本發(fā)明屬于基因工程和生物合成，具體涉及一種以葡萄糖和木糖合成2′-巖藻糖基乳糖的基因工程菌的構(gòu)建及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、母乳低聚糖(human?milk?oligosaccharides,hmos)又稱為人乳寡糖，在母乳中含量豐富。其中，2′-巖藻基乳糖(2′-fl)又是成熟人乳中含量最豐富的成分之一，約占總低聚糖的31％。從結(jié)構(gòu)上看，2′-巖藻基乳糖由l-巖藻糖、d-半乳糖和d-葡萄糖組成，表示為fucα1,2galβ1,4glc。2′-巖藻基乳糖的健康益處已得到廣泛研究，包括益生元效應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、腸道保護(hù)、抗菌抗病毒作用以及大腦發(fā)育和認(rèn)知增強(qiáng)。2′-巖藻基乳糖是第一個(gè)被商業(yè)化添加到嬰幼兒配方奶粉中的hmo，安全性評(píng)估確認(rèn)2′-巖藻基乳糖沒有急性口服毒性、遺傳毒性和亞慢性毒性，已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(fda)和歐盟等許多權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可并批準(zhǔn)為有效的嬰兒配方奶粉成分，為其在嬰兒配方奶粉和其他旨在模仿人乳益處的營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品中的使用鋪平了道路。

2、目前，2′-巖藻基乳糖生產(chǎn)主要有化學(xué)合成法、酶合成法和工程微生物發(fā)酵法，其中，工程微生物發(fā)酵法因操作方便、成本低、反應(yīng)條件溫和被廣泛應(yīng)用；然而，目前產(chǎn)2′-巖藻基乳糖的工程菌主要是以乳糖或巖藻糖為底物，需要外源乳糖或巖藻糖的供給，原料成本較高，降低了2′-巖藻基乳糖的經(jīng)濟(jì)效益；為此，li等人通過引入乳糖生產(chǎn)模塊，構(gòu)建了2′-fl的從頭生物合成途徑，利用甘油和葡萄糖高效生產(chǎn)出2′-fl。parschat等人以蔗糖為原料高效生產(chǎn)2′-fl，該菌株能夠在胞內(nèi)自產(chǎn)乳糖并進(jìn)一步用于2′-fl的生產(chǎn)，這些糖相較于乳糖和巖藻糖雖然在一定程度上降低了2′-fl的生產(chǎn)成本，但是還是存在有原料價(jià)格高的缺陷；此外，這些方法在發(fā)酵合成過程中還需要添加抗生素和誘導(dǎo)劑，進(jìn)一步增加了2′-fl的生產(chǎn)成本。

3、因此，構(gòu)建一種能夠以廉價(jià)糖為底物、且不添加抗生素和誘導(dǎo)劑的產(chǎn)2′-巖藻糖基乳糖基因工程菌，對(duì)于降低2′-巖藻糖基乳糖的生產(chǎn)成本，具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種以葡萄糖和木糖合成2′-巖藻糖基乳糖的基因工程菌的構(gòu)建及應(yīng)用，其以木糖和葡萄糖為底物，不添加乳糖、抗生素和誘導(dǎo)劑，極大的降低了生產(chǎn)成本。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下：

3、一種以葡萄糖和木糖為底物的產(chǎn)乳糖基因工程菌，以大腸桿菌為出發(fā)菌株，敲除大腸桿菌基因組上的β-半乳糖苷酶基因lacz，敲除葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiicbglc組件編碼基因ptsg，在ptsg位點(diǎn)整合表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白glf，敲除葡萄糖激酶基因glk、在glk位點(diǎn)處整合表達(dá)β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶nmlgtb，敲除udp-葡萄糖-6-脫氫酶基因ugd，在ugd位點(diǎn)處整合表達(dá)udp-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶基因gale，敲除亞砷酸鹽/銻酸鹽：h+反向轉(zhuǎn)運(yùn)基因arsb，將d-木糖：h+同向轉(zhuǎn)運(yùn)基因xyle整合到arsb位點(diǎn)，得產(chǎn)乳糖基因工程菌。

4、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白glf來源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(zymomonasmobilis)，在ncbi序列號(hào)為aaa27691.1，其核苷酸序列如seq?id?no.1；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白glf由強(qiáng)組成型啟動(dòng)子pj23119啟動(dòng)表達(dá)；

5、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶nmlgtb來源于腦膜炎奈瑟球菌(neisseria?meningitidis)，在ncbi序列號(hào)為aac44085.1，其核苷酸序列如seq?id?no.2；β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶nmlgtb由強(qiáng)組成型啟動(dòng)子pj23119啟動(dòng)表達(dá)；

6、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，udp-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶基因gale來源于大腸桿菌k-12mg1655(escherichia?coli?k-12mg1655)，在ncbi序列號(hào)為np_415280.3，其核苷酸序列如seq?id?no.3所示；udp-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶基因gale由強(qiáng)組成型啟動(dòng)子pj23119啟動(dòng)表達(dá)；

7、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，d-木糖：h+同向轉(zhuǎn)運(yùn)基因xyle來源于大腸桿菌bl21(de3)，在ncbi序列號(hào)為np_418445.1，其核苷酸序列如seq?id?no.6所示，d-木糖：h+同向轉(zhuǎn)運(yùn)基因xyle由強(qiáng)組成型啟動(dòng)子pj23119啟動(dòng)表達(dá)。

8、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述大腸桿菌包括但不限于大腸桿菌bl21(de3)，還可以為大腸桿菌k-12mg1655、大腸桿菌bw25113、大腸桿菌w3110等。

9、一種以葡萄糖和木糖為底物的產(chǎn)2′-巖藻糖基乳糖基因工程菌，以所述的高產(chǎn)乳糖的基因工程菌為出發(fā)菌株，敲除d-乳酸脫氫酶基因ldha，在ldha位點(diǎn)整合表達(dá)α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶bkht。

10、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶bkht來源于幽門螺桿菌屬11s02629-2，在ncbi序列號(hào)為paf50342.1，其核苷酸序列如seq?id?no.5所示；α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶bkht由強(qiáng)組成型啟動(dòng)子pj23119啟動(dòng)表達(dá)。

11、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，敲除udp-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶基因wcaj。

12、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，采用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子pj23119替換基因組上磷酸甘露糖變位酶-甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉(zhuǎn)移酶基因簇manc-manb和gdp-甘露糖-6-脫水酶-gdp-巖藻糖合成酶基因簇gmd-wcag的原始啟動(dòng)子。

13、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，強(qiáng)組成型啟動(dòng)子pj23119的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

14、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，β-半乳糖苷酶基因lacz在ncbi序列號(hào)為np_414878.1；

15、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiicbglc組件編碼基因ptsg在ncbi序列號(hào)為np_415619.1；

16、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，葡萄糖激酶基因glk在ncbi序列號(hào)為np_416889.1；

17、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，udp-葡萄糖-6-脫氫酶基因ugd在ncbi序列號(hào)為np_416532.1作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，亞砷酸鹽/銻酸鹽：h+反向轉(zhuǎn)運(yùn)基因arsb在ncbi序列號(hào)為np_417959.4；

18、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，d-乳酸脫氫酶基因ldha在ncbi序列號(hào)為np_415898.1；

19、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，udp-葡萄糖脂質(zhì)載轉(zhuǎn)移酶編碼基因wcaj在ncbi序列號(hào)為np_416551.1；

20、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，磷酸甘露糖變位酶-甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉(zhuǎn)移酶基因簇中，甘露糖1-鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因manc在ncbi序列號(hào)為np_416553.1，磷酸甘露糖酶編碼基因manb在ncbi序列號(hào)為np_416552.1；

21、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，gdp-甘露糖-6-脫水酶-gdp-巖藻糖合成酶基因簇中，gdp-d-甘露糖-4,6-脫水酶編碼基因gmd在ncbi序列號(hào)為np_416557.1，gdp-巖藻糖合成酶編碼基因wcag在ncbi序列號(hào)為np_416556.1。

22、所述產(chǎn)乳糖基因工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳糖中的應(yīng)用。

23、所述產(chǎn)2′-巖藻糖基乳糖基因工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)2′-巖藻基乳糖中的應(yīng)用。

24、一種以葡萄糖和木糖為底物合成2′-巖藻糖基乳糖的方法，以葡萄糖和木糖為底物，對(duì)如權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述產(chǎn)2′-巖藻糖基乳糖基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)獲得；

25、采用搖瓶進(jìn)行發(fā)酵，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中包含有20g/l的葡萄糖、10g/l的木糖，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的工藝條件為：在35～38℃發(fā)酵培養(yǎng)至od600為0.6～0.8后，22～25℃繼續(xù)培養(yǎng)至少72h；

26、或者，采用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，初始發(fā)酵罐培養(yǎng)基中包含有30g/l的木糖或者包含有25g/l的木糖、5g/l的葡萄糖，發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：在35～38℃發(fā)酵培養(yǎng)至木糖完全耗盡后，流加補(bǔ)料木糖，使木糖終濃度保持在2-5g/l，繼續(xù)培養(yǎng)至od600達(dá)到約15，然后降溫至22～25℃，同時(shí)繼續(xù)補(bǔ)加葡萄糖作為底物，使葡萄糖終濃度為5-10g/l，繼續(xù)發(fā)酵至總時(shí)長(zhǎng)至少為72h；發(fā)酵培養(yǎng)過程中，ph全程保持在6.8±0.2，并通過添加消泡劑控制泡沫。通過調(diào)節(jié)攪拌速度(100～900rpm)和通氣量(2～8vvm)控制溶氧。

27、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述葡萄糖和木糖來源于木質(zhì)纖維素的酶解混合物。

28、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述產(chǎn)2′-巖藻糖基乳糖基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有20g/l葡萄糖，10g/l木糖；

29、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述產(chǎn)2′-巖藻糖基乳糖基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有5.0g/l酵母提取物，4.0g/l磷酸氫二銨，13.5g/l磷酸二氫鉀，1.4g/l七水硫酸鎂，1.7g/l檸檬酸和10ml/l微量金屬元素；微量金屬元素包括：0.35g/l一水硫酸錳，10g/l硫酸亞鐵，1.0g/l無水硫酸銅，2.25g/l七水硫酸鋅，2.0g/l二水氯化鈣，0.23g/l十水硼酸鈉和0.11g/l鉬酸銨。

30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

31、1、本發(fā)明引入獨(dú)立于ptsglc轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的nptsglc途徑，通過敲除競(jìng)爭(zhēng)旁路、強(qiáng)化關(guān)鍵酶的啟動(dòng)子及過表達(dá)α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、消除副產(chǎn)物途徑等策略提升工程菌的產(chǎn)能，以葡萄糖和木糖為底物，實(shí)現(xiàn)乳糖和2′-巖藻糖基乳糖的高效合成，極大的降低了原料成本。

32、2、木質(zhì)纖維素原料是世界上最為豐富的可再生資源，可用作微生物發(fā)酵生產(chǎn)高附加值生物化學(xué)品的原料，且不與全球糧食供應(yīng)相競(jìng)爭(zhēng)，是一種很有前途的生物生產(chǎn)原料。葡萄糖作為纖維素的組成成分，是從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中獲得的最常見的單糖。以木糖為主要成分的半纖維素約占木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的20-40％；經(jīng)過預(yù)處理和酶解后，木質(zhì)纖維素水解液為含有葡萄糖和木糖的混合糖，而本發(fā)明以葡萄糖和木糖為底物的產(chǎn)乳糖和2′-巖藻糖基乳糖工程菌的開發(fā)，為木質(zhì)纖維素的高價(jià)值利用奠定了基礎(chǔ)，極大的降低了乳糖和2′-巖藻糖基乳糖合成的原料成本。

33、3、本發(fā)明的重組菌株為組成型整合表達(dá)，不需要誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，也不需要添加抗生素，進(jìn)一步降低了2′-巖藻糖基乳糖生產(chǎn)的原料成本，此外，其還避免誘導(dǎo)劑和抗生素的添加對(duì)產(chǎn)物的污染，降低了產(chǎn)品提取純化過程中誘導(dǎo)劑和抗生素的去除工序，更利于2′-巖藻糖基乳糖的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

34、綜上，本發(fā)明通過在大腸桿菌bl21(de3)中搭建了一條高效合理的從頭合成2′-巖藻糖基乳糖通路，通過基因工程以及代謝工程策略設(shè)計(jì)改造所得的重組大腸桿菌，能夠以葡萄糖、木糖為底物，在無外源乳糖添加的條件下，搖瓶發(fā)酵2′-巖藻糖基乳糖產(chǎn)量達(dá)到6.53g/l，且發(fā)酵全程無需添加抗生素和誘導(dǎo)劑，具有放大生產(chǎn)潛力、商業(yè)應(yīng)用價(jià)值和良好的產(chǎn)業(yè)化前景。