本發(fā)明屬于生殖醫(yī)學領(lǐng)域，具體涉及一種體外人卵巢顆粒細胞泛凋亡模型及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、多囊卵巢綜合征(polycystic?ovarian?syndrome,pcos)是育齡期婦女最常見的生殖內(nèi)分泌紊亂性疾病，為引發(fā)排卵障礙性不孕的主要病因之一，其發(fā)病率在生育期婦女中高達15％[1]。是一種高度異質(zhì)、病因復(fù)雜的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，發(fā)病機制至今不明。探索其發(fā)病的分子機制及致病機理對未來精準地選擇個體化治療方案十分必要。

2、美國學者malireddi于2019年首次提出一種全新的細胞程序性死亡(programmedcell?death,pcd)方式，即泛凋亡(panoptosis)。panoptosis具有細胞焦亡、凋亡和壞死性凋亡的關(guān)鍵特征，但不能用這三種pcd途徑中的任何一種單獨解釋[2]。panoptosis受到上游感受器和分子信號的級聯(lián)調(diào)控，這些傳感器和級聯(lián)信號能提供“分子支架”，促進焦亡(如nlrp3、asc和caspase1)、凋亡(caspase3/8)和壞死性凋亡(ripk3、ripk1、mlkl)所需的蛋白和分子進行耦聯(lián)結(jié)合，組裝為多聚體復(fù)合物，即panoptosis小體(panoptosome)[3,4]。其可作為三種pcd途徑啟動的“總開關(guān)”和下游分子的激活平臺[5]。迄今為止，已明確的panoptosis上游感受器分子有四種，包括z-dna結(jié)合蛋白1(zbp1)、受體相互作用蛋白激酶1(ripk1)、黑色素瘤缺乏因子2(aim2)和nod樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白12(nlrp12)。它們可響應(yīng)特定刺激而觸發(fā)相應(yīng)panoptosome組裝，形成四種具有不同傳感器和調(diào)節(jié)因子的泛凋亡小體即zbp1-panoptosome、aim2-panoptosome、ripk1-panoptosome以及nlrp12-panoptosome[6,7,8,9]。

3、研究發(fā)現(xiàn)，dhea誘導(dǎo)的pcos小鼠血清中l(wèi)ps增加，并伴有血清和卵巢中ifn-γ升高，通過雌激素合成功能障礙和顆粒細胞凋亡在pcos發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[10]。申請人前期研究首次發(fā)現(xiàn)pcos患者顆粒細胞中ifn-γ表達水平增加并存在panoptosis，其為pcos的重要病理機制之一。

4、目前，尚無顆粒細胞泛凋亡模型。因此，構(gòu)建一種體外人卵巢顆粒細胞panoptosis模型，有助于進一步深入研究panoptosis在pcos病理機制中的作用，這對于pcos病理機制的研究無疑是有重大意義的。

5、參考文獻：

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技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于目前pcos發(fā)病機制尚未完全明確，而panoptosis是pcos的重要病理機制之一。本發(fā)明的目的在于提供一種體外人卵巢顆粒細胞panoptosis模型及其構(gòu)建方法，為進一步深入研究卵巢顆粒細胞panoptosis在pcos發(fā)病機制中的作用搭建一個良好的基礎(chǔ)。

2、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一方面，提供一種體外人卵巢顆粒細胞panoptosis模型的構(gòu)建方法，其包括以下步驟：經(jīng)饑餓處理的人卵巢顆粒細胞使用含lps、ifn-γ的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，得到人卵巢顆粒細胞panoptosis模型。

4、進一步地，所述的體外人卵巢顆粒細胞panoptosis模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

5、(1)對數(shù)生長期的人卵巢顆粒細胞用含0.5％-5％血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24-72h；

6、(2)經(jīng)饑餓培養(yǎng)的人卵巢顆粒細胞使用含lps、ifn-γ和10％-20％血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12-24h，得到人卵巢顆粒細胞panoptosis模型。

7、所述的人卵巢顆粒細胞優(yōu)選為kgn細胞。所述的培養(yǎng)基優(yōu)選為dmem/f12完全培養(yǎng)基。所述的lps的濃度優(yōu)選為0.2ng/μl-1ng/μl，所述的ifn-γ的濃度優(yōu)選為100ng/ml-500ng/ml。

8、步驟(1)中，所述的血清含量優(yōu)選為2％，培養(yǎng)的時間優(yōu)選為24h。

9、步驟(2)中，所述的lps含量為1ng/μl，所述的ifn-γ的含量為100ng/ml，所述的血清含量優(yōu)選為10％，培養(yǎng)的時間優(yōu)選為24h。

10、本發(fā)明的第二方面，提供了一種由上述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的人卵巢顆粒細胞panoptosis模型，該細胞模型同時發(fā)生凋亡、焦亡、壞死性凋亡等panoptosis關(guān)鍵特征。

11、本發(fā)明的第三方面，提供一種上述的人卵巢顆粒細胞panoptosis模型作為pcos病理機制研究的細胞模型的應(yīng)用。

12、本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：本發(fā)明首次提供了一種體外人卵巢顆粒細胞panoptosis模型及其構(gòu)建方法，該細胞模型同時存在凋亡、焦亡、壞死性凋亡等panoptosis關(guān)鍵特征。該細胞模型具體表現(xiàn)為細胞模型中焦亡相關(guān)的nlrp3、il-1β、caspase1，凋亡相關(guān)的caspase3，壞死性凋亡相關(guān)的mlkl?mrna表達水平增加，焦亡相關(guān)的cleaved-caspase1、n-gsdmd，凋亡相關(guān)的cleaved-caspase3，壞死性凋亡相關(guān)的p-mlkl蛋白水平增加，細胞培養(yǎng)基上清中焦亡相關(guān)因子il-1β的分泌水平增加，細胞模型中panoptosis上游感受器分子aim2?mrna和蛋白表達水平增加。該細胞模型為進一步深入研究panoptosis對pcos的致病機制搭建了良好的基礎(chǔ)。