huán)30次～40次。

技術總結
本申請?zhí)峁┝艘环N用于單基因遺傳病相關基因檢測的文庫構建方法、核酸產品及試劑盒，包括用于擴增ATP7B基因的長鏈PCR引物、用于擴增G6PD基因的長鏈PCR引物、用于擴增HBB基因的長鏈PCR引物、用于擴增PAH基因的長鏈PCR引物、用于擴增MMACHC基因的長鏈PCR引物、用于擴增SLC26A4基因的長鏈PCR引物和用于擴增GJB2基因的長鏈PCR引物中的至少一種。本申請用于檢測單基因遺傳病相關基因突變的核酸產品可以和ATP7B、G6PD、HBB、PAH、MMACHC、SLC26A4和GJB2基因靶核酸序列更特異性、更靈敏、更準確的結合，更好地解決高GC/AT區(qū)域富集的問題。

技術研發(fā)人員：張向東,趙亞涵,汪利,胡琴,楊祖
受保護的技術使用者：蘇州貝康醫(yī)學檢驗實驗室有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/6