：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及編碼基因、蛋白、表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞及其構(gòu)建方法和用途。

背景技術(shù)

0、
背景技術(shù)：

1、近年來嵌合抗原受體t細(xì)胞療法(chimeric?antigen?receptor?t-cellimmunotherapy,car-t)已成為最有前景的腫瘤細(xì)胞免疫療法。car結(jié)構(gòu)一般包括四個部分：抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，通過基因工程技術(shù)將四部分依次串聯(lián)融合表達于t細(xì)胞膜上，從而賦予t細(xì)胞靶向殺傷能力。盡管car-t細(xì)胞在血液系統(tǒng)腫瘤取得顯著成效，但存在的諸多問題不容忽視，包括：細(xì)胞因子風(fēng)暴、移植物抗宿主病、制備成本高昂、制備周期長等。更為重要的是，car-t細(xì)胞對于實體腫瘤療效欠佳，腫瘤微環(huán)境的免疫抑制使t細(xì)胞難以發(fā)揮理想的殺傷效果。尋找一款安全、有效的細(xì)胞替代療法進行實體腫瘤治療非常必要。

2、自然殺傷(nk)細(xì)胞是固有免疫的重要組成部分，主要通過釋放穿孔素、顆粒酶及分泌細(xì)胞因子ifn-γ、tnf-α等發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用。nk細(xì)胞無需抗原致敏即可發(fā)揮細(xì)胞殺傷效應(yīng)。由于car-t細(xì)胞存在的毒副作用和高昂費用，car-nk細(xì)胞治療逐漸興起。car-nk是在nk細(xì)胞表面表達car分子來識別靶抗原，進而殺傷靶細(xì)胞。相比于car-t治療，car-nk細(xì)胞有獨特優(yōu)勢，包括：①car-nk細(xì)胞不會分泌il-1、il-6等引起細(xì)胞因子風(fēng)暴的炎癥因子，降低了細(xì)胞因子風(fēng)暴、神經(jīng)毒性等毒副反應(yīng)；②car-nk細(xì)胞多種殺傷機制可清除靶抗原低表達或不表達的腫瘤細(xì)胞，減少靶抗原陰性細(xì)胞腫瘤復(fù)發(fā)；③異體移植的car-nk細(xì)胞不會引起移植物抗宿主??；④nk細(xì)胞有多種來源，滿足自身細(xì)胞受多次化療影響的患者需求；⑤car-nk細(xì)胞可提供及時的“現(xiàn)貨型”治療。

3、自然殺傷細(xì)胞2族成員d(nkg2d)是nk細(xì)胞最重要的活化性受體之一，通過識別靶細(xì)胞表面的nkg2d配體(nkg2dl)來傳遞活化信號，并激活nk細(xì)胞對靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用。nkg2dl位于6號染色體不同位置，共有8個成員，包括：mica、micb、ulbp1-6。nkg2dl在正常細(xì)胞中不表達或表達量非常少，但是在腫瘤、感染及自身免疫性疾病等情況下，配體表達量顯著上升。近年nkg2d/nkg2dl成為腫瘤免疫治療的新靶點，在研藥物以car-t細(xì)胞為主，集中在臨床早期，適應(yīng)癥主要是血液系統(tǒng)腫瘤，在實體瘤中存在腫瘤部位浸潤和活化不良等問題，療效不佳。

4、近年研究顯示，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)對t細(xì)胞進入腫瘤微環(huán)境形成物理屏障，阻止t細(xì)胞對實體腫瘤發(fā)揮殺傷作用。同時，這些細(xì)胞也抑制了t細(xì)胞的殺傷功能。成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap)是腫瘤間質(zhì)中活化成纖維細(xì)胞表達的表面抗原，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。生理條件下，fap在大多數(shù)成人組織中表達量較低。腫瘤環(huán)境下，fap在多種腫瘤細(xì)胞均有不同程度升高，中位數(shù)最高的是胰腺癌和乳腺癌。大多數(shù)上皮癌中，fap在腫瘤間質(zhì)的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞中高表達。由此可見，fap既可以在腫瘤細(xì)胞表面表達，也廣泛存在于腫瘤微環(huán)境的成纖維細(xì)胞。當(dāng)car細(xì)胞靶向殺傷這些表達fap的腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞時，有望實現(xiàn)對微環(huán)境的浸潤并強化對腫瘤細(xì)胞的攻擊能力，具備更有效的腫瘤殺傷能力。

5、il-15作為趨化因子家族的一員，近年研究發(fā)現(xiàn)其可刺激nk細(xì)胞擴增活化并加強對靶細(xì)胞清除能力。可溶性重組il-15和il-15激動劑在臨床前小鼠模型均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用。本專利構(gòu)建了能夠分泌功能刺激因子il-15的car-nk細(xì)胞，增強了其抗腫瘤能力。同時，本專利還提供了新型跨膜結(jié)構(gòu)ncr2tm和新型共刺激分子結(jié)構(gòu)cd226，進一步提升car-nk細(xì)胞靶向殺傷性能。

6、構(gòu)建一款安全性和有效性俱佳的car-nk細(xì)胞，能夠精準(zhǔn)靶向腫瘤細(xì)胞特異靶點、增強微環(huán)境浸潤并加強殺瘤活性，對于實體瘤攻克至關(guān)重要。本發(fā)明將開發(fā)表達il-15并靶向fap和nkg2dl的雙靶點car-nk細(xì)胞，并提供跨膜ncr2tm和共刺激分子cd226新型結(jié)構(gòu)序列，一方面相比單靶點有助于防止腫瘤免疫逃逸、增強對腫瘤細(xì)胞的特異性識別和殺傷；另一方面通過分泌功能刺激因子il-15，使得清除靶細(xì)胞過程能保持足夠殺傷活力并發(fā)揮持久功能效應(yīng)。該細(xì)胞療法有望推動腫瘤細(xì)胞治療領(lǐng)域的巨大突破。

技術(shù)實現(xiàn)思路

0、
技術(shù)實現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明的目的在于提供一種編碼基因、蛋白、表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞及其構(gòu)建方法和用途。

2、為解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

3、一種編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列如seq?no1所示。

4、一種蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq?no2所示。

5、一種表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞，所述nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞內(nèi)含有表達如seq?no1所示編碼基因的核苷酸序列。

6、一種表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

7、步驟一、構(gòu)建pkn0153逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒，所述pkn0153逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒中含有seq?no1所示的氨基酸序列；

8、步驟二、擴增pkn0153逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒；

9、步驟三、將pkn0153逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒導(dǎo)入nk細(xì)胞，即得到nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞。

10、進一步的改進，所述nk細(xì)胞為人的nk細(xì)胞。

11、一種表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞的用途，所述表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞如權(quán)利要求3或4所述；所述表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞用作治療腫瘤的藥物。

12、進一步的改進，所述腫瘤為實體瘤。

13、進一步的改進，所述實體瘤為人乳腺癌細(xì)胞瘤。

14、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明創(chuàng)造具有以下優(yōu)勢：

15、本發(fā)明開發(fā)表達il-15并靶向fap和nkg2dl的雙靶點car-nk細(xì)胞，并提供跨膜ncr2tm和共刺激分子cd226新型結(jié)構(gòu)序列，一方面相比單靶點有助于防止腫瘤免疫逃逸、增強對腫瘤細(xì)胞的特異性識別和殺傷；另一方面通過分泌功能刺激因子il-15，使得清除靶細(xì)胞過程能保持足夠殺傷活力并發(fā)揮持久功能效應(yīng)。該細(xì)胞療法有望推動腫瘤細(xì)胞治療領(lǐng)域的巨大突破。

技術(shù)特征：

1.一種編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如seq?no1所示。

2.一種蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如seq?no2所示。

3.一種表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞，其特征在于，所述nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞內(nèi)含有表達如seq?no1所示編碼基因的核苷酸序列。

4.一種表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

5.如權(quán)利要求4所述的表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述nk細(xì)胞為人的nk細(xì)胞。

6.一種表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞的用途，其特征在于，所述表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞如權(quán)利要求3或4所述；所述表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞用作治療腫瘤的藥物。

7.如權(quán)利要求6所述的表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞的用途，其特征在于，所述腫瘤為實體瘤。

8.如權(quán)利要求7所述的表達il-15的nkg2dl-fap雙靶點car-nk細(xì)胞的用途，其特征在于，所述實體瘤為人乳腺癌細(xì)胞瘤。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種編碼基因、蛋白、表達IL?15的NKG2DL?FAP雙靶點CAR?NK細(xì)胞及其構(gòu)建方法和用途，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ?NO1所示。本發(fā)明一方面相比單靶點有助于防止腫瘤免疫逃逸、增強對腫瘤細(xì)胞的特異性識別和殺傷；另一方面通過分泌功能刺激因子IL?15，使得清除靶細(xì)胞過程能保持足夠殺傷活力并發(fā)揮持久功能效應(yīng)。該細(xì)胞療法有望推動腫瘤細(xì)胞治療領(lǐng)域的巨大突破。

技術(shù)研發(fā)人員：劉夙璇,傅芃,王國坤,曾振宇
受保護的技術(shù)使用者：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9