本發(fā)明涉及胚胎工程，具體涉及一種提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、畜牧業(yè)作為農(nóng)業(yè)的重要組成部分，對保障國家糧食安全和推動農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化具有重要意義。應(yīng)用胚胎技術(shù)進(jìn)行奶牛品種的遺傳改良和種牛培育，已經(jīng)成為奶業(yè)強(qiáng)國奶牛育種的利器。體外胚胎生產(chǎn)效率低是目前我國無法大規(guī)模開展體外胚胎生產(chǎn)的關(guān)鍵障礙，這在一定程度上制約了我國畜牧業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。

2、體外胚胎生產(chǎn)涉及體外卵母細(xì)胞成熟、體外受精和體外胚胎培養(yǎng)等多個環(huán)節(jié)，其中體外胚胎囊胚率低是限制我國體外胚胎技術(shù)應(yīng)用的最大障礙。而傳統(tǒng)的覆油成熟、小滴受精以及平面式胚胎培養(yǎng)方法可能抑制激素作用、延長體外處理時間以及導(dǎo)致胚胎在培養(yǎng)液中的分布不均勻，影響胚胎間的相互作用和信號傳遞，從而限制了體外胚胎的發(fā)育，囊胚率下降。

3、因此，發(fā)明人提供了一種提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、(1)要解決的技術(shù)問題

2、本發(fā)明實(shí)施例提供了一種提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，解決了牛胚胎體外培養(yǎng)的囊胚率較低的技術(shù)問題。

3、(2)技術(shù)方案

4、本發(fā)明提供了一種提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

5、s100、在四孔板中的每個孔中加入設(shè)定體積的成熟液，并在培養(yǎng)箱中以第一設(shè)定時間進(jìn)行平衡后取出備用；

6、s200、將采集到的牛卵巢上的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體置于步驟s100處理后的成熟液中，并分別加入四孔板中的每個孔中，然后在培養(yǎng)箱中以第二設(shè)定時間進(jìn)行培養(yǎng)；

7、s300、在步驟s200的四孔板中的每個孔中加入設(shè)定體積的受精液，得到含有卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的受精液，之后將經(jīng)處理后的牛精液加入所述含有卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的受精液中，并在培養(yǎng)箱中以第三設(shè)定時間進(jìn)行受精，得到受精卵；

8、s400、在四孔板的每個孔中加入第一部分的體外培養(yǎng)液，制作成小滴，隨后在每個孔中加入礦物油，接著再加入第二部分的體外培養(yǎng)液，以形成立體式柱形培養(yǎng)液滴；

9、s500、將步驟s300處理得到的所述受精卵移入所述立體式柱形培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)，并間隔第四設(shè)定時間半量換液，直至所述受精卵體外培養(yǎng)到囊胚階段。

10、進(jìn)一步地，所述在四孔板中的每個孔中加入設(shè)定體積的成熟液，并在培養(yǎng)箱中以第一設(shè)定時間進(jìn)行平衡后取出備用，具體為：

11、在所述四孔板中的每個孔中加入500～750μl的成熟液，且在成熟液的表面不滴入礦物油，并于38.5℃、5％co2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中平衡至少2h。

12、進(jìn)一步地，所述將采集到的牛卵巢上的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體置于步驟s100處理后的成熟液中，并分別加入四孔板中的每個孔中，然后在培養(yǎng)箱中以第二設(shè)定時間進(jìn)行培養(yǎng)，具體為：

13、在所述牛卵巢上采集直徑為2～8mm的卵泡中的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，將所述卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體置于步驟s100處理后的成熟液中，并分別加入四孔板中的每個孔中，然后在于38.5℃、5％co2及飽和濕度的所述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24h。

14、進(jìn)一步地，所述步驟s300中，所述精液的制備包括：將牛冷凍細(xì)管精液于水浴解凍后加入洗精液，經(jīng)離心沉淀后制得精液；和/或，

15、在所述培養(yǎng)箱中以第三設(shè)定時間進(jìn)行受精的處理?xiàng)l件為：于38.5℃、5％co2及飽和濕度的所述培養(yǎng)箱中受精8～18h。

16、進(jìn)一步地，牛冷凍細(xì)管精液于水浴解凍后加入洗精液，經(jīng)離心沉淀，精子沉淀后用受精液調(diào)整精子密度后作為精液；其中，精子密度為2×106～5×106個/ml。

17、進(jìn)一步地，所述卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體經(jīng)受精處理后，用透明質(zhì)酸酶消化以去除卵丘顆粒細(xì)胞，得到受精卵。

18、進(jìn)一步地，在步驟s200的四孔板中的每個孔中加入300～500μl的受精液。

19、進(jìn)一步地，所述透明質(zhì)酸酶的濃度為1g/l。

20、進(jìn)一步地，消化時間為1～2min。

21、進(jìn)一步地，第一部分的體外培養(yǎng)液、第二部分的體外培養(yǎng)液的體積比為1:(10～20)。

22、進(jìn)一步地，所述第四設(shè)定時間為48h。

23、(3)有益效果

24、綜上，本發(fā)明通過在胚胎培養(yǎng)階段，使用立體式柱形培養(yǎng)滴，以減小培養(yǎng)液滴的底面積，使胚胎實(shí)現(xiàn)近距離接觸，產(chǎn)生有效的旁分泌效應(yīng)，共享細(xì)胞因子和生長因子，激活某些共同的信號通路，有助于減少胚胎中的細(xì)胞凋亡，幫助胚胎抵抗應(yīng)激和損傷，以此實(shí)現(xiàn)提高囊胚的數(shù)量和質(zhì)量的目的。

技術(shù)特征：

1.一種提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，其特征在于，所述在四孔板中的每個孔中加入設(shè)定體積的成熟液，并在培養(yǎng)箱中以第一設(shè)定時間進(jìn)行平衡后取出備用，具體為：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，其特征在于，所述將采集到的牛卵巢上的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體置于步驟s100處理后的成熟液中，并分別加入四孔板中的每個孔中，然后在培養(yǎng)箱中以第二設(shè)定時間進(jìn)行培養(yǎng)，具體為：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s300中，所述精液的制備包括：將牛冷凍細(xì)管精液于水浴解凍后加入洗精液，經(jīng)離心沉淀后制得精液；和/或，

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，其特征在于，牛冷凍細(xì)管精液于水浴解凍后加入洗精液，經(jīng)離心沉淀，精子沉淀后用受精液調(diào)整精子密度后作為精液；其中，精子密度為2×106～5×106個/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，其特征在于，所述卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體經(jīng)受精處理后，用透明質(zhì)酸酶消化以去除卵丘顆粒細(xì)胞，得到受精卵。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，其特征在于，所述透明質(zhì)酸酶的濃度為1g/l。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟s200的四孔板中的每個孔中加入300～500μl的受精液。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，其特征在于，第一部分的體外培養(yǎng)液、第二部分的體外培養(yǎng)液的體積比為1:(10～20)。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，其特征在于，所述第四設(shè)定時間為48h。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及胚胎工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法，其包括步驟：在四孔板中的每個孔中加入設(shè)定體積的成熟液；將采集到的牛卵巢上的卵丘?卵母細(xì)胞復(fù)合體置于成熟液中進(jìn)行培養(yǎng)；將經(jīng)處理后的牛精液加入含有卵丘?卵母細(xì)胞復(fù)合體的受精液中，并在培養(yǎng)箱中進(jìn)行受精；在培養(yǎng)孔中制作立體式柱形培養(yǎng)液滴，以達(dá)到使胚胎間緊密接觸的培養(yǎng)目的，增加胚胎之間的旁分泌；將受精卵移入立體式柱形培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)。該提高牛體外囊胚率的胚胎培養(yǎng)方法的目的是解決牛胚胎體外培養(yǎng)囊胚率較低的問題。

技術(shù)研發(fā)人員：趙善江,胡櫻凡,朱化彬
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9