本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)技術(shù)，尤其涉及一種驢eif2s3y基因的rna干擾片段、表達(dá)載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前，實(shí)現(xiàn)對(duì)家畜的性別控制，意義重大。動(dòng)物性別控制的意義在于：(1)提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益；(2)生產(chǎn)具有利用價(jià)值的性別的動(dòng)物(一般雌性動(dòng)物的利用價(jià)值要高于雄性動(dòng)物)；(3)避免胚胎移植過(guò)程中異性胚胎導(dǎo)致的孿生不育；(4)提高選種強(qiáng)度；(5)預(yù)防伴性遺傳病的發(fā)生等。對(duì)動(dòng)物性別控制的相關(guān)研究早在多年前就已經(jīng)開(kāi)始。動(dòng)物的性別控制(sexcontrol)是指通過(guò)對(duì)動(dòng)物的正常生殖過(guò)程進(jìn)行人為干預(yù)，使成年雌性動(dòng)物產(chǎn)出人們期望性別后代的一門(mén)生物技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)外家畜進(jìn)行性別控制的方法主要有三種：(1)分離x精子與y精子。通過(guò)x、y精子微弱的生物學(xué)差異，分離出含兩種不同染色體的精子，目前主要采用物理分離法，如采用流式細(xì)胞分離儀分離精子的準(zhǔn)確率可達(dá)到90％，但其分離速度太慢(18mil-lion/h)，且精液價(jià)格昂貴，分離后精液不耐冷凍，精子畸形率較高，因而在生產(chǎn)應(yīng)用上受到限制；(2)胚胎的性別鑒定。胚胎性別鑒定主要是通過(guò)鑒定胚胎的性別，從而對(duì)胚胎進(jìn)行人為選擇，干預(yù)出生的性別比例。早期胚胎性別鑒定方法主要有細(xì)胞學(xué)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、pcr擴(kuò)增法、雄性特異性dna探針?lè)ǖ龋珡呐咛ド锨腥〔糠旨?xì)胞而后經(jīng)冷凍、解凍會(huì)對(duì)胚胎造成一定的損害使胚胎存活率和胚胎移植的成功率下降，同時(shí)劣質(zhì)胚胎的性別鑒定成功率更低，這就制約了提供預(yù)知性別家畜胚胎的商業(yè)化進(jìn)程；(3)控制家畜受精的外部環(huán)境。家畜外部環(huán)境中的某些因素也是性別決定機(jī)制的重要條件，主要包括營(yíng)養(yǎng)、體液酸堿度、溫度、輸精時(shí)間、年齡胎次、激素水平等。但決定動(dòng)物性別的因素主要是動(dòng)物體的內(nèi)部因素，采用控制外部環(huán)境的方法來(lái)控制出生動(dòng)物性別，隨機(jī)性大，不穩(wěn)定，且不易控制。如今，隨著科學(xué)技術(shù)水平的發(fā)展，從基因水平研究性別控制已經(jīng)成為一種新的方向，同時(shí)隨著基因技術(shù)的日趨成熟，基因技術(shù)的成本也大幅下降，使其在生產(chǎn)應(yīng)用中大規(guī)模推廣成為了一種可能。

2、rna干擾(rna?interference)是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默現(xiàn)象，是通過(guò)體外人工合成雙鏈rna或體內(nèi)的雙鏈rna在細(xì)胞內(nèi)特異性降解其同源mrna，使相應(yīng)的基因沉默，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的，且具有特異、高效、易于操作等優(yōu)點(diǎn)。rna干擾并非轉(zhuǎn)基因或者基因編輯技術(shù)。

3、eif2s3y基因是y染色體短臂上編碼的蛋白翻譯第二起始因子第三亞基的序列，位于y染色體短臂的非重組區(qū)，且該區(qū)域的基因只在雄性動(dòng)物中表達(dá)。eif2s3y編碼eif2γ，eif2γ與翻譯起始密碼子met-trnaimet形成三元復(fù)合物，與特定蛋白質(zhì)的翻譯啟動(dòng)有密切關(guān)系，與y精子的發(fā)育相關(guān)。通過(guò)rna干擾技術(shù)，沉默eif2s3y基因影響y精子發(fā)育，而對(duì)x精子沒(méi)有影響，是實(shí)現(xiàn)性別控制的可行途徑。目前，已獲得授權(quán)的干擾動(dòng)物zfx/zfy基因控制性別的發(fā)明專(zhuān)利有小鼠(母)(cn?zl?201110072013.6)、小鼠(公)(cn?zl?201310053235.2)、鹿(cn?zl?201710506560.8)、驢(cn?zl?201410421472.4)、豬(cn?zl202211458361.1；cnzl201410421472.4)、奶山羊(cn?zl?202211335178.2)。eif2s3y基因與zfy基因同位于y染色體短臂，是zfy基因上游基因，與zfy基因?qū)精子的發(fā)育影響有異曲同工的作用。

4、通過(guò)上述分析，現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題及缺陷為：

5、(1)目前家畜進(jìn)行性別控制的方法中，物理分離法分離速度太慢，且精液價(jià)格昂貴，分離后精液不耐冷凍，精子畸形率較高，在生產(chǎn)應(yīng)用上受到限制。驢一次的射精量很大，精液稀薄，給物理分離法增加了難度。

6、(2)早期胚胎性別鑒定中從胚胎上切取部分細(xì)胞而后經(jīng)冷凍、解凍會(huì)對(duì)胚胎造成一定損害使胚胎存活率和胚胎移植的成功率下降，劣質(zhì)胚胎的性別鑒定成功率更低。

7、(3)目前家畜進(jìn)行性別控制的方法中，采用控制外部環(huán)境的方法來(lái)控制出生動(dòng)物性別的方法隨機(jī)性大，不穩(wěn)定，重復(fù)性差，且不易控制，因此本發(fā)明提出一種驢eif2s3y基因的rna干擾片段、表達(dá)載體及其應(yīng)用以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提出一種驢eif2s3y基因的rna干擾片段、表達(dá)載體及其應(yīng)用，在受精前有效控制了后代性別，達(dá)到了控制后代驢駒性別的目的，而且方法簡(jiǎn)單，成本低廉，易于推廣，能解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題。

2、為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種驢eif2s3y基因的rna干擾片段，所述驢eif2s3y基因的rna干擾片段的核苷酸序列為seq?id?no：1所示或seq?idno：2所示。

3、一種驢eif2s3y基因的rna干擾片段構(gòu)建得到的表達(dá)載體。

4、進(jìn)一步改進(jìn)在于：所述表達(dá)載體包含如seq?id?no：3所示或seq?id?no：4所示的序列。

5、進(jìn)一步改進(jìn)在于：所述表達(dá)載體包括pplk?gfp+puro載體，所述pplk?gfp+puro載體與所述驢eif2s3y基因的rna干擾片段連接。

6、一種驢eif2s3y基因的rna干擾片段構(gòu)建得到的表達(dá)載體在制備動(dòng)物受精前進(jìn)行性別控制用試劑中的應(yīng)用。

7、進(jìn)一步改進(jìn)在于：所述動(dòng)物受精前進(jìn)行性別控制用試劑以睪丸直接注射的方式注射至動(dòng)物體內(nèi)，用于干擾動(dòng)物y染色體上的eif2s3y基因。

8、一種驢eif2s3y基因的rna干擾片段構(gòu)建得到的表達(dá)載體在制備控制后代驢駒性別的制劑中的應(yīng)用，所述表達(dá)載體用于沉默驢生精細(xì)胞中的eif2s3y基因。

9、一種驢eif2s3y基因的rna干擾片段在制備控制后代驢駒性別的制劑中的應(yīng)用，所述驢eif2s3y基因的rna干擾片段用于沉默驢生精細(xì)胞中的eif2s3y基因。

10、一種驢eif2s3y基因的rna干擾片段在制備控制后代驢駒性別的試劑盒中的應(yīng)用。

11、一種驢eif2s3y基因的rna干擾片段構(gòu)建得到的表達(dá)載體在制備控制后代驢駒性別的試劑盒中的應(yīng)用。

12、本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明提供的eif2s3y基因負(fù)責(zé)編碼eif2γ，eif2γ與翻譯起始密碼子met-trnaimet形成三元復(fù)合物，與特定蛋白質(zhì)的翻譯啟動(dòng)有密切關(guān)系，與y精子的發(fā)育相關(guān)。

13、(2)本發(fā)明提供的rna干擾片段，對(duì)驢eif2s3y基因的表達(dá)進(jìn)行人為干擾，使y精子的生成和發(fā)育受阻，x精子不受影響，為x精子創(chuàng)造更多的受精機(jī)會(huì)，從而使子一代的母駒比例增加。本發(fā)明在受精前有效控制了后代性別，達(dá)到了控制后代驢駒性別的目的，而且方法簡(jiǎn)單，成本低廉，易于推廣。

14、(3)本發(fā)明提供的rna干擾片段，對(duì)驢eif2s3y基因的表達(dá)進(jìn)行人為干擾，使y精子的生成和發(fā)育受阻，y精子活力下降，而對(duì)x精子沒(méi)有影響，為x精子創(chuàng)造更多的受精機(jī)會(huì)，從而使子一代的母駒比例增加，達(dá)到控制后代驢駒性別的目的。本發(fā)明提供的rna干擾片段對(duì)驢eif2s3y基因有較好的沉默效應(yīng)，干擾eif2s3y基因后，后代驢駒中母駒率為73.68％。

15、該技術(shù)采用睪丸直接注射，不需要特殊昂貴儀器設(shè)備，方法簡(jiǎn)單，易于操作，成本低廉。特別是不同于分離法得到的精液只能進(jìn)行人工授精，技術(shù)要求較高，本技術(shù)可進(jìn)行自然交配、人工授精和制作凍精細(xì)管，可遠(yuǎn)距離運(yùn)輸應(yīng)用。