本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為丹參素鈉對骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法。

背景技術(shù)：

1、骨骼肌由不同類型的肌纖維組成，目前，公認(rèn)的哺乳動物骨骼肌肌纖維類型的分類是依據(jù)myhc亞型的不同，將肌纖維分為4種類型，即ⅰ型(慢速氧化型肌纖維)、ⅱa型(快速氧化型肌纖維)、ⅱb型(快速酵解型肌纖維)和ⅱx型(中間型肌纖維)，分別表達(dá)myhc1/slow、myhc2a、myhc2b和myhc2x基因。其中氧化型肌纖維含有更多的肌紅蛋白和線粒體，具有更高的氧化能力，并賦予機(jī)體更強(qiáng)的耐力，而快速糖酵解型肌纖維比例高的人患肥胖和相關(guān)代謝疾病的風(fēng)險更高，并且在年老時肌肉更容易萎縮。在畜牧生產(chǎn)中，肉質(zhì)產(chǎn)量和質(zhì)量與肌肉中肌纖維類型的比例有直接關(guān)系，慢速氧化型肌纖維含有較多的肌肉含有一定的肌內(nèi)脂肪，肌肉顏色鮮紅，評分較高；相反，快速酵解型肌纖維含量高的肌肉，肉色蒼白，屠宰后ph下降快，蛋白質(zhì)降解程度增加，會導(dǎo)致pse肉的產(chǎn)生。因此，闡明調(diào)控肌纖維類型形成的分子機(jī)制對于肌肉相關(guān)疾病的治療和肉質(zhì)性狀的改善尤為重要。

2、近年來，在肌纖維形成和轉(zhuǎn)化的分子調(diào)控機(jī)制研究中鑒定出了許多天然化合物能夠調(diào)控肌纖維類型形成或轉(zhuǎn)化從而影響肉性狀和肌肉功能。例如用小分子琥珀酸(succinate)處理小鼠后快速酵解型肌纖維向慢速氧化型肌纖維轉(zhuǎn)變，小鼠的運動耐力增強(qiáng)；槲皮素處理小鼠后氧化型肌纖維相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)，并且肌肉功能增加。煙酸補(bǔ)充劑喂養(yǎng)綿羊，氧化型肌纖維比例顯著增加，并改善綿陽肉質(zhì)性狀，通過尋找調(diào)節(jié)肌纖維類型和轉(zhuǎn)化的天然小分子藥物，在日常飲食中補(bǔ)充這種天然小分子藥物來改善肉類品質(zhì)和提高肌肉功能，丹參素(dss)是從丹參中提取分離得到的一種水溶性成分，其已顯示的作用包括冠狀動脈舒張和對心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)，然而，它對肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化及肌肉功能的影響尚未被報道，為此本發(fā)明提出丹參素鈉(sodium?danshensu，sdss)對骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的影響。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明加深丹參素鈉對肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制的認(rèn)識，為畜牧生產(chǎn)提高肉產(chǎn)量和肉品質(zhì)及醫(yī)學(xué)上治療肌肉相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：丹參素鈉對骨骼肌肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的方法，其方法包括以下步驟：

3、s1、小分子藥物；

4、s2、c2c12細(xì)胞培養(yǎng)和處理

5、c2c12成肌細(xì)胞(atcc)在37℃和5％co2的高葡萄糖dmem培養(yǎng)基中在10％胎牛血清(fbs)中培養(yǎng)，將細(xì)胞接種在含有10％fbs的dmem中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％融合時，通過添加2％的馬血清誘導(dǎo)其分化4天；

6、s3、小鼠處理

7、從南京大學(xué)模型動物研究中心共獲得30只4周齡雄性c57bl/6j小鼠，每籠飼養(yǎng)三到四只小鼠，光照/黑暗周期為12小時，溫度為23±2℃，自由攝取水和含有10％千卡脂肪的食物，適應(yīng)7天后，將小鼠隨機(jī)分為三組，每組10個重復(fù)，小鼠口服0mg/kg、5mg/kg和10mg/kg丹參素鈉8周，將丹參素鈉溶解在生理鹽水中，生理鹽水用作對照，通過頸椎脫位對小鼠實施安樂死，分別收集小鼠的脛骨前肌(ta)、腓腸肌(gas)和股四頭肌(qua)肌肉并稱重，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為體重(mg/g)；

8、s4、握力和運動耐力的測量

9、小鼠口服0mg/kg、5mg/kg和10mg/kg丹參素鈉8周，使用網(wǎng)格強(qiáng)度計測試鼠的抓力強(qiáng)度，將鼠輕輕放置在抓握測試網(wǎng)絡(luò)上，抓握測試儀的杠桿和小鼠身體呈垂直方向，在將測試值設(shè)置為零后，快速拉回小鼠并記錄鼠的最大握力，試驗進(jìn)行了五次，并確定了最大強(qiáng)度，跑步機(jī)運行試驗在xp-pt-10b動物跑步機(jī)上進(jìn)行；

10、s5、耗氧量的評估

11、小鼠口服0mg/kg、5mg/kg和10mg/kg丹參素鈉8周，使用tse實驗室主系統(tǒng)檢測o2消耗量，在測量之前，讓小鼠適應(yīng)24小時，測定24小時內(nèi)消耗的氧氣量；

12、s6、rna提取和實時熒光定量pcr(qpcr)

13、使用trizol試劑從細(xì)胞或肌肉組織中分離總rna，在nanodrop?2000上測量rna濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna的完整性后，primescript?rt試劑逆轉(zhuǎn)錄總rna(1μg)；

14、s7、westernblot

15、根據(jù)制造商的說明，細(xì)胞和組織在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的ripa緩沖液中裂解，蛋白質(zhì)裂解物在5×十二烷基硫酸鈉(sds)樣品緩沖液中在95°c下加熱5分鐘，并通過10％sds-page(每條泳道30μg)分離，然后，使用mini?trans?blot?cell系統(tǒng)將凝膠轉(zhuǎn)移到pvdf膜上，用5％脫脂乳封閉膜1.5小時，將一抗在4℃下孵育過夜，第二天洗滌膜后在室溫下二抗孵育1小時，通過ecl對膜進(jìn)行可視化，一抗myhc1、myhc2a、myhc2b、myhc?2x、pkm1和β-肌動蛋白，其次是igg-hrp結(jié)合抗體，通過ecl觀察膜上的條帶；

16、s8、免疫熒光染色

17、免疫熒光染色中使用的第一抗體是myhc2a、myhc2b和myhc1，第二抗體是抗小鼠fitc、抗兔fitc，在第二抗體步驟后，在黑暗中孵育期間用dapi對細(xì)胞核進(jìn)行染色，通過共聚焦激光掃描顯微鏡捕獲圖像。

18、優(yōu)選的，所述步驟s2中，丹參素鈉溶解在pbs中，用20μm丹參素鈉處理細(xì)胞，pbs用作對照。

19、優(yōu)選的，所述步驟s3中，所有動物試驗均按照周口師范學(xué)院動物福利委員會批準(zhǔn)的方案進(jìn)行(許可證號zknu-2024009，許可證日期2022年3月5日)。

20、優(yōu)選的，所述步驟s4中，將清醒的小鼠放置在初始速度為10m/min的跑步機(jī)上3分鐘，之后將速度增加到30m/min以引起疲勞，當(dāng)小鼠不能再呆在跑步機(jī)上時，記錄到這一點的總跑步距離。

21、優(yōu)選的，所述步驟s5中，對于所有實驗，小鼠在25℃下以12小時的光照/12小時的黑暗周期飼養(yǎng)，自由獲取食物和水。

22、優(yōu)選的，所述步驟s6中，采用lightcycler?96系統(tǒng)進(jìn)行qpcr，使用ct(2-δδct)方法分析相對基因表達(dá)。

23、優(yōu)選的，所述步驟s8中，myhc2a、myhc2b和myhc1的蛋白表達(dá)水平由myhc亞型陽性肌管內(nèi)的細(xì)胞核數(shù)與核總數(shù)的比值決定。

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

25、1、以小鼠成肌細(xì)胞c2c12和c57bl小鼠為模型，分別在細(xì)胞和個體水平探究丹參素鈉調(diào)控肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，丹參素鈉灌胃雄性小鼠，進(jìn)行握力、跑步、westernblot、qpcr和免疫熒光染色的測定，發(fā)現(xiàn)丹參素鈉處理的小鼠，其肌肉質(zhì)量、慢速氧化型肌纖維的百分比、肌肉耐力、耗氧量與myhc1和myhc2a基因表達(dá)增加，而myhc2b基因的表達(dá)和糖酵解肌纖維的百分比降低；

26、2、實驗結(jié)果表明：丹參素鈉通過調(diào)控肌肉纖維類型相關(guān)基因表達(dá)，從而促進(jìn)肌纖維從糖酵解型肌纖維向氧化型肌纖維的轉(zhuǎn)化；

27、3、本發(fā)明加深丹參素鈉對肌纖維類型形成和轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制的認(rèn)識，為畜牧生產(chǎn)中提高豬肉產(chǎn)量和豬肉品質(zhì)及醫(yī)學(xué)上與肌肉相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。