本發(fā)明屬于優(yōu)化編碼基因，具體地涉及一種重組人i型膠原蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、膠原是細胞外基質(zhì)的主要組成成分，是動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)，約占總蛋白的30%。目前在脊椎動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)至少28種膠原，它們具有組織分布特異性，是與生物體組織器官的形成、衰老和疾病有關(guān)的功能性蛋白。按照膠原是否能形成纖維進行分類，可將所有膠原分為成纖維膠原（fibril-forming?collagen）和非成纖維膠原（non-fibril-forming?collagen）兩大類，其中成纖維膠原包括i、ii、iii、v、xi、xxiv和xxvii型膠原。i型膠原是最普遍存在的膠原，約占動物體內(nèi)膠原總量的90%，占總蛋白質(zhì)量的將近20%。人i型膠原是由αl(i)和α2(i)兩種不同α鏈構(gòu)成的異相三聚體[αl(i)]2α2(i)。

2、i型膠原具有優(yōu)良的止血和組織修復(fù)能力，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、美容等領(lǐng)域。i型膠原主要采用動物提取的方式獲得。但是動物提取膠原存在批間一致性差、水溶性差、存在病毒傳播風(fēng)險等問題。通過重組表達的方式獲得重組膠原能夠很好地解決上述問題。膠原蛋白的重組表達一般采用全長表達、片段表達和小片段重復(fù)的幾種方式。全長表達比較困難，一般表達量很低，難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)；而片段和小片段重復(fù)較容易表達，且可篩選到高表達菌株，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。但是并不是任意隨機的片段就可以實現(xiàn)表達，大多序列的表達量很低，或者根本不表達。因此，重組膠原序列的設(shè)計是重組膠原制備的關(guān)鍵。

3、有鑒于此，找到一種能夠高表達，并且生物學(xué)性能優(yōu)良的重組i型膠原蛋白序列將具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明通過不同的序列設(shè)計和篩選工作，提供一種高表達，并具有良好細胞活性的重組人i型膠原蛋白，并同時提供其制備方法和應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明一方面提供了一種重組人i型膠原蛋白，所述重組膠原蛋白包含如下特征的一種或多種：

4、（1）其氨基酸序列如seq?id?no.1所示，具體如下：

5、mhhhhhhgpsgargergfpgergvqgppgpagprgangapgndgakgdagapgapgsqgapglqgmpgergaaglpgpkgdrgdagpgpsgargergfpgergvqgppgpagprgangapgndgakgdagapgapgsqgapglqgmpgergaaglpgpkgdrgdagpgpsgargergfpgergvqgppgpagprgangapgndgakgdagapgapgsqgapglqgmpgergaaglpgpkgdrgdagpgpsgargergfpgergvqgppgpagprgangapgndgakgdagapgapgsqgapglqgmpgergaaglpgpkgdrgdagp；

6、（2）其氨基酸序列如在seq?id?no.1的基礎(chǔ)上取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸修改后的氨基酸序列；

7、（3）與seq?idno:1所示氨基酸序列具有大于80％同一性的氨基酸序列。

8、另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼上述重組人i型膠原蛋白的核酸，所述重組人i型膠原蛋白的核苷酸序列包含如下特征中的一種或多種：

9、（1）其核苷酸序列如seq?id?no.2所示，具體如下：

10、atgggggtaaaaggagaagctggtctacccggaaccccgggtccaacgggtccggcaggtcagaaaggcgaaccgggttctgatggtatcccgggcagcgcaggcgaaaagggcgagccgggcctcccgggacgcggtttcccgggtttcccgggcgcgaaaggcgacaaaggcagcaagggcgaggtgggcttcgacggtcgtaatggtgagaagggtgaaaccggtgcgcctggtctgaaaggcgagaatggcttgccgggcgagaacggcgcgccgggcccgatgggtccgcgtggtgcgccaggtgagcgcggtagaccgggccttccgggcgctgccggcgcgcgtggcggggcgggctccctgggtgccggtggcgcgtttggtgaagcagcgggtgaccgtggtccgtacggcaccgatattggtccgggcggtggttatggtgccgctgctgaaggtggtatgtacgcgggaaacggcggtttgctgggtgcggattttgctggcgacctggattataacgaactggcacatcatcaccaccaccatcactaa。

11、（2）對（1）進行同義密碼子替換得到的任意一種核苷酸序列。

12、再一方面，本發(fā)明提供了一種載體，所述載體含有seq?id?no.2所示的核苷酸序列。

13、再一方面，本發(fā)明提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有上述載體。

14、再一方面，本發(fā)明提供了上述重組人i型膠原蛋白的制備方法，具體包括如下步驟：

15、（1）蛋白序列設(shè)計

16、根據(jù)人i型膠原蛋白，設(shè)計如seq?no.1所示的氨基酸序列；

17、（2）基因設(shè)計和合成

18、根據(jù)步驟（1）中所述的重組人i型膠原蛋白的氨基酸序列反向設(shè)計編碼核酸序列，并進行密碼子優(yōu)化，得到編碼重組人i型膠原蛋白的核苷酸序列，然后進行基因合成，得到編碼所述重組人i型膠原蛋白片段的核酸片段；

19、（3）表達載體的構(gòu)建：

20、通過ndei和ⅹhoi多克隆位點連接到pet30a(+)質(zhì)粒上，得到表達質(zhì)粒；

21、（4）表達菌株的構(gòu)建和篩選：

22、將步驟（3）中所述質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入宿主細胞感受態(tài)中，涂布在含有卡那霉素的抗性板上，培養(yǎng)，獲得表達菌株；

23、（5）誘導(dǎo)表達

24、對步驟（4）得到的表達菌株進行誘導(dǎo)表達，收集菌液；

25、（6）純化

26、對步驟（5）收集的菌液進行菌體破碎和離心、親和層析、離子交換層析、脫鹽、凍干后得到重組人i型膠原蛋白凍干品。

27、作為本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，所述宿主細胞為大腸桿菌bl21(de3)。

28、再一方面，本發(fā)明提供了一種上述重組人i型膠原蛋白在醫(yī)療器械領(lǐng)域的用途。

29、采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：

30、（1）本發(fā)明提供的重組人i型膠原蛋白具有[a1]?形成凝膠。

31、（2）本發(fā)明提供的重組人i型膠原蛋白，經(jīng)實驗驗證，具有較佳的促細胞遷移、促細胞增殖和促細胞粘附性能。

32、（3）本發(fā)明的重組人i型膠原蛋白制備方法產(chǎn)量高，適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)特征：

1.一種水溶性重組人i型膠原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.一種編碼權(quán)利要求1所述的重組人i型膠原蛋白的核酸，其特征在于，所述重組人i型膠原蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3.一種載體，其特征在于，所述載體含有如權(quán)利要求2所述的核酸。

4.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有如權(quán)利要求3所述的載體。

5.一種制備如權(quán)利要求1所述的水溶性重組人i型膠原蛋白的制備方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌bl21(de3)。

7.一種如權(quán)利要求1所述的水溶性重組人i型膠原蛋白在制備醫(yī)藥產(chǎn)品、醫(yī)療器械、生物材料、組織工程、化妝品中的用途。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于優(yōu)化編碼基因技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種重組人I型膠原蛋白及其制備方法和應(yīng)用，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明所提供的重組I型膠原蛋白表達量較高，具有較佳的促細胞遷移、促細胞增殖和促細胞粘附性能，安全性高，能廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、醫(yī)療器械、生物材料、組織工程、化妝品等領(lǐng)域。

技術(shù)研發(fā)人員：徐蘭舉,齊磊,于月欣
受保護的技術(shù)使用者：河北納科生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9