本發(fā)明涉及屬于化妝品檢測領域，具體涉及一種護膚品抗衰老效果多維度綜合檢測系統(tǒng)及方法。

背景技術：

1、在化妝品科技領域，特別是抗衰老護膚品的研發(fā)與功效驗證方面，已有多種專利技術提出了不同層次和角度的評估策略。例如，中國發(fā)明專利cn114807115a揭示了一種構建衰老細胞模型及評價抗衰老功效的方法，該方法通過關聯(lián)體外培養(yǎng)的不同代數(shù)衰老細胞與各年齡段人群皮膚衰老狀態(tài)，創(chuàng)建了衰老細胞模型與實際年齡之間的對應關系，從而利用這些模型進行抗衰老產(chǎn)品功效的精確模擬檢測。

2、同時，中國發(fā)明專利cn114698572a詳細闡述了“d-半乳糖誘導al斑馬魚衰老模型及評價抗衰老功效的方法”，該發(fā)明創(chuàng)新性地采用了d-半乳糖處理斑馬魚以模擬生物體衰老過程，并以此為基礎來評估抗衰老產(chǎn)品的效果。盡管如此，當前大多數(shù)抗衰老護膚品的功效評價體系仍然存在局限性，主要表現(xiàn)在過于依賴單一或少數(shù)生理學、生物化學指標上，難以全面反映出護膚品對復雜皮膚老化過程中多因素、多層次的影響。

3、鑒于此，本發(fā)明旨在提供一種更為全面且科學的多維度綜合檢測系統(tǒng)及其實驗方法，結合體外細胞模型、三維皮膚模型、分子生物學及表觀遺傳學研究，以及嚴謹?shù)呐R床試驗設計，以實現(xiàn)對護膚品抗衰老功效的立體化、多層次、全方位的精確評估，有效彌補現(xiàn)有技術中的不足，從而有力推進化妝品行業(yè)在抗衰老產(chǎn)品研發(fā)領域的技術創(chuàng)新與進步。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明需要解決的技術問題是提供一種護膚品抗衰老效果多維度綜合檢測系統(tǒng)及方法。該發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術中抗衰老護膚品功效評價體系不完善、缺乏全面性與客觀性的難題，通過構建包含體外細胞模型實驗模塊、分子生物學與細胞生物化學指標檢測模塊、組織工程三維皮膚模型實驗模塊以及臨床研究驗證模塊在內(nèi)的綜合評估體系，實現(xiàn)對護膚品在延緩或逆轉皮膚老化過程中的實際效能進行立體化、多層次、全方位的科學評測。

2、為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案如下。

3、一種護膚品抗衰老效果多維度綜合檢測系統(tǒng)，包括體外細胞模型實驗模塊和組織工程與三維皮膚模型實驗模塊，

4、所述體外細胞模型實驗模塊利用人源皮膚成纖維細胞、永生化角質形成細胞系或誘導性多能干細胞分化得到的表皮細胞模擬自然老化和光老化條件，并通過cck-8試劑盒法、mtt法、edu標記法

5、測定并比較不同處理組之間的細胞增殖能力變化；

6、所述組織工程與三維皮膚模型實驗模塊，使用具有不同年齡特征的人工皮膚模型，在模擬真實皮膚環(huán)境條件下進行形態(tài)學觀察、生化指標測量(如tewl值、乳酸脫氫酶活性)以及皮膚彈力測試，以評估護膚品在三維模型中的抗衰老性能。

7、優(yōu)選地，所述體外細胞模型實驗模塊包括劃痕愈合實驗及transwell侵襲實驗子模塊，用于評價護膚品對細胞遷移能力的影響。

8、優(yōu)選地，所述體外細胞模型實驗模塊包含分子生物學與細胞生物化學指標檢測子模塊，該模塊通過檢測抗氧化酶如超氧化物歧化酶(sod)、過氧化氫酶(cat)活性的變化，以及量化自噬相關蛋白lc3ii/i比值及p62水平，評估護膚品對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響。

9、優(yōu)選地，所述分子生物學與細胞生物化學指標檢測子模塊包括dna損傷修復機制評估單元，通過測定γh2ax表達量變化，以及測量線粒體膜電位和氧消耗率(ocr)，以反映護膚品對抗衰老效果的作用。

10、優(yōu)選地，所述體外細胞模型實驗模塊包含表觀遺傳學研究子模塊，選擇衰老相關候選基因啟動子區(qū)cpg島甲基化狀態(tài)作為檢測指標，探究護膚品是否具有調(diào)控皮膚衰老相關基因表達的能力。

11、優(yōu)選地，所述檢測系統(tǒng)包括臨床研究驗證模塊，設計并執(zhí)行一項雙盲、安慰劑對照隨機化臨床試驗，收集受試者使用護膚品后的皮膚生理參數(shù)數(shù)據(jù)及主觀感受反饋，以驗證護膚品在人體實際應用中的抗衰老效果。

12、優(yōu)選地，所述體外細胞模型實驗模塊針對不同代次細胞建立自然老化模型和光老化模型，并設定不同的紫外線劑量梯度，結合護膚品的不同濃度組合進行細致分組處理。

13、優(yōu)選地，所述檢測系統(tǒng)通過對比分析護膚品處理組與對照組在細胞活力、功能檢測、分子標志物、三維皮膚模型實驗結果及臨床試驗數(shù)據(jù)上的差異，實現(xiàn)對護膚品抗衰老效果的全方位立體評估。

14、優(yōu)選地，所述檢測系統(tǒng)通過檢測il6、il8、tnfα、tgfβ1和mmps炎癥因子與生長因子的表達變化，評估護膚品對抑制衰老相關分泌表型的影響。

15、本發(fā)明還提出了一種基于上述護膚品抗衰老效果多維度綜合檢測系統(tǒng)的綜合檢測方法，具體包括以下步驟。

16、一、體外細胞模型實驗流程：

17、1.1、細胞復蘇與培養(yǎng)

18、從液氮庫提取hdfs、hacat或ipsc分化細胞，解凍洗滌后接種于基礎培養(yǎng)基中，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)。

19、細胞傳代與老化模型建立：根據(jù)代次模擬年輕(第20-30代)、中年(第31-40代)和老年(第41-50代)皮膚狀態(tài)。設立光老化模型，使用uva/uvb不同劑量(50mj/cm2至500mj/cm2)連續(xù)照射，構建對照組a及紫外線照射組b1-b3、c1-c3。

20、護膚品處理準備與應用：無菌稀釋護膚品至預設濃度梯度(0.1％-2.0％)，在不引發(fā)毒性反應前提下進行細胞暴露試驗。設置實驗組合包括自然老化對照組dn(n＝1,2,3代表各年齡段)以及與各種紫外線照射條件組合的護膚品處理組e1-e4，每組至少三個生物學重復。

21、細胞暴露與樣本收集：將含護膚品的培養(yǎng)基應用于對應細胞并孵育n小時。結束后收集細胞樣本，用于形態(tài)觀察、功能檢測和分子水平分析。

22、1.2、細胞活力及功能檢測

23、細胞增殖評估：利用cck8、mtt或edu標記法測定細胞增殖速率，并通過熒光標記細胞比例反映各組(護膚品處理組、紫外線照射組、自然老化對照組)的增殖能力，分析護膚品對細胞增殖及抗衰老效果的影響。

24、遷移能力評價：借助劃痕愈合實驗和transwell侵襲實驗觀察護膚品對細胞遷移的作用。設定時間點如0h、24h、48h，記錄劃痕愈合進程以對比不同條件下(包括年齡階段與紫外線照射情況)護膚品處理后細胞遷移能力的變化，結合形態(tài)學和分子水平結果解析護膚品可能的促進或抑制作用及其機制。

25、細胞凋亡分析：采用流式細胞術annexinv/pi雙染色或tunel染色方法量化護膚品處理后的細胞凋亡率變化。比較不同濃度護膚品處理、紫外線照射及自然老化狀態(tài)下細胞的凋亡狀況，以此評估護膚品對細胞凋亡的調(diào)控及其潛在抗衰老效應。

26、1.3、分子生物學與細胞生物化學指標檢測

27、1.3.1抗氧化酶活性測定

28、測定超氧化物歧化酶(sod)和過氧化氫酶(cat)活性，以評估護膚品的抗氧化潛力。實驗流程包括：完成細胞處理后，在設定時間點收集各組細胞并進行裂解，使用pbs清洗及含有蛋白酶抑制劑的緩沖液提取總蛋白。通過bca法測定蛋白濃度以標準化酶活性。

29、sod活性檢測中，利用檢測試劑盒在特定條件下反應，并通過分光光度計測定超氧陰離子的變化，計算單位蛋白質量的sod活性。

30、cat活性檢測時，同樣使用試劑盒與含有過氧化氫的體系反應，監(jiān)測水生成速率，從而確定單位蛋白質量的cat活性。

31、匯總數(shù)據(jù)，對比不同護膚品處理組、對照組(紫外線照射、自然老化)下細胞內(nèi)sod和cat活性變化，分析護膚品對這兩種抗氧化酶活性的影響，以揭示其潛在的抗氧化作用。

32、1.3.2β半乳糖苷酶活性測定

33、通過定量saβgal染色，檢測細胞內(nèi)衰老相關β半乳糖苷酶活性。實驗流程包括：48小時暴露后收集并固定細胞于4％多聚甲醛中，隨后進行x-gal染色(按試劑盒說明配制并在37℃孵育16-20小時)。次日顯微鏡觀察記錄各組細胞的藍色沉淀，并利用imagej軟件分析至少10個視野的照片，計算sa-β-gal陽性細胞比例。匯總所有數(shù)據(jù)，比較護膚品處理組與對照組(自然老化、紫外線照射等)的平均陽性細胞比例及標準誤差，若護膚品組比例顯著較低，則表明其具有抗衰老效果，可有效抑制β半乳糖苷酶活性以延緩細胞衰老。

34、1.3.3線粒體功能評估：

35、jc-1染色法測定線粒體膜電位

36、其原理基于jc-1在不同膜電位下的熒光顏色變化，高膜電位下呈現(xiàn)紅色，低膜電位下為綠色。應用于護膚品抗衰老功效研究時，通過將5-10μm的jc-1加入培養(yǎng)細胞并孵育，隨后清洗并利用熒光顯微鏡或流式細胞儀觀察紅綠熒光比值變化，以此分析護膚品維持或增強線粒體膜電位的能力，并據(jù)此判斷其抗衰效果。

37、1.3.4測量氧消耗率(ocr)

38、測量氧消耗率(ocr)以評估護膚品在不同老化模型和紫外線照射條件下的細胞能量代謝改善作用。

39、經(jīng)護膚品處理的細胞群體若基礎ocr值提升，則可能表明護膚品有助于增強細胞能量產(chǎn)生并延緩衰老，特別是當老齡細胞ocr水平趨近年輕對照組時，可視為具有抗氧化與新陳代謝改善的抗衰老特性。另外，若護膚品能夠有效抑制因紫外線照射引起的ocr降低或恢復至未照射水平，則證明該產(chǎn)品具備光防護及修復線粒體功能的效果，從而展現(xiàn)其在抗光老化領域的應用潛力。

40、1.3.5自噬相關蛋白表達

41、通過測定自噬相關蛋白lc3ii/i比值和p62水平，研究護膚品對細胞自噬調(diào)節(jié)及對抗老化損傷的能力。根據(jù)實驗方案處理各組細胞后，在指定時間點收集并裂解細胞提取蛋白質，使用bca法定量并制備樣本進行western?blot分析。通過對sds-page電泳后的pvdf膜進行一抗、二抗孵育及化學發(fā)光檢測，量化lc3ii/i比值與p62表達變化。

42、護膚品若能提升lc3ii/i比值并降低p62水平，則表明其可能有效激活細胞自噬機制以應對自然老化和光老化造成的皮膚細胞損傷。對比未經(jīng)干預的對照組，評估護膚品處理后自噬活性的變化趨勢，以此判斷其在抗衰老方面的效果。

43、1.3.6sasp因子檢測

44、通過elisa或qrt-pcr技術檢測il6、il8、tnfα等炎癥因子和生長因子表達變化，以評估護膚品對衰老相關分泌表型(sasp)因子的抑制效果及抗衰老性能。實驗步驟包括：

45、根據(jù)既定方案收集各組細胞樣本，涵蓋自然老化對照組dn、不同紫外線照射組以及護膚品處理組e1至e4，在48小時后用pbs洗滌并提取rna和/或蛋白質。

46、對rna進行定量，并經(jīng)逆轉錄為cdna用于后續(xù)mrna分析。

47、使用elisa方法測定細胞培養(yǎng)上清中il6、il8、tnfα等蛋白質含量。

48、數(shù)據(jù)分析時，對比未干預的自然老化和紫外線照射對照組，觀察護膚品處理后各組別中il6、il8、tnfα等sasp因子在mrna和/或蛋白質水平上的表達變化，以此評價護膚品在抗衰老方面的實際作用。

49、1.3.7皮膚結構成分分析

50、通過western?blot或elisa技術檢測膠原蛋白i、iii和層粘連蛋白等皮膚結構蛋白在各實驗組(自然老化對照組dn、紫外線照射對照組b1-c3以及護膚品處理組e1-e4)中的合成與降解情況。實驗流程包括細胞裂解、蛋白定量、elisa操作及信號檢測，通過對比分析各組間目標蛋白濃度變化，以評估護膚品對維持和改善皮膚結構完整性的效果。

51、1.3.8dna損傷修復能力評價

52、免疫熒光法檢測γh2ax表達，評估護膚品對皮膚細胞dna損傷及修復效果。γh2ax作為dna雙鏈斷裂標志物，在損傷部位形成可觀察的焦點。在抗衰老研究中，通過對比不同組別(自然老化對照組dn、紫外線照射對照組b1至c3和護膚品處理組e1至e4)細胞中γh2ax表達量變化，判斷護膚品對dna保護與修復能力的影響。實驗流程包括：樣本固定、穿透處理，接著進行γh2ax抗體孵育及熒光標記二抗結合，使用熒光顯微鏡觀察并采集圖像。通過分析軟件計算每個細胞內(nèi)γh2ax斑點數(shù)量或平均熒光強度，以衡量dna損傷程度。護膚品處理后若能顯著降低γh2ax表達，則顯示其具有潛在的抗衰老作用，有助于維護dna完整性。

53、1.4表觀遺傳學研究

54、dna甲基化檢測

55、衰老過程中，dna甲基化是調(diào)控基因表達的關鍵機制。護膚品若能降低衰老相關基因啟動子區(qū)cpg島的甲基化水平，可能通過激活這些基因的正常表達以維護皮膚健康、延緩衰老。實驗中，提取并處理不同條件下的細胞樣本dna，利用亞硫酸氫鹽轉化法富集甲基化位點，采用高通量測序技術對比分析護膚品使用前后特定基因cpg島甲基化狀態(tài)變化。當護膚品使抗衰基因甲基化降低或促衰基因甲基化升高時，表明其具有調(diào)節(jié)表觀遺傳學標志物的能力，并表現(xiàn)出抗衰老效果。通過此方法評估護膚品對皮膚老化影響及潛在作用機制。

56、二、組織工程與三維皮膚模型實驗

57、為了精確評估護膚品的抗衰老效果，選擇具有生理相關性的商業(yè)化三維重建人皮膚模型(如epiderm、skinethic等)，并訂購不同年齡階段(年輕與老齡)及基礎對照模型。在無菌環(huán)境下，將待測護膚品按預設濃度梯度稀釋后進行處理，連續(xù)孵育7至14天。實驗設立空白對照組和陽性對照組，通過觀察三維皮膚模型形態(tài)變化(表皮厚度、真皮結構完整性和角質層排列)以及生化指標分析(如乳酸脫氫酶活性、經(jīng)皮水分流失率和膠原蛋白、彈性纖維等表達量)來評價護膚品對皮膚老化的影響。

58、綜合各項參數(shù)，判斷護膚品在維持或改善皮膚厚度、屏障功能、真皮結構穩(wěn)定、促進膠原合成及增強皮膚彈性和保水能力等方面的作用機制及其實際抗衰老效能。

59、三、臨床研究

60、設計一項為期4-24周、雙盲、安慰劑對照隨機臨床試驗，研究新護膚品對中老年皮膚老化癥狀改善的效果，采用皮膚彩超檢測。計劃招募n名40-60歲健康成人，具有自然衰老跡象，通過嚴格篩選標準后按1:1比例分配至護膚品或安慰劑組。

61、受試者需滿足年齡要求、無嚴重疾病和過敏史，同意全程配合并接受皮膚彩超檢查。排除近期使用過抗衰老產(chǎn)品、藥物或有醫(yī)療植入物等特殊情況。

62、隨機分組后，受試者進行左右臉對照使用待測護膚品與安慰劑。

63、數(shù)據(jù)收集涵蓋基線數(shù)據(jù)采集及隨訪觀察?；€階段通過高分辨率面部照片分析、生物物理測量(如tewl值、皮膚導電性測試、皮膚彈力測量)以及專家評分系統(tǒng)全面評估皮膚狀態(tài)。隨訪期間重復上述檢測，并收集產(chǎn)品使用感受及不良反應信息。

64、由于采用了以上技術方案，本發(fā)明所取得技術進步如下。

65、本發(fā)明的體外細胞模型實驗模塊，采用人源皮膚成纖維細胞、永生化角質形成細胞系或誘導性多能干細胞分化得到的表皮細胞作為研究對象，模擬自然老化和光老化條件，具體包括但不限于細胞活力測定、細胞增殖能力評估、細胞遷移與凋亡分析、抗氧化酶活性檢測以及線粒體功能狀態(tài)評估等環(huán)節(jié)，以反映護膚品對皮膚細胞生理功能的影響。

66、本發(fā)明的分子生物學與細胞生物化學指標檢測子模塊，能夠定量分析護膚品處理前后膠原蛋白i/iii、彈性纖維和層粘連蛋白等關鍵皮膚結構成分含量的變化，并檢測γh2ax表達量，評估護膚品對細胞dna損傷修復機制的作用。此外，針對細胞內(nèi)部自噬相關蛋白以及多種衰老相關分泌表型(sasp)的關鍵組成部分進行rna或蛋白質水平的詳盡分析。這些關鍵成分包括但不限于il6、il8、tnfα、tgfβ1和mmps等炎癥因子與生長因子。通過這一系列精密檢測，旨在揭示護膚品對維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的具體影響機制，從而全面評估其在抗衰老領域的功效表現(xiàn)。

67、本發(fā)明的組織工程與三維皮膚模型實驗模塊，使用具有不同年齡特征的人工皮膚模型，在模擬真實皮膚環(huán)境條件下進行形態(tài)學觀察、生化指標測量，如tewl值、乳酸脫氫酶活性等，以及皮膚彈力測試等，從而更貼近人體實際應用環(huán)境地評估護膚品的抗衰老性能。

68、將上述綜合檢測系統(tǒng)應用于嚴謹設計的臨床研究階段，通過雙盲、安慰劑對照隨機化臨床試驗，收集受試者的皮膚生理參數(shù)數(shù)據(jù)以及主觀感受反饋，從臨床角度驗證護膚品在人體實際使用條件下的抗衰老效果。

69、本發(fā)明不僅能夠準確、客觀地評估護膚品的抗衰老效果，而且有助于化妝品企業(yè)優(yōu)化產(chǎn)品配方、提高產(chǎn)品質量和市場競爭力，同時也有利于消費者選擇更適合自己的抗衰老護膚產(chǎn)品，從而推動整個化妝品行業(yè)的健康發(fā)展和技術進步。