本發(fā)明涉及體外診斷，具體而言，涉及一種微流控芯片及其制備方法與應用，更具體地，涉及一種同時檢測大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的微流控芯片及其制備方法與應用。

背景技術：

1、顱內感染的早期診斷對于改善臨床的結局至關重要，對可疑的顱內感染者應盡早行腰穿腦脊液進行病原學檢查，若細菌培養(yǎng)陽性，即可確診，從而進行精準治療。據統(tǒng)計，我國神經外科顱內感染患者的主要病原菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、凝固酶陰性葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等，這些病原菌的培養(yǎng)一般需5-7天，耗時太久無法滿足臨床診斷的需求。當下流行的二代測序技術(next-genrationsequencing，ngs)不依賴于細菌培養(yǎng)，具有無偏倚性、廣覆蓋、快速等優(yōu)點，被臨床廣為應用。但是該方法價格高昂，很多病人無法承擔。因此，開發(fā)靈敏度高、價格低廉的快速檢測方法對于術后顱內感染的治療至關重要。

技術實現思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、靈敏度高、檢測快速的細菌檢測方法。

2、為達成上述目的，本發(fā)明第一方面提供一種微流控芯片，所述微流控芯片包括適配體磁珠、反應器和多價dna納米線反應液，適配體磁珠包括生物素化金黃色葡萄球菌適配體標記的適配體磁珠和生物素化大腸埃希菌適配體標記的適配體磁珠，生物素化金黃色葡萄球菌適配體標記的適配體磁珠中的磁珠為鏈霉親和素磁珠，生物素化大腸埃希菌適配體標記的適配體磁珠中的磁珠為鏈霉親和素磁珠，所述生物素化金黃色葡萄球菌適配體中，生物素連接于seq?id?no.1的5’端，所述生物素化大腸埃希菌適配體中，生物素連接于seqid?no.2的5’端，反應器包括兩個樣品微室、兩個磁吸室、兩個蛇形混合通道、兩個檢測室和一個出樣口，其中，樣品微室和磁吸室通過泳道連接，磁吸室和檢測室通過蛇形混合通道連接，檢測室與出樣口通過泳道連接；多價dna納米線反應液為包括多價dna納米線、血紅素、tris-hcl的混合液。

3、作為優(yōu)選，所述多價dna納米線通過hcr引發(fā)鏈、發(fā)夾dna?h1、發(fā)夾dna?h2經hcr反應并與大腸埃希菌適配體、金黃色葡萄球菌適配體和g-四鏈體孵育后獲得，

4、所述hcr引發(fā)鏈的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

5、所述發(fā)夾dna?h1的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

6、所述發(fā)夾dna?h2的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；

7、所述大腸埃希菌適配體的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

8、所述金黃色葡萄球菌適配體的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；

9、所述g-四鏈體的核苷酸序列如seq?id?no.8所示。

10、作為優(yōu)選，多價dna納米線反應液中，多價dna納米線和血紅素的體積比為5：(1～3)。

11、本發(fā)明提供的微流控芯片是一種基于新型多價適配體和g-四鏈體組裝的dna納米線的微流控平臺，可以同時檢測大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌兩種病原菌，不僅發(fā)揮了hcr骨架的雙功能性，還利用微流控芯片實現對多種食源性致病菌的同時檢測。本發(fā)明一方面將hcr產物作為支架用于多價適配體的組裝，增強適配體對病原菌的結合親和力，利用dna的可編程性，將hcr作為信號載體的支架，通過g-四鏈體/血紅素的類過氧化物酶作用，進一步提高檢測靈敏度，通過一步雙信號放大，提高了檢測的靈敏度，實現可視化檢測；本發(fā)明另一方面利用微流控芯片，同時對多種病原菌進行檢測，極大了縮短了檢測時間，提升了檢測效率且由于多價適配體的高特異性，在實際樣品中也顯示出良好的檢測性能。此外，該方法在其它病原菌檢測方面也具有廣闊的前景。同時，發(fā)明將核酸適配體與微流控芯片結合，在使用時上述微流控芯片能將樣品前處理、反應、結果讀取等多個試驗步集成在一塊細小的芯片中完成，具有樣品消耗量少、準確率高、高通量、智能化、微型化和集成化等優(yōu)點。

12、進一步地，本發(fā)明第二方面提供一種第一方面所述微流控芯片的制備方法，具體包括以下步驟：

13、s1：制備適配體磁珠；

14、s2：制備多價dna納米線；

15、s3：通過模具制備反應器。

16、優(yōu)選地，所述步驟s1包括以下步驟：

17、s11：將鏈霉親和素磁珠溶液與生物素化金黃色葡萄球菌適配體溶液混合并孵育，向孵育結束后的反應體系中加入d-生物素溶液并孵育封閉后用磷酸鹽緩沖液洗滌磁珠，使用磷酸鹽緩沖液重懸后獲得生物素化金黃色葡萄球菌適配體標記的適配體磁珠；

18、s12：將鏈霉親和素磁珠溶液與生物素化大腸埃希菌適配體溶液混合并孵育，向孵育結束后的反應體系中加入d-生物素溶液并孵育封閉后用磷酸鹽緩沖液洗滌磁珠，使用磷酸鹽緩沖液重懸后獲得生物素化大腸埃希菌適配體標記的適配體磁珠。

19、優(yōu)選地，所述步驟s2包括以下步驟：

20、s21：所有dna序列經離心并單獨溶解，控制所有dna溶液濃度為50μm；

21、s22：對hcr引發(fā)鏈、發(fā)夾dna?h1、發(fā)夾dna?h2、g-四鏈體、金黃色葡萄球菌適配體、大腸埃希菌適配體分別進行退火前處理；

22、s23：混合步驟s22處理后的發(fā)夾dnah1、步驟s22處理后的發(fā)夾dna?h2和步驟s22處理后的hcr引發(fā)鏈，37℃孵育形成hcr產物；

23、s24：混合步驟s22處理后的大腸埃希菌適配體、步驟s22處理后的金黃色葡萄球菌適配體、步驟s22處理后的g-四鏈體、步驟s23獲得的hcr產物，37℃下孵育后形成多價適配體和g-四鏈體組裝的多價dna納米線。

24、優(yōu)選地，所述步驟s22中，退火前處理包括以下步驟：g-四鏈體在95℃下變性5min后室溫下?lián)u動2h；發(fā)夾dnah1在95℃下變性5min后置于冰上；發(fā)夾dna?h2在95℃下變性5min后置于冰上，大腸埃希菌適配體在95℃下變性5min后置于冰上；金黃色葡萄球菌適配體在95℃下變性5min后置于冰上。

25、進一步地，本發(fā)明第三方面提供一種第一方面所述微流控芯片的應用，所述應用為將所述微流控芯片用于大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的同時定量檢測。

26、優(yōu)選地，使用微流控芯片通過以下步驟同時定量檢測大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌：

27、步驟一：將金黃色葡萄球菌標記的適配體磁珠和大腸埃希菌標記的適配體磁珠分別注入到反應器上不同的磁吸室中，然后將樣品通過樣品微室注入到兩個磁吸室中；

28、步驟二：混合樣品和磁珠并將混合液繼續(xù)泵入下游的蛇形混合通道中進行充分捕獲，將磁鐵置于反應器下方固定磁珠捕獲病原菌；

29、步驟三：緩慢泵入多價dna納米線，反應以形成“磁珠-病原菌-納米線”的三明治結構，然后將三明治結構用磁鐵固定，進行洗滌后，分別用pbs將兩種三明治產物泵入檢測室；

30、步驟四：在檢測室中分別加入abts2-和過氧化氫及tris-hcl?buffer充分反應進行比色分析。

31、本發(fā)明提供的微流控芯片的檢測原理為：利用hcr產物為長雙鏈dna以及dna的可編程性，在發(fā)夾dna?h1的5’端設計一段延伸序列與目標適配體5’端的延伸序列互補，通過堿基互補配對將目標適配體連接到hcr骨架上得到高價態(tài)的多價適配體用于捕獲目標菌。為了檢測信號的輸出，在發(fā)夾dna?h2的3’端修飾g-四鏈體，與血紅素結合，最后添加底物實現可視化顯色。在檢測時，首先將對應的適配體磁珠溶液注射在樣品室里，然后加入對應的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，由于其多價適配體對目標菌具有高親和力，故會與對應目標菌特異性結合。隨后通過g-四鏈體/血紅素的類過氧化物酶活性，最后添加底物顯色，可實現對兩種病原菌的同時檢測。吸光度值與目標菌濃度呈線性關系，當加入的目標菌濃度越高，特異性結合上的多價適配體也越多，結合上的g-四鏈體/血紅素的類過氧化物酶活性越高，最終顯色效果越好，吸光度值越高。

32、與現有技術相比，本發(fā)明具備的有益效果：本發(fā)明提供的微流控芯片的檢測原理為hcr檢測，是一種無酶的等溫擴增技術，產物具有分子量大的特點，可通過序列的設計將適配體通過簡單的堿基互補配對組裝在hcr產物上得到高價態(tài)的多價適配體；本發(fā)明利用dna的可編程性，對hcr擴增中的兩個發(fā)夾dna進行修飾，得到的hcr產物作為多價適配體和信號載體(g-四鏈體/血紅素)的骨架，實現了多價增強的高親和性結合及信號的雙重功能，極大地提高了該檢測方法的簡便性和靈敏度，最終可同時檢測到10cfu/ml的金黃色葡萄球菌和8cfu/ml的大腸埃希菌；本發(fā)明中設計的微流控芯片，可實現對兩種病原菌的同時檢測，極大的節(jié)約了時間。