本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種水稻loc_os10g35180基因及其在調控水稻雄性不育中的應用。

背景技術：

1、我國是水稻是種植生產大國，水稻是主要糧食作物。雜交水稻的發(fā)展是提高糧食產量、解決糧食安全問題的重要途徑。隨著時代的發(fā)展，雜交稻的生產模式也在不斷進步，從三系配套(不育系、恢復系、保持系)到兩系雜交(不育系、恢復系)，再到如今以遺傳工程雄性不育系為遺傳工具的第三代雜交水稻，雜交制種變得更加穩(wěn)定、便捷和高效。雜交稻育種將繼續(xù)面臨人口增加、耕地面積減少以及環(huán)境惡化的挑戰(zhàn)，相關研究需求仍迫在眉睫。

2、花藥是水稻的雄性生殖器官，包含兩個藥室，再往內依次是花粉囊和花粉粒?；ㄋ幍恼０l(fā)育對水稻開花和種子形成至關重要，其育性的調控涉及基因、激素和環(huán)境等多個層面，是雜交稻生產中最關鍵的環(huán)節(jié)。如何調控花藥的，控制花粉粒的產生是培育雄性不育系水稻的重要調控方法。

3、影響水稻雄性不育的基因根據其作用的時期主要分為二類，一類是影響花粉發(fā)育時期的減數分裂、花藥絨氈層降解和花粉壁形成的相關基因，第二類是影響花粉粒水合萌發(fā)和花粉管伸長的相關基因。loc_os10g35180基因編碼一個atp結合盒轉運蛋白osabcg26。該蛋白在水稻花藥和雌蕊中特異表達，與osabcg15協(xié)同調控水稻雄性生殖，主要負責脂質分子從絨氈層細胞運往花藥壁層，因而在水稻花藥角質層和花粉外壁的形成中起作用，并通過影響花粉管伸長在花粉-雌蕊相互作用中起重要作用。osabcg26突變體的營養(yǎng)生殖正常，但花器官發(fā)育異常，表現(xiàn)為雄性不育，花藥小而短，絨氈層細胞、脂質烏氏體、花粉外壁和花藥角質層存在缺陷。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種水稻loc_os10g35180基因及其在調控水稻雄性不育中的應用，通過利用crispr-cas9基因編輯技術定點突變loc_os10g35180基因來獲得雄性不育系，從而縮短育種周期，為發(fā)展新的水稻雄性不育品系提供理論指導。

2、本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)：

3、一種利用loc_os10g35180基因制備雄性不育水稻的方法，通過調控絨氈層細胞降解延遲，促進花粉外壁發(fā)育異常，無外壁內層，柱狀層塌陷，而得到雄性不育水稻；所述基因loc_os10g35180的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、本發(fā)明利用loc_os10g35180基因來制備雄性不育水稻的方法，通過crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)對loc_os10g35180編碼基因進行定點編輯實現(xiàn)。具體包括以下步驟：

5、(1)利用crispr/cas9系統(tǒng)，根據loc_os10g35180基因選擇靶位點；所述靶位點為target1和target2；

6、所述target1的dna序列為：acgtgctccaggggctcacgggg；

7、所述target2的dna序列為：agaccatctcatactcggcgcgg；

8、(2)構建含所述靶位點序列片段的crispr/cas9重組載體；先采用bsai酶切始載體wmc025獲得線性化載體；再利用引物loc_os10g35180-czf和loc_os10g35180-czr對t載wmz006進行pcr擴增獲得純化的pcr產物；再將得到的線性化載體骨架和純化的pcr產物進行重組獲得完整的目的crispr/cas9重組載體；

9、所述引物loc_os10g35180-czf的dna序列為：

10、cgcgctgtcgcttgtgtgcgtgctccaggggctcacggttttagagctagaaat；

11、所述引物loc_os10g35180-czr的dna序列為：

12、ctatttctagctctaaaaccgccgagtatgagatggtccgccacggatcatctgca；

13、(3)采用農桿菌介導技術將所獲得的crispr/cas9重組載體導入水稻愈傷組織中得到轉基因苗；

14、(4)篩選轉基因苗中的陽性植株；提取植株嫩葉的dna，再利用引物hyg-4f和hyg-4r進行pcr擴增，電泳檢測，出現(xiàn)電泳條帶的即為陽性植株，獲得雄性不育水稻。

15、hyg-4f序列為：cgacagcgtctccgacctgat；

16、hyg-4r序列為：atgttggcgacctcgtattgg。

17、loc_os10g35180基因制備的雄性不育水稻的鑒定方法，以2個編輯位點序列設計引物進行pcr擴增，對擴增產物進行測序，選擇任一靶位點發(fā)生功能缺失突變的純合突變體作為突變植株。pcr擴增采用的引物為loc_os10g35180-a1-f1，loc_os10g35180-a1-r1；

18、loc_os10g35180-a2-f1；loc_os10g35180-a2-r1；

19、所述loc_os10g35180-a1-f1序列為：agatgaagaagcagggag；

20、loc_os10g35180-a1-r1序列為：gtgcgaaatgacagaatg；

21、所述loc_os10g35180-a2-f1序列為：agttacctccaggctcca；

22、loc_os10g35180-a2-r1序列為：tgctgaccctcctcttct。

23、本發(fā)明的loc_os10g35180基因可應用在水稻基因遺傳工程育種中。

24、本發(fā)明的loc_os10g35180基因可應用在調控水稻雄性不育中。

25、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果為：

26、1、縮短育種周期，提高育種效率。本發(fā)明通過crispr-cas9基因編輯技術定點突變loc_os10g35180基因，直接獲得雄性不育系水稻，避免了傳統(tǒng)雜交育種的多代自交和回交過程，顯著縮短了育種周期，提高了育種效率。

27、2.提供新基因資源，豐富不育系種類：loc_os10g35180基因編輯成功創(chuàng)制了新的雄性不育系水稻，豐富了水稻雄性不育系的種類，為雜交稻育種提供更多選擇，有助于培育出高產、優(yōu)質的水稻新品種。

28、3.鑒定方法簡便，結果穩(wěn)定可靠：本發(fā)明的雄性不育水稻鑒定方法，通過陽性植物序列檢測鑒定引物loc_os10g35180-a1-f1，loc_os10g35180-a1-r1；loc_os10g35180-a2-f1；loc_os10g35180-a2-r1的擴增和測序，操作簡便，結果穩(wěn)定可靠，適用于實驗室和田間大規(guī)模應用，確保育種的準確性和成功率。

29、4.減少去雄工作，降低勞動強度：雄性不育系水稻花粉粒含量極少，無需去雄，降低了育種過程中的勞動強度，節(jié)省了人力資源和時間成本，提高了育種的經濟效益。

30、5.推動遺傳工程育種發(fā)展：本發(fā)明的研究推動了水稻遺傳工程育種的發(fā)展，通過基因編輯技術精準調控水稻性狀，為作物育種帶來革命性變革，具有廣泛的應用前景。