本發(fā)明屬于胚胎工程領(lǐng)域，具體是一種豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液添加劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬的繁殖性能關(guān)系到養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)規(guī)模和經(jīng)濟(jì)效益。為提高豬的繁殖性能，卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)(in?vitromaturation，ivm)得到飛速發(fā)展。雖然，卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)在上個(gè)世紀(jì)便已經(jīng)出現(xiàn)，但是成熟率低一直困擾著科研和生產(chǎn)工作者。ivm是一種在體外誘導(dǎo)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cocs)成熟至卵母細(xì)胞mιι期的技術(shù)。這一技術(shù)的目的在于促進(jìn)未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟，ivm培養(yǎng)技術(shù)在發(fā)展過(guò)程中不斷改進(jìn)，包括培養(yǎng)方案、培養(yǎng)液改良和培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化，并已發(fā)展出卵母細(xì)胞成熟率高于常規(guī)ivm培養(yǎng)的方案和多種成熟液添加劑提高卵母細(xì)胞的成熟率，通過(guò)孤雌激活誘導(dǎo)卵母細(xì)胞向早期胚胎發(fā)育。

2、孤雌激活是指處于mιι期卵母細(xì)胞不經(jīng)過(guò)精子的受精作用，而是在某些理化因素的刺激下，發(fā)育成早期胚胎的過(guò)程，這種方式不需要精子與卵子結(jié)合。目前體外受精依然是動(dòng)物繁殖過(guò)程中常規(guī)的配種方式，但是購(gòu)買冷凍精液以及各種配種裝置的成本往往偏高，并且不是一次受精便可以成功，所以這種獨(dú)特的激活方式便為動(dòng)物生產(chǎn)帶來(lái)新的機(jī)遇。

3、卵母細(xì)胞的體外成熟和孤雌激活技術(shù)均屬于胚胎工程技術(shù)，這一技術(shù)有利于畜牧業(yè)的發(fā)展，并已經(jīng)日漸成熟，成為了動(dòng)物繁殖必不可或缺的生物技術(shù)。該技術(shù)在于種群擴(kuò)繁，縮短動(dòng)物的育種周期，加速品種改良，提高生產(chǎn)效率等方面有著深遠(yuǎn)的影響。目前，屠宰場(chǎng)獲得的卵母細(xì)胞發(fā)育能力均低于體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞，這些卵子的質(zhì)量以及層次高低不齊，導(dǎo)致獲得成熟的、具有分裂能力的和能夠發(fā)育成囊胚潛力的卵母細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定性較差，這是目前該技術(shù)的主要缺陷點(diǎn)。如果能夠穩(wěn)定提高卵母細(xì)胞的體外發(fā)育能力，便能夠進(jìn)一步提高該技術(shù)的總體效率，提高該技術(shù)在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用水平。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了提高卵母細(xì)胞成熟率，本發(fā)明提供了一種豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液添加劑及其應(yīng)用，促進(jìn)豬卵母細(xì)胞成熟。

2、(一)本發(fā)明提供了一種豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液添加劑。

3、所述添加劑中含有牛黃酸。

4、所述添加劑中還含有丙酮酸鈉、半胱氨酸、葡萄糖、nahco3、胎牛血清、雌二醇、孕馬血清促性腺激素和人絨毛促性腺激素(丙酮酸鈉、葡萄糖和胎牛血清為卵母細(xì)胞補(bǔ)充底物能量；半胱氨酸提供蛋白補(bǔ)充；雌二醇、孕馬血清促性腺激素和人絨毛促性腺激素為卵母細(xì)胞發(fā)育補(bǔ)充激素需要)。

5、(二)本發(fā)明提供了一種含有上述添加劑的豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液。

6、所述培養(yǎng)液中，每100ml含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基0.954g、丙酮酸鈉0.91mm、半胱氨酸0.57mm、葡萄糖3.05mm、nahco30.22?g、10％體積濃度的胎牛血清、0.1％體積濃度的雌二醇、1％體積濃度的孕馬血清促性腺激素和1％體積濃度的人絨毛促性腺激素，牛磺酸的終濃度為25～150μg/ml。

7、所述培養(yǎng)液中?；撬岬慕K濃度，優(yōu)選為50～100μg/ml，更優(yōu)選為50μg/ml。

8、所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為購(gòu)自gibco的tcm199培養(yǎng)基。

9、(三)本發(fā)明公開了所述添加劑和培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞中的應(yīng)用。

10、所述添加劑和豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液用于提高豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟率和質(zhì)量；用于降低豬卵母細(xì)胞的內(nèi)ros含量，提高豬卵母細(xì)胞抗氧化能力；用于改善卵母細(xì)胞中的線粒體分布。

11、所述添加劑和培養(yǎng)液在制備促進(jìn)豬卵母細(xì)胞成熟的藥物和飼料添加劑中的應(yīng)用。使用添加了50μg/ml牛磺酸的豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液，在豬卵母細(xì)胞成熟后的孤雌激活中獲得更高質(zhì)量和數(shù)量的桑葚胚。

12、(四)本發(fā)明公開了所述添加劑和培養(yǎng)液用于提高豬卵母細(xì)胞孤雌激活中的早期胚胎分裂率。

13、本發(fā)明公開了一種提高豬卵母細(xì)胞孤雌激活中的早期胚胎分裂率的方法，包括如下步驟：

14、步驟(1)：將豬卵母細(xì)胞在所述培養(yǎng)液中培養(yǎng)，移除卵丘細(xì)胞，收集豬卵母細(xì)胞然后將成熟的豬卵母細(xì)胞置于化學(xué)激活液中，并使用電轉(zhuǎn)儀激活卵母細(xì)胞完成孤雌激活；

15、步驟(2)：將步驟(1)中孤雌激活后的豬卵母細(xì)胞置于胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：

17、(1)將添加劑添加于豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中用于體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞，?；撬峥梢燥@著降低豬卵母細(xì)胞內(nèi)ros含量，提高所述豬卵母細(xì)胞的抗氧化能力，改善卵母細(xì)胞的線粒體分布從而改善卵母細(xì)胞的發(fā)育，促進(jìn)豬卵母細(xì)胞成熟。該技術(shù)應(yīng)用于豬的輔助生殖技術(shù)上，可以提高胚胎發(fā)育的成功率和質(zhì)量。

18、(2)本發(fā)明可以提高豬卵母細(xì)胞孤雌激活后早期胚胎分裂率，培養(yǎng)液中添加?；撬嵊欣诮档拓i卵母細(xì)胞內(nèi)ros含量，在經(jīng)過(guò)電激活使卵母細(xì)胞進(jìn)行分裂；將孤雌激活后的豬卵母細(xì)胞進(jìn)行胚胎發(fā)育，由此利于實(shí)現(xiàn)早期胚胎發(fā)育。

技術(shù)特征：

1.一種豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液添加劑，其特征在于，所述添加劑中含有牛黃酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的添加劑，其特征在于，所述添加劑中還含有丙酮酸鈉、半胱氨酸、葡萄糖、nahco3、胎牛血清、雌二醇、孕馬血清促性腺激素和人絨毛促性腺激素。

3.一種含有權(quán)利要求2所述的添加劑的豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液中，每100ml含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基0.954g、丙酮酸鈉0.91mm、半胱氨酸0.57mm、葡萄糖3.05mm、nahco30.22?g、10％體積濃度的胎牛血清、0.1％體積濃度的雌二醇、1％體積濃度的孕馬血清促性腺激素和1％體積濃度的人絨毛促性腺激素，牛磺酸的終濃度為25～150μg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)液，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為tcm199培養(yǎng)基。

5.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的添加劑在體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于，所述添加劑用于提高豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟率、用于降低豬卵母細(xì)胞的內(nèi)ros含量或用于改善卵母細(xì)胞中的線粒體分布。

6.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于，所述添加劑用于提高豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟率、用于降低豬卵母細(xì)胞的內(nèi)ros含量或用于改善卵母細(xì)胞中的線粒體分布。

7.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的添加劑在提高豬卵母細(xì)胞孤雌激活中早期胚胎分裂率中的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)液在提高豬卵母細(xì)胞孤雌激活中的早期胚胎分裂率中的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)液在提高豬卵母細(xì)胞孤雌激活中的早期胚胎分裂率中的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液添加劑及其應(yīng)用，屬于胚胎工程領(lǐng)域，所述添加劑中含有牛黃酸。所述添加劑中還含有丙酮酸鈉、半胱氨酸、葡萄糖、NaHCO<subgt;3</subgt;、胎牛血清、雌二醇、孕馬血清促性腺激素和人絨毛促性腺激素。添加有所述添加劑的豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中在體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞中，可以顯著降低豬卵母細(xì)胞內(nèi)ROS含量，提高所述豬卵母細(xì)胞的抗氧化能力，改善卵母細(xì)胞的線粒體分布從而改善卵母細(xì)胞的發(fā)育，促進(jìn)豬卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育。該技術(shù)應(yīng)用于豬的輔助生殖技術(shù)上，可以提高胚胎工程的成功率和質(zhì)量；添加有所述添加劑的豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中可以提高豬卵母細(xì)胞孤雌激活中早期胚胎分裂率。

技術(shù)研發(fā)人員：陳風(fēng)雷,王皓祥,袁玉國(guó),劉琪,楊盛,馬志禹,許顯玉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：揚(yáng)州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9