本公開總體上涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)基配方以及用于在培養(yǎng)中的細(xì)胞的病毒繁殖和增殖的方法，特別是用于生產(chǎn)疫苗。具體來(lái)講，本公開提供了有助于促進(jìn)用于禽類疫苗生產(chǎn)的初代或次代細(xì)胞培養(yǎng)物體外培養(yǎng)的無(wú)血清的確定的細(xì)胞培養(yǎng)基配方，其中生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含素食(vegetarian?diet)。此外，本公開提供了使用無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行在培養(yǎng)中的細(xì)胞的病毒繁殖和增殖的方法。本公開的培養(yǎng)基特別適合于成纖維細(xì)胞，例如雞胚成纖維細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)。

背景技術(shù)：

1、大多數(shù)病毒疫苗是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)的。在基于細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗生產(chǎn)中，病毒產(chǎn)量至關(guān)重要，不僅因?yàn)楦叩牟《井a(chǎn)量使得更多的疫苗生產(chǎn)更快，而且因?yàn)檫@對(duì)于確定基于細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗生產(chǎn)方法的經(jīng)濟(jì)可行性是重要的。

2、用于病毒/疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞可以是細(xì)胞系或原代動(dòng)物。雞胚成纖維細(xì)胞(cef細(xì)胞)是用于病毒生產(chǎn)的原代細(xì)胞的一個(gè)例子。減毒病毒通常在cef細(xì)胞培養(yǎng)中繁殖。體外細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖需要培養(yǎng)條件，其包括可以支持細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的培養(yǎng)基。一般來(lái)說(shuō)，用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞所常用的細(xì)胞培養(yǎng)基包含富鹽溶液，其含有維生素、氨基酸、必需微量元素和糖。另外，細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)激素、酶和生物活性蛋白，通常以動(dòng)物血來(lái)源的血清或可替代地從動(dòng)物血來(lái)源的血清中分離出的蛋白質(zhì)組分的形式作為補(bǔ)充劑而添加。

3、動(dòng)物血來(lái)源的血清制品的實(shí)例是胎牛血清、雞血清、馬血清和豬血清。這些血清來(lái)源于分級(jí)分離(fractionated)的血液，其中已經(jīng)去除了紅細(xì)胞和白細(xì)胞。原代細(xì)胞，比如cef細(xì)胞甚至比細(xì)胞系更依賴于動(dòng)物血清來(lái)源。因此，原代細(xì)胞通常在含有5％至10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，多數(shù)情況下該血清為胎牛血清(fcs)。

4、動(dòng)物血來(lái)源的血清制品可能含有外源性致病因子，例如病毒或朊蛋白。這些病原體可能會(huì)傳播給待用疫苗或任何其他在補(bǔ)充有血清的細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)的藥物制品來(lái)治療或接種的動(dòng)物/人類，由于該潛在風(fēng)險(xiǎn)，由此也引發(fā)了使用血清的安全擔(dān)憂。常用的牛血清補(bǔ)充劑例證了這些擔(dān)憂，其中與其使用相關(guān)的許多主要問(wèn)題/風(fēng)險(xiǎn)之一是將引起牛海綿狀腦病(bovine?spongiform?encephalopathy，bse)的因子傳播給與從使用牛血清補(bǔ)充劑的細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)的制品/疫苗接觸的動(dòng)物/人類的可能性。因此，使用無(wú)血清培養(yǎng)基是有優(yōu)勢(shì)的，以去除血清中的污染物，比如病毒或致病性朊蛋白，其一定不能留在例如重組蛋白或病毒疫苗載體的最終制品中。

5、考慮到與在細(xì)胞培養(yǎng)中使用動(dòng)物血清相關(guān)的可能風(fēng)險(xiǎn)，開發(fā)不含任何動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)或肽的無(wú)血清培養(yǎng)基顯然會(huì)是優(yōu)選。具體來(lái)說(shuō)，用從非動(dòng)物來(lái)源分離的蛋白質(zhì)、肽或脂類來(lái)替代動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)或肽，將減少與血清相關(guān)的安全擔(dān)憂。

6、因此，仍然需要改善無(wú)血清疫苗生產(chǎn)的策略。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、本公開提供了無(wú)血清培養(yǎng)基，其能培養(yǎng)大范圍的懸浮和單層細(xì)胞，同時(shí)能夠支持禽類疫苗生產(chǎn)。

2、本公開提供了無(wú)血清培養(yǎng)基，其包含各種無(wú)機(jī)鹽、碳水化合物、氨基酸、緩沖劑、維生素和化合物以模擬自然細(xì)胞環(huán)境。如果需要，氨基酸、碳水化合物、鹽類、維生素和化合物中的許多可從不含蛋白質(zhì)或生長(zhǎng)促進(jìn)劑的市售合成培養(yǎng)基中獲得，例如emem或dmem。

3、本公開提供了無(wú)血清培養(yǎng)基，其包含源自植物或蔬菜來(lái)源的胰蛋白胨(肽和蛋白胨)。

4、此外，本公開還提供了使用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞系用于病毒繁殖和增殖的方法。

5、發(fā)明詳述

6、本公開的一個(gè)目的是開發(fā)一種無(wú)血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基能培養(yǎng)大范圍的懸浮和單層細(xì)胞，同時(shí)能支持禽類疫苗生產(chǎn)。

7、本公開的培養(yǎng)基還包括各種無(wú)機(jī)鹽、碳水化合物、氨基酸、緩沖劑、維生素和化合物以模擬自然細(xì)胞環(huán)境。如果需要，氨基酸、碳水化合物、鹽類、維生素和化合物中的許多可從不含蛋白質(zhì)或生長(zhǎng)促進(jìn)劑的市售合成培養(yǎng)基中獲得，例如emem或dmem。除了上述的血清替代品之外，還可以向培養(yǎng)基中添加各種額外的氨基酸、鹽類、碳水化合物、維生素和化合物，比如酵母提取物和抗生素，以組成本公開的完全無(wú)血清培養(yǎng)基。

8、本公開的另一個(gè)目的涉及使用無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞系用于病毒繁殖和增殖的過(guò)程。無(wú)血清培養(yǎng)基包括源自植物或蔬菜來(lái)源的胰蛋白胨(肽和蛋白胨)。

9、本公開提供了一種在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代細(xì)胞，特別是原代禽類細(xì)胞的方法，以及在無(wú)血清條件下在原代細(xì)胞中生產(chǎn)病毒的方法。用于培養(yǎng)原代細(xì)胞的本發(fā)明方法的特征可在于在補(bǔ)充有源自植物或蔬菜來(lái)源的肽和蛋白胨的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。

10、注意，在本公開中，尤其是在權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)比如“包含”、“包含”、“包含”等可以意為“包括”、“包括”、“包括”等。術(shù)語(yǔ)“基本上由...組成”和“基本上由...組成”允許存在未明確表述的元件，但排除現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的或影響本發(fā)明的基礎(chǔ)的或新型的特征的元件。

11、除非明確說(shuō)明，技術(shù)術(shù)語(yǔ)按照慣例使用。分子生物學(xué)中常見(jiàn)術(shù)語(yǔ)的定義見(jiàn)于牛津大學(xué)出版社1994年出版的由benjamin?lewin編寫的《genes?v》(isbn?0-19-854287-9)，blackwell?science?ltd?1994年出版的由kendrew等人編寫的《the?encyclopedia?ofmolecular?biology》(isbn?0-632-02182-9)以及由vch出版商1995年出版的由roberta.meyers編寫的《molecular?biology?and?biotechnology:a?comprehensive?deskreference》(isbn?1-56081-569-8)。

12、除非上下文另有明確說(shuō)明，單數(shù)名詞“一”、“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)指代。類似地，除非上下文另有明確說(shuō)明，“或”一詞旨在包括“和”。“或”一詞指特定列表中的任何一個(gè)成員，也包括該列表中成員的任何組合。

13、本文中使用的術(shù)語(yǔ)“原代細(xì)胞”是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。不受限于以下定義，術(shù)語(yǔ)“原代細(xì)胞”可以指已經(jīng)從動(dòng)物或人類組織、器官或生物體中新鮮分離的細(xì)胞，其中細(xì)胞不能連續(xù)且無(wú)限地復(fù)制和分裂。通常情況下，原代細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中分裂少于100次，經(jīng)常是少于50次，經(jīng)常是少于25次。因此，原代細(xì)胞沒(méi)有經(jīng)歷永生化事件。原代細(xì)胞的例子是動(dòng)物成纖維細(xì)胞，例如但不限于雞胚成纖維細(xì)胞(cef細(xì)胞)。分離原代細(xì)胞的方法是眾所周知的。通常情況下，原代細(xì)胞培養(yǎng)物是通過(guò)使用蛋白酶處理組織、器官或胚胎以獲得單細(xì)胞而直接源自組織、器官或胚胎的。

14、本公開的方法不局限于形成單層的細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)替代實(shí)施方案，本公開中的方法可以用于所有其他類型的原代細(xì)胞，比如自然生長(zhǎng)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞或其他類型的血細(xì)胞)或自然將作為貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)但已經(jīng)適應(yīng)在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞。

15、如下所示，細(xì)胞也可以用于可作為疫苗而有用的病毒的無(wú)血清擴(kuò)增。

16、一般來(lái)說(shuō)，用作疫苗的病毒，包括野生型病毒、減毒病毒和重組病毒，是在含血清的條件下生長(zhǎng)和擴(kuò)增的。然而如上所述，存在血清含有致病因子可能傳播給用疫苗治療或接種的動(dòng)物/人類的潛在風(fēng)險(xiǎn)。為了減少疫苗中污染物的風(fēng)險(xiǎn)，本公開的另一個(gè)方面是在無(wú)血清條件下傳代和/或培養(yǎng)那些前期已經(jīng)在含血清條件下增殖并計(jì)劃用作疫苗的病毒。

17、出乎意料的是，自然作為貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的原代細(xì)胞可以有效地附著于細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面，而不形成不可接受量的聚集體，并且可以在不存在血清的情況下在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，因?yàn)橥ǔＵJ(rèn)為原代細(xì)胞依賴于血清中包含的多種不同因子和組分。此外，通常認(rèn)為在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，貼壁細(xì)胞形成不存活的聚集體，其不附著于細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面。由此，出乎意料的是，足以用源自植物或蔬菜來(lái)源的肽和蛋白胨補(bǔ)充無(wú)血清培養(yǎng)基以獲得貼壁原代細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)。此外，還出乎意料的是，在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)的原代細(xì)胞可以用根據(jù)本公開的方法中所用的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

18、特別地，令人驚訝的是，原代禽類細(xì)胞，例如本發(fā)明的雞胚成纖維細(xì)胞(cef)，在補(bǔ)充有源自植物或蔬菜來(lái)源的肽和蛋白胨的無(wú)血清培養(yǎng)基中可被培養(yǎng)以附著在細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面，而不形成不可接受量的細(xì)胞聚集體。然而，人們理解在不包含血清中發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子或附著因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中禽類細(xì)胞生長(zhǎng)不利，即令人意想不到的是，通過(guò)在無(wú)血清培養(yǎng)基中補(bǔ)充來(lái)自植物或蔬菜來(lái)源的肽和蛋白胨，可以顯著改善原代禽類細(xì)胞較差的生長(zhǎng)特征。

19、在貼壁原代細(xì)胞的上下文中術(shù)語(yǔ)在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行“細(xì)胞培養(yǎng)”指的是將細(xì)胞接種于培養(yǎng)容器在無(wú)血清培養(yǎng)基中，在無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)直到形成單層和/或形成單層后在無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的維持。術(shù)語(yǔ)在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行“細(xì)胞培養(yǎng)”也指上述所有步驟是在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的方法，從而在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不存在動(dòng)物血清制品。因此，從更普遍的意義上來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞”指的是在形成單層的過(guò)程中所有的培養(yǎng)基是無(wú)血清培養(yǎng)基。上述所有步驟中使用的培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有源自植物或蔬菜來(lái)源的肽和蛋白胨。

20、在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞的上下文中術(shù)語(yǔ)在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行“細(xì)胞培養(yǎng)”指的是將細(xì)胞接種于培養(yǎng)容器中在無(wú)血清培養(yǎng)基中，在無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)和/或達(dá)到復(fù)制不再發(fā)生的飽和密度后在無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的維持。術(shù)語(yǔ)在無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行“細(xì)胞培養(yǎng)”指上述所有步驟都是在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的方法，從而在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)中不存在動(dòng)物血清制品。上述所有步驟中使用的培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有源自植物或蔬菜來(lái)源的肽和蛋白胨。

21、術(shù)語(yǔ)“無(wú)血清”培養(yǎng)基指的是不包含來(lái)自動(dòng)物或人源的血清的任何細(xì)胞培養(yǎng)基。合適的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的。這些培養(yǎng)基包含鹽類、維生素、緩沖液、碳水化合物、氨基酸以及其他化合物，比如酵母提取物和抗生素。

22、根據(jù)本公開的方法使用的培養(yǎng)基，特別是用于諸如cef細(xì)胞的貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基，包含源自植物或蔬菜來(lái)源的肽和蛋白胨。肽和蛋白胨的例子是蔬菜胰蛋白胨。

23、無(wú)血清培養(yǎng)基還可以包括一種或多種選自微生物提取物、植物提取物和來(lái)自非哺乳類動(dòng)物的提取物的添加劑。微生物提取物可以是酵母提取物或酵母粉超濾液(yeastolate?ultrafiltrate)。植物提取物可以是大米提取物或大豆提取物。來(lái)自非哺乳類動(dòng)物的提取物可以是魚類提取物。

24、無(wú)血清培養(yǎng)基也可以與添加動(dòng)物血來(lái)源的血清制品(比如0.5％到3％)一起使用，作為降低支持原代貼壁細(xì)胞或細(xì)胞系生長(zhǎng)通常所需的總體血清濃度(5％到10％)的方法。

25、病毒的擴(kuò)增可包括以下步驟：第一步，根據(jù)上述方法培養(yǎng)原代細(xì)胞，即在補(bǔ)充有源自植物或蔬菜來(lái)源的肽和蛋白胨的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代細(xì)胞。上述在原代細(xì)胞培養(yǎng)方法中描述的所有條件和定義，也適用于根據(jù)本公開的此實(shí)施方案的病毒擴(kuò)增方法的第一步的定義。第二步，用病毒感染原代細(xì)胞。第三步，將被感染的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中孵育，直至產(chǎn)生子代病毒。最后，在第四步將病毒從被感染的細(xì)胞中分離出來(lái)，或收集帶有病毒的細(xì)胞以保持這些被感染的細(xì)胞存活。

26、根據(jù)本發(fā)明的用于病毒擴(kuò)增的方法的第二步的感染原代細(xì)胞的方法是已知的。例如，可以簡(jiǎn)單地將病毒添加到培養(yǎng)基中?？商娲?，可以將培養(yǎng)基去除，并可以將病毒添加到新鮮的培養(yǎng)基中，然后將其添加給細(xì)胞。為了獲得有效的感染，病毒/培養(yǎng)基懸液的量應(yīng)盡可能低，以具有高的病毒濃度。在病毒附著之后，可以添加額外的培養(yǎng)基。

27、在本發(fā)明方法的第三步，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)被感染的細(xì)胞，直到產(chǎn)生子代病毒。

28、可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法濃縮和純化子代病毒。

29、本公開所述的方法涉及一種痘病毒的擴(kuò)增方法，其包括以下步驟：(ⅰ)根據(jù)上述方法，即在補(bǔ)充有源自植物或蔬菜來(lái)源的多肽和蛋白胨的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代細(xì)胞的方法培養(yǎng)原代細(xì)胞；(ⅱ)用痘病毒感染原代細(xì)胞；(ⅲ)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)被感染的細(xì)胞，直到產(chǎn)生子代病毒；和(ⅳ)從被感染的細(xì)胞中分離病毒。根據(jù)本發(fā)明的方法分離出的病毒不含有任何包含在動(dòng)物血清中的制品和/或感染因子。

30、在無(wú)血清條件下對(duì)那些之前已經(jīng)在含血清條件下擴(kuò)增的病毒進(jìn)行傳代、培養(yǎng)和/或純化的過(guò)程稱為“再衍生”。如果不完全清楚如何獲得用于疫苗生產(chǎn)的主病毒株(masterseed)，也可以使用這種再衍生。而在無(wú)血清條件下進(jìn)行的再衍生大大降低了疫苗中污染的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是不希望的感染因子。

31、根據(jù)本公開的方法涉及培養(yǎng)原代禽類細(xì)胞和擴(kuò)增病毒，其中病毒是要再衍生的病毒。例如，本發(fā)明的方法對(duì)于病毒和病毒原株(stock)的再衍生是有用的，特別是對(duì)于已經(jīng)、或者可能之前已經(jīng)在含有血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)傳代的原株。

32、起始材料(即要再衍生的病毒)在無(wú)血清條件下的一次傳代可能對(duì)于病毒的再衍生就足夠了。術(shù)語(yǔ)“傳代”指的是在無(wú)血清條件下培養(yǎng)細(xì)胞、用要再衍生的病毒感染細(xì)胞以及獲取在被感染的細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒的步驟。雖然一次傳代可能就足夠了，但可優(yōu)選在無(wú)血清條件下將病毒傳代數(shù)次。在這種情況下，用從第一次傳代步驟獲得的病毒來(lái)再次感染新鮮細(xì)胞。無(wú)血清條件下進(jìn)行的傳代可與一種或多種在無(wú)血清條件下純化病毒的方法相結(jié)合。傳代的總數(shù)目可選地通過(guò)包括純化，范圍為1至大于10，比如3至8或4至6。純化的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的標(biāo)準(zhǔn)病毒學(xué)方法。

33、如前所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員周知原代禽類細(xì)胞在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)不好。與痘病毒感染相關(guān)聯(lián)的額外壓力可能會(huì)導(dǎo)致已經(jīng)受到壓力的細(xì)胞在痘病毒顯著擴(kuò)增發(fā)生之前死亡。令人驚訝的是，根據(jù)本發(fā)明的方法，在補(bǔ)充有源自植物或蔬菜來(lái)源的多肽和蛋白胨的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的禽類細(xì)胞有效支持痘病毒病毒復(fù)制和擴(kuò)增。

34、痘病毒優(yōu)選是正痘病毒(orthopox?virus)。正痘病毒的例子是禽痘病毒(avipoxvirus)和牛痘病毒(vaccinia?virus)。

35、術(shù)語(yǔ)“禽痘病毒”指的是任何禽痘病毒，比如禽痘病毒(fowlpoxvirus)、金絲雀痘病毒、uncopoxvirus、八哥痘病毒、鴿痘病毒、鸚鵡痘病毒、鵪鶉痘病毒、孔雀痘病毒、企鵝痘病毒、麻雀痘病毒、椋鳥痘病毒和火雞痘病毒。優(yōu)選的禽痘病毒是金絲雀痘病毒和禽痘病毒。

36、術(shù)語(yǔ)“馬立克氏病病毒”指的是任何一種用于生產(chǎn)馬立克氏病疫苗的甲皰疹病毒血清型，包括但不限于病毒血清型1、2和3。

37、本公開的目的之一是開發(fā)一種疫苗生產(chǎn)的方法，特別是通過(guò)上述方法獲得的痘病毒疫苗。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案痘病毒是禽痘(fp)病毒。

38、本公開的另一個(gè)目的是開發(fā)一種在無(wú)血清培養(yǎng)基中利用馬立克氏病疫苗(血清型1、2和3)生產(chǎn)來(lái)進(jìn)行疫苗生產(chǎn)的方法。

39、本公開的另一個(gè)目的是開發(fā)一種包含病毒，特別是根據(jù)本公開的方法生產(chǎn)的重組馬立克氏血清型3病毒(hvt)的組合物。由于病毒擴(kuò)增的方法，該組合物不含任何包含在動(dòng)物血清內(nèi)的制品和/或感染因子。相反的，根據(jù)傳統(tǒng)方法生產(chǎn)出來(lái)的含病毒的組合物包含源自動(dòng)物血清的殘留化合物。對(duì)于根據(jù)傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的包含馬立克氏病毒疫苗的組合物尤其如此，比如hvt病毒血清型。

40、本公開的另一個(gè)目的是開發(fā)一種在無(wú)血清培養(yǎng)基中利用傳染性法氏囊病疫苗生產(chǎn)來(lái)進(jìn)行疫苗生產(chǎn)的方法。

41、本公開的另一個(gè)目的是開發(fā)一種用于治療或免疫接種有此需要的動(dòng)物(包括人類)的方法，其包括對(duì)動(dòng)物或人體施用上述定義的病毒或上述定義的組合物。

42、結(jié)合以下的實(shí)施例將更好地理解本公開，這些實(shí)施例旨在對(duì)本公開進(jìn)行說(shuō)明，而非限制本公開的范圍。

43、實(shí)施例

44、實(shí)施例1：原代雞胚成纖維細(xì)胞(cef)細(xì)胞培養(yǎng)

45、細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備

46、酶準(zhǔn)備：使用gibco的tryple?select?enzyme(1x)，無(wú)需進(jìn)一步稀釋。

47、生長(zhǎng)培養(yǎng)基準(zhǔn)備：準(zhǔn)備培養(yǎng)基，其包含emem培養(yǎng)基和vegitone(1x)(來(lái)自sigma)，emem培養(yǎng)基中vegitone約為5％v/v。

48、胚胎的消化：在50ml來(lái)自gibco的磷酸鹽緩沖液(pbs)中將胚胎洗三遍，然后在tryple溶液中消化四次，每次消化時(shí)期持續(xù)五分鐘。

49、將細(xì)胞收集在含有50/50的vegitone和emem溶液的燒杯中，用細(xì)胞準(zhǔn)備培養(yǎng)基(含5％vegitone?v/v的emem培養(yǎng)基)進(jìn)行沖洗。然后以750rpm將細(xì)胞離心十二分鐘，并保存在2-7℃長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)。

50、收集總體積為110ml的細(xì)胞，細(xì)胞密度為6.0x106個(gè)細(xì)胞/ml。

51、根據(jù)下表1準(zhǔn)備每個(gè)原代細(xì)胞培養(yǎng)容器(共6個(gè))。

52、表1.原代細(xì)胞培養(yǎng)容器條件

53、

54、在35-39.0℃和0.2rpm下孵育48小時(shí)后，轉(zhuǎn)瓶100％匯合。

55、hvt病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中傳代

56、以每瓶1x108個(gè)細(xì)胞的比率將原代(1°)cef細(xì)胞培養(yǎng)物接種到五個(gè)轉(zhuǎn)瓶中。以培養(yǎng)基(emem)中約5％的比率使用1x?vegitone來(lái)為cef細(xì)胞提供額外的營(yíng)養(yǎng)。在39.0℃和0.2rpm下孵育48小時(shí)后，轉(zhuǎn)瓶100％匯合。

57、用1安瓿hvt?sr-3接種cef細(xì)胞，然后在35-39℃和0.2rpm下孵育，約46小時(shí)后確定細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic?effect，cpe)為約60％。通過(guò)胰蛋白酶消化收獲這些hvt感染的cef細(xì)胞的第一次傳代(x+1)，然后離心并重懸在含有6種不同冷凍保存培養(yǎng)基配方的小瓶中。然后使用控速冷凍機(jī)(controlled?rate?freezer)將小瓶冷凍至約-110℃。將重懸的小瓶標(biāo)記為條件1的x+1(1)、條件2的x+1(2)、條件3的x+1(3)、條件4的x+1(4)、條件5的x+1(5)和條件6的x+1(6)。冷凍保存培養(yǎng)基和冷凍數(shù)據(jù)顯示在下表2中。

58、表2：冷凍保存培養(yǎng)基和冷凍數(shù)據(jù)

59、

60、

61、1rmbio的經(jīng)輻照的小牛血清，2sigma的1x?lb?vegitone，31％的甲基纖維素(4000cp)(來(lái)自sigma)在1％pbs-溶液中，和4將以0.5ml配制的疫苗于49.5ml?marek稀釋劑中的比率稀釋樣本，然后以1：500稀釋用于滴定和活細(xì)胞計(jì)數(shù)(1:1臺(tái)盼藍(lán))。

62、實(shí)施例2：原代雞胚成纖維細(xì)胞(cef)細(xì)胞培養(yǎng)

63、細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備

64、酶準(zhǔn)備：使用gibco的tryple?select?enzyme(1x)，無(wú)需進(jìn)一步稀釋。

65、生長(zhǎng)培養(yǎng)基準(zhǔn)備：準(zhǔn)備培養(yǎng)基，其包含rs-emem培養(yǎng)基和vegitone(1x)(來(lái)自sigma)，emem培養(yǎng)基中vegitone約為5％v/v。

66、胚胎的消化：在1000ml來(lái)自gibco的磷酸鹽緩沖液(pbs)中將胚胎洗3遍，然后在50ml?tryple溶液中消化四次，每次消化時(shí)期持續(xù)五分鐘。

67、將細(xì)胞收集在含有20ml的emem(含20％的vegitone)的燒杯中，用10ml細(xì)胞準(zhǔn)備培養(yǎng)基(含5％vegitone?v/v的emem培養(yǎng)基)進(jìn)行沖洗。然后以750rpm將細(xì)胞離心十二分鐘，并保存在2-7℃長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)。

68、收集總體積為200ml的細(xì)胞，為28x106個(gè)細(xì)胞/ml。

69、根據(jù)下表3準(zhǔn)備每個(gè)原代細(xì)胞培養(yǎng)容器(共12個(gè))。

70、表3.原代細(xì)胞培養(yǎng)容器條件

71、

72、hvt病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中第二次傳代

73、以每轉(zhuǎn)瓶4.5x108個(gè)cef細(xì)胞的比率將原代(1°)cef細(xì)胞接種在十個(gè)850cm2轉(zhuǎn)瓶中并在35-39.0℃和0.15rpm下孵育。以培養(yǎng)基(emem)中約5％的比率使用1x?vegitone來(lái)為cef細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)。

74、用1ml來(lái)自表2的x+1(2)接種一個(gè)含有cef細(xì)胞懸液的轉(zhuǎn)瓶，并在35-39.0℃和0.15rpm下孵育。接種約50小時(shí)后，確定細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)為約60％。使用1xtrypleselect收集這些hvt感染的細(xì)胞的第二次傳代(x+2)，并以750x?g離心15分鐘以沉淀細(xì)胞。將沉淀的細(xì)胞重懸在含有5％1x?lb?vegitone和0.1％甲基纖維素的pbs中。將2.0ml的該細(xì)胞懸液加入剩余的9個(gè)轉(zhuǎn)瓶中以產(chǎn)生hvt感染的cef細(xì)胞的第三次傳代(x+3)。

75、hvt病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中第三次傳代

76、用2ml的第二次傳代細(xì)胞(x+2)接種九個(gè)含有cef細(xì)胞懸液的轉(zhuǎn)瓶，并在35-39.0℃和0.15rpm下孵育。接種約48小時(shí)后，確定細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)為約75-80％。使用1xtrypleselect收集每個(gè)轉(zhuǎn)瓶含有第三次傳代細(xì)胞(x+3)，并以750x?g離心15分鐘以沉淀細(xì)胞。在離心前用約20ml含有10％?vegitone的emem中和tryple?select。將沉淀的細(xì)胞重懸在兩種不同的低溫保存培養(yǎng)基中，并使用控速冷凍機(jī)進(jìn)行冷凍。冷凍保存培養(yǎng)基和冷凍數(shù)據(jù)顯示在下表4中。

77、表4:冷凍保存培養(yǎng)基和冷凍數(shù)據(jù)

78、

79、1sigma的1x?lb?vegitone，2?1％的甲基纖維素(4000cp)(來(lái)自sigma)在1％pbs-溶液中。

80、用于cef細(xì)胞培養(yǎng)的示例性培養(yǎng)基配方示于表5，用于cef細(xì)胞或感染hvt病毒的cef細(xì)胞的冷凍保存的示例性培養(yǎng)基配方示于表6。

81、表5：cef細(xì)胞培養(yǎng)基配方。示出了配制1l無(wú)血清培養(yǎng)基的量。

82、 組分 量/升 emem粉末(sigma?m1018) 10-12克 lb?broth,vegitone(sigma?28713) 0.5-2.0克 碳酸氫鈉 0.35-1.0克 抗生素溶液 0-20ml 無(wú)菌di水 加入適量補(bǔ)充總體積至1000ml

83、表6：cef/病毒冷凍保存培養(yǎng)基。示出了配制1l培養(yǎng)基的量。

84、 組分 量/升 emem粉末(sigma?m1018) 10-12克 碳酸氫鈉 0.35-1.0克 二甲基亞砜(dmso) 50ml 抗生素溶液 0-20ml 無(wú)菌di水 加入適量補(bǔ)充總體積至1000ml

85、使用根據(jù)表5的無(wú)血清培養(yǎng)基產(chǎn)生的hvt病毒產(chǎn)量與使用包含約6％小牛血清的常規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基在相似生長(zhǎng)/孵育條件下產(chǎn)生的批次(batch)相當(dāng)(表7)。

86、表7：重組hvt病毒原株產(chǎn)量數(shù)據(jù)

87、

88、*批次效率是每個(gè)轉(zhuǎn)瓶恢復(fù)的總pfu除以接種到轉(zhuǎn)瓶中的cef細(xì)胞的總數(shù)。

89、實(shí)施例3：禽痘疫苗病毒、法氏囊病疫苗病毒和馬立克氏病疫苗病毒(血清型1、2和3)在無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)

90、使用根據(jù)表5的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)感染/接種了根據(jù)下表8的各種原株病毒的cef細(xì)胞并置于類似生長(zhǎng)條件，結(jié)果導(dǎo)致觀察到的cpe至少為50％和病毒復(fù)制(如下表8所示)。

91、表8：疫苗病毒和結(jié)果產(chǎn)量數(shù)據(jù)

92、

93、本發(fā)明的范圍不受本文所述的具體實(shí)施方案的限制。事實(shí)上，從前述出發(fā)，除了本文所述的那些之外，對(duì)本發(fā)明的各種修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將變得顯而易見(jiàn)。