本公開屬于蛋白純化領域，具體的涉及一種單克隆抗體的純化方法。

背景技術：

1、c-c趨化因子受體8蛋白(ccr8)特異性高表達于人腫瘤組織的treg細胞表面，抗ccr8抗體可清除腫瘤組織中的treg細胞，不清除正常組織中的treg細胞，具有很好的安全性；同時可以阻斷ccl1/ccr8通路，與pd-1/pd-l1聯(lián)用預期可提高腫瘤患者的藥物響應率，增強腫瘤免疫。

2、抗人ccr8的單克隆抗體j06為申請人自主研發(fā)的cho細胞表達的創(chuàng)新靶點單克隆抗體藥物。該單克隆抗體完整分子由2條重鏈(heavy?chain,hc)和2條輕鏈(light?chain,lc)組成，每條重鏈由453個氨基酸殘基組成；每條輕鏈由219個氨基酸殘基組成。

3、上述抗人ccr8的單克隆抗體j06可以阻斷ccl1/ccr8通路，與pd-1/pd-l1聯(lián)用預期可提高腫瘤患者的藥物響應率，以增強腫瘤免疫。由于ccr8在腫瘤浸潤的調節(jié)性t細胞(treg)上特異性高表達，通過結合腫瘤部位treg細胞表面的ccr8，啟動adcc特異性的清除腫瘤組織中的treg細胞，因此具有很好的安全性。

4、抗人ccr8的單克隆抗體j06在表達過程中產生了大量的工藝相關雜質(如宿主細胞蛋白殘留、外源性dna殘留等)和產品相關雜質(高分子量物質(hmws)、低分子量物質(lmws)、電荷異構體等)。這些雜質給下游純化工作帶來了巨大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的三步層析，親和捕獲+初步純化+精細純化，雖然能夠達到去除雜質和相關殘留標準的目的。但由于雜質含量高，層析步驟多，會導致整個工藝流程的回收率偏低。

技術實現思路

1、本公開提供了一種兩步層析法純化抗人ccr8的單克隆抗體j06的純化方法。

2、發(fā)明詳述

3、1、術語

4、本說明書中提及的所有公布、專利和專利申請都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和個別地指示將各個別公布、專利或專利申請以引用的方式并入本文。

5、在下文詳細描述本公開前，應理解本公開不限于本文中描述的特定方法學、方案和試劑，因為這些可以變化。還應理解本文中使用的術語僅為了描述具體實施方案，而并不意圖限制本公開的范圍。除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語與本公開所屬領域中普通技術人員通常的理解具有相同的含義。

6、本文所公開的某些實施方案包含了數值范圍，并且本公開的某些方面可采用范圍的方式描述。除非另有說明，應當理解數值范圍或者以范圍描述的方式僅是出于簡潔、便利的目的，并不應當認為是對本公開的范圍的嚴格限定。因此，采用范圍方式的描述應當被認為具體地公開了所有可能的子范圍以及在該范圍內的所有可能的具體數值點，正如這些子范圍和數值點在本文中已經明確寫出。不論所述數值的寬窄，上述原則均同等適用。當采用范圍描述時，該范圍包括范圍的端點。

7、當涉及可測量值比如量、暫時持續(xù)時間等時，術語“約”是指包括指定值的±20％、或在某些情況下±10％、或在某些情況下±5％、或在某些情況下±1％、或在某些情況下±0.1％的變化。

8、本文所用的術語“抗體”，典型是指包含通過共價二硫鍵和非共價相互作用保持在一起的兩條重(h)多肽鏈和兩條輕(l)多肽鏈的y型四聚蛋白。天然igg抗體即具有這樣的結構。每條輕鏈包含一個輕鏈可變結構域(vl)和一個輕鏈恒定結構域(cl)。每條重鏈包含一個重鏈可變結構域(vh)和一個重鏈恒定結構域(ch)(或稱為重鏈恒定區(qū)(ch))。

9、術語“單克隆抗體”(或稱“單抗”)指由單一細胞克隆產生的基本均質、僅針對某一特定抗原表位的抗體。單克隆抗體可以使用本領域中已知的多種技術制備，包括雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、轉基因動物、合成技術或上述技術的組合等。

10、術語“抗原”是指被抗體或抗體結合片段識別并特異性結合的物質，廣義上，抗原可以包括所選靶標的任何免疫原性片段或決定簇，包括單表位、多表位、單結構域、多結構域、完整的胞外結構域(ecd)或蛋白質。肽、蛋白質、糖蛋白、多糖和脂質，其部分及其組合均可構成抗原。非限制性示例性抗原包括腫瘤抗原或病原體抗原等。“抗原”也可以指引發(fā)免疫反應的分子。任何形式的抗原或含有該抗原的細胞或制劑都可以用于生成對抗原決定簇具有特異性的抗體?？乖梢允欠蛛x的全長蛋白質、細胞表面蛋白(例如，用在其表面上表達至少一部分抗原的細胞進行免疫的)、或可溶性蛋白質(例如，僅用該蛋白質的ecd部分進行免疫的)或蛋白質構建體(例如，fc抗原)。該抗原可以在基因修飾的細胞中產生。前述任何抗原可以單獨或與本領域已知的一種或多種免疫原性增強佐劑組合使用。編碼該抗原的dna可以是基因組的或非基因組的(例如，cdna)，并且可以編碼足以引起免疫原性應答的至少一部分ecd?？梢允褂萌魏屋d體來轉化其中表達抗原的細胞，所述載體包括但不限于腺病毒載體、慢病毒載體、質粒以及非病毒載體如陽離子脂質。

11、術語“親和力”或“結合親和力”指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。術語“kd”是指特定的抗體-抗原相互作用的解離常數?？梢允褂帽绢I域已知的各種技術來確定結合親和力，例如表面等離子體共振、生物層干涉法、雙極化干涉法、靜態(tài)光散射、動態(tài)光散射、等溫滴定量熱法、elisa、分析超速離心和流式細胞術等。

12、術語“生物學活性”指抗體結合抗原并導致可測量的生物學反應的能力，所述生物學反應可以在體外或體內進行測量。

13、術語“穩(wěn)定的”制劑是這樣的制劑，其中的蛋白質在保存后基本上保持其物理穩(wěn)定性和/或化學穩(wěn)定性和/或生物學活性。優(yōu)選地，該制劑在保存后基本上保持其物理和化學穩(wěn)定性，以及其生物學活性。一般基于制劑保質期來選擇貯存期。用來測量蛋白質穩(wěn)定性的各種分析技術是本領域已有的?？梢栽谶x定的溫度下測量穩(wěn)定性持續(xù)選定的時間。穩(wěn)定性能夠以許多不同的方式進行定性和/或定量地評估，包括評估聚集物形成(例如利用大小排阻層析，通過測量濁度，和/或通過肉眼觀察)；通過利用陽離子交換層析或毛細管分區(qū)電泳評估電荷異質性；氨基末端或羧基末端序列分析；質譜分析；sds-page分析以比較減小的和完整的抗體；肽圖譜分析；評估生物學活性或抗體的抗原結合功能；等等。不穩(wěn)定性可以包括下列的任一種或多種：聚集，脫酰胺作用(例如asn脫酰胺作用)，氧化作用(例如met氧化作用)，異構化作用(例如asp異構化作用)，剪切/水解/片段化(例如鉸鏈區(qū)片段化)，琥珀酰亞胺形成，未配對的半胱氨酸，n-末端延伸，c-末端加工，糖基化作用差異，等等。

14、術語“穩(wěn)定劑”表示藥學可接受的賦形劑，其在制造，儲存和應用過程中保護活性藥物成分和/或制劑免受化學和/或物理降解。穩(wěn)定劑包括但不限于糖，氨基酸，多元醇，環(huán)糊精等。

15、生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中能夠熟知和獲得，如冷泉港的《抗體實驗技術指南》，5-8章和15章。

16、本公開工程化的抗體可用常規(guī)方法制備。比如，編碼重鏈和輕鏈的cdna序列，可以克隆并重組至表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩(wěn)定地轉染cho細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統(tǒng)會導致抗體的糖基化，特別是在fc區(qū)的高度保守n端。通過表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩(wěn)定的克隆。陽性的克隆在生物反應器的無血清培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)以生產抗體。

17、2、
技術實現要素：

18、本公開的目的是提供了一種兩步層析法純化含抗人ccr8的單克隆抗體的純化方法。

19、本公開提供的一個技術方案是：一種單克隆抗體的純化方法，包括以下步驟：

20、將cho細胞表達的、過濾后的含抗人ccr8的單克隆抗體的細胞培養(yǎng)收獲液經過兩步柱層析，其中第一步柱層析采用mabselect?sure?lx親和層析柱，第二步柱層析采用toyopearl?nh2-750f層析柱，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)中的3個cdr序列依次為：seqid?no:1、seq?id?no:2和seq?id?no:3；輕鏈可變區(qū)中的3個cdr序列依次為：seq?id?no:4、seq?id?no:5和seq?id?no:6。

21、優(yōu)選的，所述純化方法包括以下步驟：

22、(1)將澄清后的含抗人ccr8的單克隆抗體的細胞培養(yǎng)收獲液過mabselect?surelx親和層析柱，洗脫，收集含目的抗體蛋白的洗脫峰；

23、(2)步驟(1)中的親和洗脫峰樣品在低ph條件下孵育；

24、(3)步驟(2)中的樣品深層過濾；

25、(4)步驟(3)中的樣品過toyopearl?nh2-750f層析柱，流穿模式，收集流穿樣品；

26、(5)步驟(4)中的樣品過納濾膜；

27、(6)步驟(5)中的樣品濃縮，置換緩沖液，稀釋。

28、優(yōu)選的，所述步驟(1)中分別用淋洗液1和淋洗液2洗滌雜蛋白，再用洗脫液等梯度洗脫，收集洗脫峰；淋洗液1成分為：50mmol/l?tris，0.2mol/l～0.6mol/l?arg-hcl，ph8.1±0.5；淋洗液2成分為：25mmol/l?tris-hcl，ph8.3±0.5；洗脫液成分為10mmol/l～50mmol/l?naac-hac，ph?3.4±0.4。

29、優(yōu)選的，所述步驟(2)中親和洗脫峰樣品用2mol/l?hac調ph至3.5±0.3，室溫孵育1～4小時結束后用1mol/l?tris調ph至5.3±0.5。

30、優(yōu)選的，所述步驟(3)中采用merck?a1hc深層過濾器對樣品進行深層過濾，載量

31、≤5000g/m2。

32、優(yōu)選的，所述步驟(4)中層析柱用25mmol/l?naac-hac，ph5.3±0.5溶液平衡后將樣品進行上樣。

33、優(yōu)選的，所述步驟(5)中樣品先過pro?shield預過濾膜；再過pro?device納濾膜；納濾膜pro?device載量小于5000g/m2。

34、優(yōu)選的，所述步驟(6)中樣品濃縮、置換緩沖液所選膜包為merck超濾膜包；置換緩沖液為8～12mmol/l?hac-naoh，7％～11％蔗糖，ph?5.0±0.5；樣品原液濃度最終控制在20g/l±2g/l；樣品原液中添加的輔料為終濃度0.03％～0.07％聚山梨酯80。

35、優(yōu)選的，所述抗人ccr8的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的序列如seq?id?no:7所示，輕鏈可變區(qū)的序列如seq?id?no:8所示。

36、優(yōu)選的，所述抗人ccr8的單克隆抗體重鏈的序列如seq?id?no:9所示，輕鏈的序列如seq?id?no:10所示。

37、本公開提供的一個技術方案是：上述純化方法獲得的含抗人ccr8的單克隆抗體。

38、本公開提供的一個技術方案是：上述抗人ccr8的單克隆抗體在制備用于治療晚期實體瘤的藥物中的用途。

39、本公開所述的純化方法，具有以下有益效果：

40、相對于現有的純化技術，本公開的優(yōu)越之處在于：本公開純化步驟少，樣品回收率高，工藝穩(wěn)定，可線性放大，可獲得比較高純度的目的單克隆抗體，宿主細胞蛋白、dna等殘留少，具有比較高的生物活性和生物安全性。