本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物，尤其是一種尖孢鐮孢菌雙靶標(biāo)快速可視化原位檢測試劑盒、檢測方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、尖孢鐮孢菌(fusarium?oxysporum)是一種具有廣泛宿主范圍和高度致病性的土傳病原真菌，被列為世界十大植物病原真菌之一。該菌能夠侵染棉花、大豆、西瓜、香蕉、番茄和苜蓿等100多種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物，引起枯萎病和根腐病等。其感染植物后，通常表現(xiàn)出萎蔫、黃化、枯萎甚至死亡的癥狀，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，對尖孢鐮孢菌引起的作物枯萎病、根腐病類土傳病害最經(jīng)濟(jì)有效的防控方法是抗病品種應(yīng)用，但由于該病原菌致病性分化較多，存在品種抗性缺失等問題。而采用土壤改良，土壤消毒，施用化學(xué)藥劑，生防菌劑應(yīng)用等防治手段都不能有效的控制該土傳病害的發(fā)生。因此，正確識別尖孢鐮孢菌引起的土傳病害、掌握其發(fā)生流行規(guī)律、開展發(fā)病前期和初期的快速診斷，及時(shí)采取有效防治措施，對有效防治該土傳病害的發(fā)生和降低生產(chǎn)損失具有重要的意義。為有效的監(jiān)測、預(yù)警尖孢鐮孢菌引起的枯萎病、根腐病等發(fā)生蔓延，建立一套靈敏度高、特異性強(qiáng)、便攜的快速檢測技術(shù)尤為重要。

2、鐮孢菌屬病原真菌形態(tài)多樣性和環(huán)境變化使得準(zhǔn)確鑒定困難，過程高度依賴專家經(jīng)驗(yàn)且耗時(shí)耗力。這些方法在混合樣品中也難以區(qū)分不同種類的鐮孢菌屬真菌。相對而言，基于基因檢測的現(xiàn)代分子生物學(xué)方法提供了更快速、準(zhǔn)確的替代方案，克服了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)方法的諸多限制，從而在實(shí)際應(yīng)用中展現(xiàn)出更高的效率和可靠性。

3、基于成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)/crispr相關(guān)蛋白(cas)系統(tǒng)的可視化基因檢測方法中，cas12a作為一種crispr效應(yīng)因子，因其獨(dú)特的機(jī)制而備受關(guān)注。cas12a能夠在向?qū)na(crrna)的引導(dǎo)下結(jié)合并切割目標(biāo)雙鏈dna(dsdna)，并在結(jié)合目標(biāo)后表現(xiàn)出非特異性切割單鏈dna(ssdna)的活性，從而在眾多crispr效應(yīng)因子中脫穎而出。利用這一特性，采用帶有熒光基團(tuán)、黑洞淬滅劑或生物素標(biāo)記的ssdna報(bào)告分子，即可實(shí)現(xiàn)通過熒光信號或膠體金層析免疫測定試紙條判定目標(biāo)dna的存在?；赾rispr/cas12a系統(tǒng)的可視化基因檢測技術(shù)因其具備高特異性、高靈敏度、低成本、快速和便攜的優(yōu)勢，尤其適合在資源有限的環(huán)境中應(yīng)用，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域尤其是田間即時(shí)對植物病原菌病害檢測中展現(xiàn)出巨大的潛力。

4、尖孢鐮孢菌可以以菌絲體，分生孢子、厚垣孢子的形式在土壤及未腐熟的菌肥中越冬、越夏，長期存活，土壤中的厚垣孢子可存活8-10年。通過帶菌種苗、土壤等進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，在棚室內(nèi)通過灌溉水、農(nóng)用器具等迅速擴(kuò)散。對土壤、雨水和植物根莖組織中的尖孢鐮孢菌進(jìn)行檢測是病害早期診斷和有效防治的關(guān)鍵?；赾rispr/cas12a系統(tǒng)的基因檢測技術(shù)，可以通過對目標(biāo)dna序列的擴(kuò)增來增強(qiáng)檢測的靈敏度和特異性。目標(biāo)dna序列的擴(kuò)增顯著提高了病原菌靶標(biāo)基因片段的數(shù)量，使得即使在病原菌侵染早期也能被檢測到，從而減少假陰性結(jié)果。這種技術(shù)能夠在復(fù)雜的植物組織樣本中準(zhǔn)確檢測微量病原菌，對于早期病害檢測和現(xiàn)場即時(shí)診斷至關(guān)重要，有助于及時(shí)采取防控措施，降低農(nóng)業(yè)損失，同時(shí)提升該技術(shù)在多樣化農(nóng)業(yè)環(huán)境中的應(yīng)用價(jià)值。通過檢索，發(fā)現(xiàn)如下幾篇與本發(fā)明專利申請相關(guān)的專利公開文獻(xiàn)：

5、1、現(xiàn)有技術(shù)中基于pcr的尖孢鐮孢菌分子鑒定技術(shù)(如專利公開文獻(xiàn)cn116855632a，一種檢測尖孢鐮刀菌的引物及其檢測方法)是利用dna聚合酶和特異性pcr引物對，在含有核苷酸的反應(yīng)緩沖液中，對菌株基因組gdna特異性擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)包括變性(將反應(yīng)體系加熱至94℃-98℃，使dna雙鏈解開，產(chǎn)生兩條單鏈模板)，退火(降低溫度至50℃-65℃，使引物能夠與目標(biāo)dna序列互補(bǔ)結(jié)合，形成引物-模板復(fù)合物)，延伸(提高溫度至dna聚合酶的最適工作溫度92℃，dna聚合酶沿著引物-模板復(fù)合物合成新的dna鏈)，重復(fù)上述三個(gè)步驟(變性、退火、延伸)20-40次，使目標(biāo)dna序列得以指數(shù)級擴(kuò)增，最終保持在延伸溫度一段時(shí)間，確保最后一輪pcr中所有未完成的dna鏈得到完全延伸。通過這些步驟，pcr能夠從極小的基因組gdna樣本中擴(kuò)增出足夠數(shù)量的目標(biāo)dna片段，為進(jìn)一步檢測或測序提供了充足的核酸材料。但是，其具有如下缺陷：(1)對基因組gdna樣本量和純度要求高；(2)依賴于價(jià)格昂貴的溫控儀器，無法在田間完成檢測，檢測成本高；(3)基因組gdna的提取和純化需0.5-1.0小時(shí)，pcr反應(yīng)需1.5-2.0小時(shí)，結(jié)果的凝膠電泳成像需0.5-1.0小時(shí)，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，周期長。

6、2、現(xiàn)有技術(shù)中一種基于rpa-crispr/cas12a的植物莖基腐病病原菌的快速檢測方法(申請?zhí)朿n202410114306.3，未授權(quán))，利用t4噬菌體的核酸復(fù)制機(jī)制，在多種酶和蛋白質(zhì)的共同作用下，可以在簡單熱源(37℃-43℃)的輔助下于30分鐘內(nèi)完成靶標(biāo)基因的rpa擴(kuò)增。通過crispr?cas12a靶向識別和切割靶標(biāo)基因(雙鏈dna)的dna酶活性完成對靶標(biāo)基因單堿基級別的高特異性識別。cas12a在靶向切割雙鏈dna后受激獲得切割非靶標(biāo)單鏈dna的活性，實(shí)現(xiàn)熒光檢測。但是，其具有如下缺陷：(1)檢測靶標(biāo)是針對尖孢鐮孢菌莖基腐病病原菌；我們針對的是包括莖基腐病和根腐病病原菌的尖孢鐮孢菌這個(gè)種進(jìn)行檢測。(2)此技術(shù)基于堿裂解法的核酸粗提技術(shù)，增加了試劑成本；(3)此技術(shù)選用的rpa等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是英國twistdx公司開發(fā)的，進(jìn)口試劑的使用增加了檢測成本，而我們選用的raa等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是由中國團(tuán)隊(duì)開發(fā)的rpa的升級版，在保留了rpa的所有技術(shù)優(yōu)勢的同時(shí)更具成本效益；(4)此技術(shù)僅限于熒光檢測，在對植物樣本進(jìn)行檢測時(shí)，由于該專利采用粗提法，不進(jìn)行核酸純化處理，粗提液中可能含有葉綠素等植物細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)。葉綠素在藍(lán)紫光下會發(fā)出粉色熒光，干擾結(jié)果的判定。

7、3、現(xiàn)有技術(shù)中一種尖孢鐮刀菌番茄專化型crispr一管法檢測體系(申請?zhí)朿n202311777720.4，未授權(quán))，s1、構(gòu)建含有尖孢鐮刀菌番茄?；蚮ol_six1保守序列的質(zhì)粒puc57-fol_six1；s2、將puc57-fol_six1質(zhì)粒與模板dna結(jié)合，構(gòu)建crispr-cas蛋白和sgrna；s3、將crispr-cas蛋白和sgrna通過體外轉(zhuǎn)錄與純化，制備cas12bsgrna；s4、將cas12bsgrna與模板dna結(jié)合，構(gòu)建cas12bsgrna與fol_six1-sgrna的雙鏈rna分子；s5、將雙鏈rna分子導(dǎo)入細(xì)胞，進(jìn)行cas12bsgrna的體外轉(zhuǎn)錄與純化；s6、將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定量pcr檢測，篩選出最佳的lamp引物；s7、將最佳的lamp引物與模板dna結(jié)合，進(jìn)行crispr一管法檢測體系的建立；s8、將crispr一管法檢測體系應(yīng)用于尖孢鐮刀菌番茄?；蚦rispr一管法檢測實(shí)驗(yàn)，檢測快速、操作便捷，且具有較高的檢測靈敏度。但是，其具有如下缺陷：(1)檢測靶標(biāo)是針對番茄?；图怄?；我們針對的是尖孢鐮孢菌這個(gè)種，包括但不僅限于番茄?；图怄摺?2)我們針對兩個(gè)靶向基因的雙重檢測，可以避免假陰性。(3)lamp擴(kuò)增(環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)不如raa擴(kuò)增的主要劣勢在于其操作復(fù)雜性和設(shè)備依賴性。具體來說，lamp需要6對引物，而raa僅需1對引物；lamp需要65℃的恒溫設(shè)備，而raa在35℃-37℃人體體溫下即可進(jìn)行擴(kuò)增。此外，lamp通常需要30-60分鐘完成擴(kuò)增，而raa在20分鐘內(nèi)即可完成。引物設(shè)計(jì)的復(fù)雜性和高成本也使得lamp操作難度更大，raa則更簡便，適合現(xiàn)場快速檢測。(4)其檢測時(shí)間大約為45分鐘，檢測靈敏度低于100拷貝每反應(yīng)。我們的靈敏度更低，我們的crispr熒光檢測體系反應(yīng)1小時(shí)的靈敏度可達(dá)0.6拷貝每30μl反應(yīng)體系，crispr試紙條檢測體系反應(yīng)30分鐘的靈敏度可達(dá)12拷貝每60μl反應(yīng)體系。

8、通過對比，本發(fā)明專利申請與上述專利公開文獻(xiàn)存在本質(zhì)的不同。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種尖孢鐮孢菌雙靶標(biāo)快速可視化原位檢測試劑盒、檢測方法和應(yīng)用。本發(fā)明為了有效應(yīng)對尖孢鐮孢菌的危害，開發(fā)一種基于鐮孢菌屬its?rrna基因保守區(qū)和尖孢鐮孢菌的特異性基因的田間快速可視化原位檢測方法。從鐮孢菌屬水平的廣譜檢測到目標(biāo)物種的特異性檢測，擴(kuò)大了監(jiān)測范圍，相較于單一病原體、單點(diǎn)方法更具優(yōu)勢。對于沒有技術(shù)背景和經(jīng)驗(yàn)的操作員，這種方法特別有利，因?yàn)樗峁┝穗p重檢查結(jié)果，最大限度地減少了由于人為錯(cuò)誤導(dǎo)致的假陽性或假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本發(fā)明提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，使農(nóng)業(yè)從業(yè)人員更易于使用。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

3、一種尖孢鐮孢菌雙靶標(biāo)快速可視化原位檢測試劑盒，包括

4、raa引物對一：

5、fus-f：ctttcaacaacggatctcttggttctggcatc

6、fus-r：gcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcact

7、特異性crrna一：

8、fus-crrna：

9、gggaauuucuacuguuguagaugcugcguucuucaucgaugc

10、raa引物對二：

11、fo-f：ttgaggtttgggatcaccgcaagagccgt

12、fo-r：ggagaatggagtggattggactatgaagac

13、特異性crrna二：

14、fo-crrna：

15、gggaauuucuacuguuguagaucagaaguugacgcugaau。

16、而且，還包括構(gòu)建crrna一、crrna二的程序和引物

17、crrna-f：taatacgactcactatagggaatttctactgttgtagat

18、fus-cr-r：gcatcgatgaagaacgcagcatctacaacagtagaaatt

19、fo-cr-r：attcagcgtcaacttctgatctacaacagtagaaatt。

20、而且，包括ssdna報(bào)告分子5’-fam-ttatt-bhq1-ttatt-biotin-3’。

21、而且，反應(yīng)體系包括raa反應(yīng)體系和crispr/cas12a反應(yīng)體系。

22、而且，所述raa反應(yīng)體系為：重組酶、2x反應(yīng)緩沖液、10μm上游引物和10μm下游引物、raa檢測的模板、280mm醋酸鎂。

23、而且，所述crispr/cas12a反應(yīng)體系為：1xnebuffer?2.1緩沖液，50nm?fncas12a，500nm?crrna,200nm三標(biāo)記ssdna報(bào)告分子5’fam-ttatt-bhq1-ttatt-biotin?3’、1u/μlrnase抑制劑。

24、一種尖孢鐮孢菌雙靶標(biāo)快速可視化原位檢測方法，所述反應(yīng)體系包括raa檢測和crispr/cas12a檢測；

25、⑴raa檢測：向重組酶干粉中加入25μl的2x反應(yīng)緩沖液、分別加入2μl的10μm的raa引物對一或raa引物對二，添加5μl的raa檢測的模板和2.5μl的280mm醋酸鎂，將反應(yīng)混合液充分混合后，立即在35℃-43℃下孵育10-30分鐘，獲得raa擴(kuò)增產(chǎn)物；

26、⑵crispr/cas12a檢測：

27、30μl?cas12a反應(yīng)液中含有1×nebuffer?2.1緩沖液，25nm-50nm?fncas12a，125nm-1000nm特異crrna一或特異crrna二，50nm-250nm三標(biāo)記ssdna報(bào)告分子；5’fam-ttatt-bhq1-ttatt-biotin?3’和1u/μl?rnase抑制劑；

28、⑶實(shí)時(shí)熒光裸眼觀測：加入2μlraa擴(kuò)增產(chǎn)物，39℃孵育，5-30分鐘；采用470nm?led燈照射，裸眼觀察熒光結(jié)果，出現(xiàn)熒光存在尖孢鐮孢菌；

29、⑷膠體金層析免疫測定試紙條檢測：加入2μlraa擴(kuò)增產(chǎn)物，在39℃孵育下反應(yīng)30分鐘；混合兩個(gè)平行反應(yīng)獲得60μl的crispr/cas12a系統(tǒng)檢測液于離心管中，插入cas12/13專用核酸檢測試紙條室溫孵育3-5分鐘，顯示對照線為檢測有效，出現(xiàn)檢測線為樣品中含有尖孢鐮孢菌，無檢測線為樣品不含尖孢鐮孢菌；

30、所述raa擴(kuò)增采用的引物對為：

31、raa引物對一：

32、fus-f：ctttcaacaacggatctcttggttctggcatc

33、fus-r：gcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcact

34、特異性crrna一：

35、fus-crrna：

36、gggaauuucuacuguuguagaugcugcguucuucaucgaugc

37、引物對二：

38、fo-f：ttgaggtttgggatcaccgcaagagccgt

39、fo-r：ggagaatggagtggattggactatgaagac

40、特異性crrna二：

41、fo-crrna：

42、gggaauuucuacuguuguagaucagaaguugacgcugaau；

43、而且，raa檢測的模板的獲取方法：取樣本于含有氧化鋯珠的離心管中，加入無核酸酶的滅菌水以浸潤樣本和氧化鋯珠，利用振蕩器振蕩10分鐘或研磨杵充分研磨獲得細(xì)胞裂解液，作為raa檢測的模板。

44、而且，還包括構(gòu)建crrna一、crrna二的程序和引物，引物對crrna-f/fus-cr-r和crrna-f/fo-cr-r序列為：

45、crrna-f：taatacgactcactatagggaatttctactgttgtagat

46、fus-cr-r：gcatcgatgaagaacgcagcatctacaacagtagaaatt

47、fo-cr-r：attcagcgtcaacttctgatctacaacagtagaaatt。

48、本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為：

49、1、本發(fā)明提供了一種適用于植物、土壤和雨水樣本上粗提病原菌核酸的珠磨裂解法，此方法價(jià)格低廉(無需化學(xué)試劑)、可重復(fù)利用、方便保存和運(yùn)輸、可實(shí)現(xiàn)田間樣品的細(xì)胞裂解，于10分鐘內(nèi)獲得適用于raa擴(kuò)增的核酸粗提液。

50、2、本發(fā)明采用的raa等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是由中國團(tuán)隊(duì)開發(fā)的rpa的升級版，在保留了rpa的所有技術(shù)優(yōu)勢(需要的溫度低，時(shí)間短)的同時(shí)更具成本效益(圖3和圖5)；擺脫對進(jìn)口試劑盒的依賴，在本專利優(yōu)化的條件下，檢出限低達(dá)10-1am水平。

51、3.本發(fā)明采用raa擴(kuò)增產(chǎn)物作為dna靶標(biāo)用于crispr/cas12a檢測系統(tǒng)。cas12a-crrna復(fù)合物識別擴(kuò)增子內(nèi)的原間隔短回文序列鄰近基序(protospacer?adjacent?motif，pam)，并特異性結(jié)合crrna的靶鏈。raa特異性擴(kuò)增和crispr/cas12a系統(tǒng)的特異性識別為體系的特異性提供雙重保障。

52、3、本發(fā)明的檢測利用的三標(biāo)探針或混入2種雙標(biāo)探針的策略，可以對同一實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩種可視化的結(jié)果呈現(xiàn)。在節(jié)省檢測成本和時(shí)間成本的基礎(chǔ)上，完成對同一實(shí)驗(yàn)結(jié)果的雙重驗(yàn)證，增強(qiáng)了檢測靈活性和結(jié)果可靠性，使得在不同的現(xiàn)場條件下可以進(jìn)行更準(zhǔn)確和及時(shí)的決策。

53、4、本發(fā)明的尖孢鐮孢菌病原體現(xiàn)場檢測反應(yīng)中設(shè)置兩個(gè)不同的基因靶標(biāo)進(jìn)行雙重檢測的優(yōu)勢在于，它增強(qiáng)了田間檢測結(jié)果的可靠性，有助于作出更準(zhǔn)確和及時(shí)的決策。

54、5、本發(fā)明試劑盒的靈敏度可達(dá)am級，滿足現(xiàn)場決速檢測的要求。同時(shí)檢測方法操作簡便，無需精密儀器，周期短，效率高，具有較高的特異性和準(zhǔn)確性。

55、6、本發(fā)明試劑盒與常規(guī)的鐮孢菌檢測相比，其具有時(shí)間短，便于操作，在田間即可完成檢測的優(yōu)勢。采用raa和crispr/cas12a系統(tǒng)結(jié)合，使檢測快速、高效、靈敏和準(zhǔn)確。