本發(fā)明涉及病原微生物檢測，具體為一種基因芯片、試劑盒及微生物檢測方法。

背景技術(shù)：

1、骨科感染患者多數(shù)因手術(shù)治療或介入治療而入院，感染多與手術(shù)切口和創(chuàng)口有關(guān)，因此骨科感染類型及其病原菌比較特殊，多項研究結(jié)果表明，我國骨科感染常見的病原微生物為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌等，并且這些病原常常抗生素具有耐藥性，骨科感染病原檢測一般依賴培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)方法依賴于臨床醫(yī)生對感染病原的預(yù)判，同時對特定的病原如結(jié)核、病毒等培養(yǎng)效果較差。

2、基因芯片技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種分子檢測方法。基因芯片的本質(zhì)是高密度微縮化的分子雜交，在一塊面積只有幾平方厘米的固相載體表面，可以通過共價連接固定數(shù)百個dna探針片段，提前設(shè)計的探針通常是選取微生物的特異基因或核酸片段，其作為檢測的靶基因可以與樣本中同種微生物核酸互補結(jié)合，從而得到樣本中目標(biāo)病原微生物的信息。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、(一)解決的技術(shù)問題

2、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基因芯片、試劑盒及微生物檢測方法，具備對病原微生物檢測等優(yōu)點，解決了上述背景技術(shù)中提到的問題。

3、(二)技術(shù)方案

4、為實現(xiàn)上述背景技術(shù)中提到的病原微生物檢測的目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種微生物檢測方法，包括以下步驟：

5、步驟一、根據(jù)檢測目的，從適當(dāng)?shù)沫h(huán)境或生物體中收集微生物樣本；

6、步驟二、使用適當(dāng)?shù)奶崛》椒◤念A(yù)處理后的樣本中提取微生物；

7、步驟三、根據(jù)檢測目的和微生物特性，選擇適當(dāng)?shù)臋z測方法；

8、步驟四、根據(jù)微生物培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測的結(jié)果，綜合分析確定感染病原體的種類。

9、優(yōu)選的，明確檢測目的，然后再選擇適當(dāng)?shù)臉颖绢愋停渲邪ㄑ簶颖?、組織樣本、分泌物樣本以及穿刺液樣本，再使用無菌器械和容器收集多個樣本，并確保確保每個樣本之間不會相互污染，然后再將樣品送至實驗室進(jìn)行處理，避免長時間放置導(dǎo)致微生物失活或污染。

10、優(yōu)選的，所述從預(yù)處理后的樣本中提取微生物，包括以下步驟：

11、步驟一、預(yù)處理：對于固體樣本，需要先進(jìn)行研磨、均質(zhì)化等處理，關(guān)節(jié)液和骨髓樣本需要進(jìn)行離心、過濾以去除雜質(zhì)，并進(jìn)行富集培養(yǎng)；

12、步驟二、微生物純化：將富集培養(yǎng)后的樣本均勻涂布在固體培養(yǎng)基上；培養(yǎng)后挑選形態(tài)、顏色等特征明顯的單菌落進(jìn)行進(jìn)—步純化，對挑選出的單菌落進(jìn)行劃線分離或液體培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，并重復(fù)上述步驟直至獲得純培養(yǎng)物。

13、優(yōu)選的，所述微生物檢測方法有：傳統(tǒng)培養(yǎng)法，其中包括細(xì)菌培養(yǎng)、真菌培養(yǎng)以及厭氧菌培養(yǎng)；

14、免疫學(xué)方法：抗原抗體反應(yīng)；

15、分子生物學(xué)方法：聚合酶鏈反應(yīng)方法以及基因芯片技術(shù)。

16、對于rna病毒提取的rna或細(xì)菌病毒共提取的核酸需要先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄步驟，將rna轉(zhuǎn)成cdna。過程中確保核酸和反應(yīng)試劑置于冰上，防止核酸尤其是rna降解，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可在-20℃短期保存，可在-80℃長期保存；

17、傳統(tǒng)培養(yǎng)法有：細(xì)菌培養(yǎng)：將標(biāo)本接種于適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，在特定條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)菌生長情況，通過菌落形態(tài)、革蘭染色、生化反應(yīng)等鑒定細(xì)菌種類；

18、真菌培養(yǎng):對于疑似真菌感染的患者，采用特定培養(yǎng)基進(jìn)行真菌培養(yǎng)，觀察真菌生長特性并進(jìn)行鑒定；

19、厭氧菌培養(yǎng):對于疑似厭氧菌感染的患者，采用厭氧培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行檢測。

20、免疫學(xué)方法：抗原抗體反應(yīng)，利用特異性抗原與抗體結(jié)合的原理，通過檢測患者體內(nèi)特異性抗體的存在來判斷感染病原體的種類。常用的免疫學(xué)方法包括免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗；

21、分子生物學(xué)方法：聚合酶鏈反應(yīng)：利用特異性引物對病原體dna進(jìn)行擴(kuò)增，通過檢測擴(kuò)增產(chǎn)物來判斷病原體種類，pcr技術(shù)具有高靈敏度、高特異性和快速準(zhǔn)確等優(yōu)點；

22、基因芯片技術(shù)：將大量已知序列的基因片段固定在芯片上，通過與待檢樣本中的dna或rna進(jìn)行雜交，實現(xiàn)對多種病原體的同時檢測。

23、優(yōu)選的，一種基因芯片，包括以下步驟：

24、步驟一、明確骨感染中常見的感染病原；

25、步驟二、針對已確定的病原，選擇其特異性基因序列作為探針設(shè)計的基礎(chǔ)并根據(jù)選定的基因序列，設(shè)計合適的探針序列；

26、步驟三、選擇合適的載體材料并對載體進(jìn)行化學(xué)處理；

27、步驟四、利用化學(xué)合成技術(shù)在體外合成探針，將合成好的探針通過點樣法或原位合成法固定在預(yù)處理好的載體上；

28、步驟五、從骨感染患者的樣本中提取病原核酸，將提取好的病原核酸進(jìn)行熒光或其他形式的標(biāo)記，并進(jìn)行雜交反應(yīng)；

29、步驟六、使用熒光掃描儀或其他檢測設(shè)備對雜交后的芯片進(jìn)行掃描，根據(jù)收集到的數(shù)據(jù)，分析樣品中是否存在目標(biāo)病原以及病原的種類和數(shù)量。

30、優(yōu)選的，使用適當(dāng)?shù)暮怂崽崛》椒◤臉颖局刑崛〔≡怂崽崛∵^程中應(yīng)確保核酸的純度和完整性，避免降解和丟失，對提取的核酸進(jìn)行純化,去除蛋白質(zhì)、多糖，對標(biāo)記后的核酸樣品進(jìn)行質(zhì)量控制，包括濃度測定、純度檢查，并根據(jù)實驗需求和目標(biāo)病原的特性，優(yōu)化雜交反應(yīng)的條件，包括溫度、時間、鹽濃度、緩沖液成分，將標(biāo)記好的核酸樣品與固定在芯片上的探針進(jìn)行雜交，雜交完成后，使用適當(dāng)?shù)南疵撘喝コ唇Y(jié)合的核酸分子和其他雜質(zhì)。

31、優(yōu)選的，掃描過程中需要調(diào)整掃描參數(shù)，如激光功率、增益、曝光時間，掃描完成后，熒光掃描儀將捕獲的信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字圖像數(shù)據(jù)，對獲取的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行初步的質(zhì)量控制檢查，對獲取的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正、信號增強(qiáng)預(yù)處理，根據(jù)預(yù)處理后的圖像數(shù)據(jù)，計算每個探針點的熒光強(qiáng)度值，將表達(dá)模式相似的基因或樣本進(jìn)行聚類分析，對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析。

32、開啟并預(yù)熱45℃雜交箱，將雜交盒和雜交板放入雜交箱內(nèi)至少30min；

33、將反應(yīng)雜交液在pcr儀上95℃孵育10min，再降至70℃保溫(也可再95℃結(jié)束后直接置于冰上快速降溫)將雜交液加入到雜交板與芯片相應(yīng)位置中；

34、將芯片轉(zhuǎn)移至雜交板中，檢查液體是否覆蓋整個芯片；將芯片放入雜交盒，雜交盒再放入45℃雜交箱孵育2h。；

35、開啟并預(yù)熱30℃雜交箱，將洗板和30ml.wash?b(裝入離心管)放入雜交箱內(nèi)至少30min；再室溫下將30ml.wash?a倒入洗板；

36、將芯片板從雜交盒取出,觀察芯片是否有氣泡等情況,之后將芯片轉(zhuǎn)移至wash?a洗板,在室溫下靜止清洗5min；

37、將wash?b倒入洗板，隨后將芯片板轉(zhuǎn)移至wash?b洗板中，在30℃下靜止清洗5min；

38、用4x?ssc按1:100稀釋sape，將稀釋后的染料加入到孔板對應(yīng)芯片的位置；

39、將芯片從wash?b中取出，甩干芯片表面的水分，將芯片轉(zhuǎn)移至染液中，避光室溫下染色20min；

40、將4x?ssc倒入洗板，染色結(jié)束后將芯片轉(zhuǎn)移至4x?ssc洗板，清洗2min；

41、選擇s2b的rfid，選擇bf,green-am1e-1s和green-am1e-4s三個通道，選擇對應(yīng)芯片位置進(jìn)行掃描。

42、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種基因芯片、試劑盒及微生物檢測方法，具備以下有益效果：

43、1、本發(fā)明，通過收集微生物樣本，然后再提取微生物，并根據(jù)檢測目的和微生物特性，選擇適當(dāng)?shù)臋z測方法，根據(jù)微生物培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測的結(jié)果，綜合分析確定感染病原體的種類，再針對已確定的病原，選擇其特異性基因序列作為探針設(shè)計的基礎(chǔ)并根據(jù)選定的基因序列，設(shè)計合適的探針序列，再使用熒光掃描儀或其他檢測設(shè)備對雜交后的芯片進(jìn)行掃描，則完成對病原微生物檢測。

44、2、本發(fā)明，根據(jù)探針數(shù)量設(shè)計，能檢測幾十至幾百種微生物，序列特異的探針能基本排除假陽性的可能。

45、3、本發(fā)明，檢測內(nèi)容靈活，探針可根據(jù)使用場景靈活設(shè)計，如不同病原的耐藥基因設(shè)計，區(qū)分株系的特異序列設(shè)計。