本發(fā)明涉及生物,尤其涉及穩(wěn)定表達ibv?js-96?s1蛋白的cho-k1細胞株、馴化方法、ibv?s1蛋白和用途。
背景技術:
1、雞傳染性支氣管炎(infectious?bronchitis,ib)是由傳染性支氣管炎病毒(infectious?bronchitis?virus,ibv)引起的具有高度傳染性的動物疫病,在國內長期流行,不同年齡段的雞群均易感。ibv可侵害雞的泌尿生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及消化系統(tǒng),具有廣泛的組織嗜性。產(chǎn)蛋雞感染常以生殖道型為主,產(chǎn)蛋品質明顯下降,出現(xiàn)畸形蛋、小蛋和軟蛋;雛雞、肉雞則多以呼吸型、腎型、腺胃型等為主,當與其他疾病混合或者繼發(fā)感染等嚴重情況下發(fā)病率高達90%,致死率可達25%以上。
2、ibv屬于尼多病毒目、冠狀病毒科的γ冠狀病毒屬成員,由于復制依賴rna聚合酶,而rna聚合酶缺乏校正能力,因此,ibv具有高度的遺傳變異性,血清型眾多。ibv是單股正鏈rna病毒,基因組大小約27.6kb,從位于基因組3’端的為結構基因,僅占病毒基因組的三分之一,編碼四種主要結構蛋白,分別為分別為核衣殼蛋白(nucleocapsid,n),纖突蛋白(spike,s),膜蛋白(membrane,m)和小膜蛋白(envelope,e)。s蛋白是ibv的主要表面結構蛋白,由s1和s2亞基組成,s1亞基含有受體結合域,負責病毒附著宿主細胞并能刺激宿主產(chǎn)生中和抗體。多數(shù)ibv的抗原決定簇位于s1蛋白n端,而病毒重組和宿主選擇壓力使s1蛋白突變較高率,導致新的血清型和基因型不斷產(chǎn)生。因此,無論是ib診斷方法的建立還是ib基因工程亞單位疫苗的研究,s1蛋白都是作為首選的靶蛋白。
3、本申請人在先申請了一項發(fā)明專利申請cn202410389072.3雞傳染性支氣管炎病毒s1蛋白cho細胞系的構建及應用,其公開了一種雞傳染性支氣管炎病毒s1蛋白cho細胞系的構建,該方案先將pxj40質粒中原有的氨芐抗性基因刪除并替換成新霉素-卡那霉素抗性基因,得到真核表達載體pxj40-neor/kanr,再對ibv?s1基因進行密碼子優(yōu)化,得到密碼子優(yōu)化后的ibv?s1基因,隨后將密碼子優(yōu)化后的ibv?s1基因、ires2、egfp插入步驟1制得的真核表達載體pxj40-neor/kanr中,得到重組質粒pxj40-s1,最后將重組質粒pxj40-s1轉染至cho細胞中,得到表達雞傳染性支氣管炎病毒s1蛋白cho細胞系。
4、經(jīng)過驗證,該細胞系僅適用于穩(wěn)定的貼壁培養(yǎng),s1蛋白表達量無法達到預期。而在生物制品工業(yè)化生產(chǎn)中,貼壁細胞的產(chǎn)量無法滿足實際生產(chǎn)需求,且使用含有動物血清的培養(yǎng)基會進一步提高生產(chǎn)成本,增加了細胞培養(yǎng)過程中的不穩(wěn)定性。隨著生物工程技術的不斷發(fā)展,哺乳動物細胞無血清懸浮培養(yǎng)技術成為生物制品工業(yè)化和規(guī)?;年P鍵。
5、本方案需要解決的問題:如何提供一株能夠表達的雞傳染性支氣管炎病毒s1蛋白的、能夠被較好懸浮馴化的cho細胞系。
技術實現(xiàn)思路
1、本申請的目的之一是提供一株穩(wěn)定表達ibv?js-96?s1蛋白的cho-k1細胞株,該細胞株能夠被較好的馴化,進而得到懸浮cho-k1細胞株,具有馴化時間短,細胞狀態(tài)好的優(yōu)勢。
2、同時,本發(fā)明還公開了采用該細胞株進行懸浮馴化得到懸浮cho-k1細胞株的方法以及該細胞株的用途;
3、此外本發(fā)明還公開了ibv?s1蛋白和用途。
4、為實現(xiàn)上述目的,本申請公開了一株穩(wěn)定表達ibv?js-96?s1蛋白的cho-k1細胞株,通過以下步驟制備:
5、步驟1:將s1基因和載體連接,得到質粒;
6、步驟2:將質粒轉染cho-k1細胞,轉染成功后即可得到cho-k1細胞株;
7、所述s1基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
8、同時,本發(fā)明公開了一種懸浮cho-k1細胞株的馴化方法,將步驟1制備得到的cho-k1細胞株進行多個階段的懸浮培養(yǎng),從前至后,每個階段所用的懸浮培養(yǎng)基中的fbs用量逐漸降低,直至懸浮培養(yǎng)基中的fbs降至0且連續(xù)成功傳代3次,即為馴化成功,得到懸浮cho-k1細胞株。
9、在上述的馴化方法中,循環(huán)分為至少6個階段進行,第一階段使用的懸浮培養(yǎng)基中含有8~12wt%的fbs;第二階段使用的懸浮培養(yǎng)基中含有4~6wt%的fbs;第三階段使用的懸浮培養(yǎng)基中含有2~3wt%的fbs;第四階段使用的懸浮培養(yǎng)基中含有0.8~1.2wt%的fbs;第五階段使用的懸浮培養(yǎng)基中含有0.05~0.2wt%的fbs;第五階段使用的懸浮培養(yǎng)基不含fbs。
10、在上述的馴化方法中,所述懸浮培養(yǎng)基為cd?cho?031培養(yǎng)基。
11、此外,本發(fā)明還公開了一種懸浮cho-k1細胞株,采用如上任一所述的馴化方法馴化得到。
12、以及采用如上所述的懸浮cho-k1細胞株收獲ibv?s1蛋白的用途。
13、最后本發(fā)明還公開了一種ibv?s1蛋白,采用如上所述的懸浮cho-k1細胞株進行培養(yǎng),得到ibv?s1蛋白。
14、以及采用如上所述的ibv?s1蛋白制備多克隆抗體的用途。
15、本申請的有益效果是:
16、本發(fā)明使用載體pcdna3.1(+)構建了一株穩(wěn)定表達ibv?s1蛋白的cho-k1細胞株,該細胞株經(jīng)過懸浮馴化后,與未經(jīng)過懸浮馴化的貼壁穩(wěn)定細胞株與商業(yè)化的表達載體pxj40-s1構建cho細胞株的s1蛋白表達量進行比較,發(fā)現(xiàn)其具有如下優(yōu)勢:
17、1.能夠被馴化,馴化后細胞活力好;
18、2.s1蛋白表達量大;
19、3.s1蛋白雜帶少,純度高;
20、4.采用s1蛋白制備的抗體效價高、特異性強。
1.一株穩(wěn)定表達ibv?js-96s1蛋白的cho-k1細胞株,其特征在于,通過以下步驟制備:
2.一種懸浮cho-k1細胞株的馴化方法,其特征在于,將步驟1制備得到的cho-k1細胞株進行多個階段的懸浮培養(yǎng),從前至后,每個階段所用的懸浮培養(yǎng)基中的fbs用量逐漸降低,直至懸浮培養(yǎng)基中的fbs降至0且連續(xù)成功傳代3次,即為馴化成功,得到懸浮cho-k1細胞株。
3.根據(jù)權利要求2所述的馴化方法,其特征在于,循環(huán)分為至少6個階段進行,第一階段使用的懸浮培養(yǎng)基中含有8~12wt%的fbs;第二階段使用的懸浮培養(yǎng)基中含有4~6wt%的fbs;第三階段使用的懸浮培養(yǎng)基中含有2~3wt%的fbs;第四階段使用的懸浮培養(yǎng)基中含有0.8~1.2wt%的fbs;第五階段使用的懸浮培養(yǎng)基中含有0.05~0.2wt%的fbs;第五階段使用的懸浮培養(yǎng)基不含fbs。
4.根據(jù)權利要求3所述的馴化方法,其特征在于,所述懸浮培養(yǎng)基為cd?cho?031培養(yǎng)基。
5.一種懸浮cho-k1細胞株,其特征在于,采用如權利要求2至4任一所述的馴化方法馴化得到。
6.采用如權利要求5所述的懸浮cho-k1細胞株收獲ibv?s1蛋白的用途。
7.一種ibv?s1蛋白,其特征在于,采用如權利要求5所述的懸浮cho-k1細胞株進行培養(yǎng),得到ibv?s1蛋白。
8.采用如權利要求7所述的ibv?s1蛋白制備多克隆抗體的用途。