本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種艾葉ssr標(biāo)記引物及其在構(gòu)建艾葉指紋圖譜中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、公開(kāi)該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

2、艾葉是菊科蒿屬植物艾artemisia?argyi?lévl.et?van的干燥葉，又名冰臺(tái)、醫(yī)草、灸草等，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，有著悠久應(yīng)用歷史。具有溫經(jīng)止血、散寒止痛和外用祛濕止癢的功效；臨床上還可用于吐血、崩漏、月經(jīng)過(guò)多、胎漏下血、精寒不調(diào)等；同時(shí)它又是國(guó)際上著名艾灸療法的主要原材料，以及大量藥品保健品的原料藥材。艾野生資源豐富，全國(guó)大部分地區(qū)均有分布。

3、針對(duì)艾葉進(jìn)行的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、臨床及日常應(yīng)用方面，在分子生物學(xué)方面針對(duì)艾葉遺傳多樣性的研究較少。近年來(lái)，隨著艾葉市場(chǎng)需求量的不斷擴(kuò)大，艾的野生資源供不應(yīng)求，許多地區(qū)開(kāi)始大面積種植艾。由于蒿屬物種形態(tài)相似，艾的混偽品眾多，且艾種質(zhì)資源存在復(fù)雜的遺傳變異，導(dǎo)致艾在人工栽培過(guò)程中出現(xiàn)了引種混亂、種質(zhì)不清、品種退化等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了艾的產(chǎn)量和質(zhì)量，制約了艾種質(zhì)資源的保護(hù)與利用，因此開(kāi)發(fā)一套分子標(biāo)記來(lái)保護(hù)艾葉種質(zhì)遺傳多樣性迫在眉睫。

4、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple?sequence?repeats)，又稱微衛(wèi)星dna，是一類由幾個(gè)核苷酸(一般為1-6個(gè))為重復(fù)單位組成數(shù)個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列；具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、多等位基因、共顯性、數(shù)量豐富、基因組覆蓋性好和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源研究、雜種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、目的基因定位、遺傳多樣性研究等。

5、相較于形態(tài)鑒定的方法，dna指紋圖譜具有高度的個(gè)體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，dna指紋圖譜是一種可以有效進(jìn)行品系鑒定技術(shù)手段之一，dna指紋圖譜以個(gè)體內(nèi)核苷酸位點(diǎn)變異為基礎(chǔ)，根據(jù)不同品系間基因組上的差異特征，對(duì)品系進(jìn)行鑒定區(qū)分。開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記是構(gòu)建指紋圖譜的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但目前尚未利用標(biāo)記構(gòu)建大規(guī)模艾葉種質(zhì)資源dna指紋圖譜，而艾葉種質(zhì)資源dna指紋圖譜對(duì)于種質(zhì)資源鑒定有非常重要的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供了一種艾葉srr標(biāo)記引物、標(biāo)記引物組合和指紋圖譜，利用28對(duì)ssr引物開(kāi)展了139份艾葉種質(zhì)資源的的遺傳多樣性分析，利用多態(tài)性信息含量進(jìn)一步簡(jiǎn)化引物的使用量，篩選出6對(duì)核心ssr引物，構(gòu)建了139份艾葉種質(zhì)資源的dna指紋圖譜，同時(shí)為艾葉種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒定及優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。

2、本發(fā)明提供的28對(duì)ssr引物，能夠利用ssr技術(shù)進(jìn)行139份艾葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，為艾葉核心種質(zhì)的構(gòu)建以及種質(zhì)資源的育種利用奠定基礎(chǔ)。

3、所述的28對(duì)ssr標(biāo)記引物包括ssr40、ssr99、ssr109、ssr14、ssr03、ssr15、ssr79、ssr01、ssr191、ssr10、ssr95、ssr65、ssr33、ssr31、ssr172、ssr09、ssr22、ssr55、ssr182、ssr92、ssr70、ssr34、ssr46、ssr162、ssr114、ssr06、ssr118、ssr175，引物序列如seq?idno:1-56所示。

4、通過(guò)本發(fā)明的指紋圖譜即可對(duì)139份艾葉種質(zhì)資源實(shí)現(xiàn)品系區(qū)分，每一品種都具有唯一確定的指紋圖譜，具備高準(zhǔn)確性和高特異性，如“四大名艾”中蘄艾(hbqq)的指紋圖譜為：00000000100000?100100000000000?000000000000001000000?000110000000010010000100；海艾(zjnb2)的指紋圖譜為：00000100010000?000000000000000?000000000000100000000?000010010000000001000100；祁艾(hebbd2)的指紋圖譜為：000000100000000000000000000000000000000?00011010000?1000001000000?00000001000；北艾(henay)的指紋圖譜為：00010000010000?000000000000010?0000100000?00010000100000010000000000000000010。

5、值得注意的是，本發(fā)明提供的6對(duì)核心標(biāo)記，建立了首個(gè)包含139份艾葉種質(zhì)的dna指紋信息數(shù)據(jù)庫(kù)，為艾葉種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒定提供了有效途徑；且在6對(duì)核心標(biāo)記中任意去除一對(duì)都會(huì)導(dǎo)致指紋圖譜失效，無(wú)法準(zhǔn)確鑒定艾葉種質(zhì)資源，在6對(duì)核心標(biāo)記中任意增加一對(duì)，也不會(huì)對(duì)鑒定產(chǎn)生有益效果。

6、第一方面，本發(fā)明提供了一種艾葉ssr標(biāo)記引物，所述艾葉ssr標(biāo)記引物包括如下引物中的一對(duì)；

7、ssr40，其包括核苷酸序列如seq?id?no.1～2所示的正向、反向引物；

8、ssr99，其包括核苷酸序列如seq?id?no.3～4所示的正向、反向引物；

9、ssr109，其包括核苷酸序列如seq?id?no.5～6所示的正向、反向引物；

10、ssr14，其包括核苷酸序列如seq?id?no.7～8所示的正向、反向引物；

11、ssr03，其包括核苷酸序列如seq?id?no.9～10所示的正向、反向引物；

12、ssr15，其包括核苷酸序列如seq?id?no.11～12所示的正向、反向引物；

13、ssr79，其包括核苷酸序列如seq?id?no.13～14所示的正向、反向引物；

14、ssr01，其包括核苷酸序列如seq?id?no.15～16所示的正向、反向引物；

15、ssr191，其包括核苷酸序列如seq?id?no.17～18所示的正向、反向引物；

16、ssr10，其包括核苷酸序列如seq?id?no.19～20所示的正向、反向引物；

17、ssr95，其包括核苷酸序列如seq?id?no.21～22所示的正向、反向引物；

18、ssr65，其包括核苷酸序列如seq?id?no.23～24所示的正向、反向引物；

19、ssr33，其包括核苷酸序列如seq?id?no.25～26所示的正向、反向引物；

20、ssr31，其包括核苷酸序列如seq?id?no.27～28所示的正向、反向引物；

21、ssr172，其包括核苷酸序列如seq?id?no.29～30所示的正向、反向引物；

22、ssr09，其包括核苷酸序列如seq?id?no.31～32所示的正向、反向引物；

23、ssr22，其包括核苷酸序列如seq?id?no.33～34所示的正向、反向引物；

24、ssr55，其包括核苷酸序列如seq?id?no.35～36所示的正向、反向引物；

25、ssr182，其包括核苷酸序列如seq?id?no.37～38所示的正向、反向引物；

26、ssr92，其包括核苷酸序列如seq?id?no.39～40所示的正向、反向引物；

27、ssr70，其包括核苷酸序列如seq?id?no.41～42所示的正向、反向引物；

28、ssr34，其包括核苷酸序列如seq?id?no.43～44所示的正向、反向引物；

29、ssr46，其包括核苷酸序列如seq?id?no.45～46所示的正向、反向引物；

30、ssr162，其包括核苷酸序列如seq?id?no.47～48所示的正向、反向引物；

31、ssr114，其包括核苷酸序列如seq?id?no.49～50所示的正向、反向引物；

32、ssr06，其包括核苷酸序列如seq?id?no.51～52所示的正向、反向引物；

33、ssr118，其包括核苷酸序列如seq?id?no.53～54所示的正向、反向引物；

34、ssr175，其包括核苷酸序列如seq?id?no.55～56所示的正向、反向引物。

35、第二方面，本發(fā)明提供了一種艾葉ssr標(biāo)記引物組合，包括上述所述的艾葉ssr標(biāo)記引物中的兩對(duì)或兩對(duì)以上，

36、(1)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr40引物：

37、seq?id?no:1:ssr40-f:5’-acaacctcttaccaccca-3’；

38、seq?id?no:2:ssr40-r:5’-ccctcactttatcccaat-3’；

39、(2)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr99引物：

40、seq?id?no:3:ssr99-f:5’-aatcgttgacgcattcctt-3’；

41、seq?id?no:4:ssr99-r:5’-ttgttgtagcagcagatgagtta-3’；

42、(3)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr109引物：

43、seq?id?no:5:ssr109-f:5’-tacgcaatacacaatagtcaaagtc-3’；

44、seq?id?no:6:ssr109-r:5’-catcagatccatcgttccaac-3’；

45、(4)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr14引物：

46、seq?id?no:7:ssr14-f:5’-agagcctagaatccaacg-3’；

47、seq?id?no:8:ssr14-r:5’-atgcgataccgaatgtga-3’；

48、(5)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr03引物：

49、seq?id?no:9:ssr03-f:5’-caaccaaaccacagggac-3’；

50、seq?id?no:10:ssr03-r:5’-cacagctcaaggcaacac-3’；

51、(6)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr15引物：

52、seq?id?no:11:ssr15-f:5’-ctcctccacctccactca-3’；

53、seq?id?no:12:ssr15-r:5’-gaatcaggctcaagcaaa-3’；

54、(7)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr79引物：

55、seq?id?no:13:ssr79-f:5’-taatgattgagacacccttttg-3’；

56、seq?id?no:14:ssr79-r:5’-agcagccacttcacccag-3’；

57、(8)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr01引物：

58、seq?id?no:15:ssr01-f:5’-ctatgcctggttcggtggtc-3’；

59、seq?id?no:16:ssr01-r:5’-tgtcgtcgtcgccttcct-3’；

60、(9)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr191引物：

61、seq?id?no:17:ssr191-f:5’-tttcacactctccctcgtcttc-3’；

62、seq?id?no:18:ssr191-r:5’-aactgttgcggttttggtactc-3’；

63、(10)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr10引物：

64、seq?id?no:19:ssr10-f:5’-atggatctccgtcgtcta-3’；

65、seq?id?no:20:ssr10-r:5’-tctgaaccctaaccaactc-3’；

66、(11)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr95引物：

67、seq?id?no:21:ssr95-f:5’-caggtgtatggatggatgtgc-3’；

68、seq?id?no:22:ssr95-r:5’-cttgttggaacccagcataaat-3’；

69、(12)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr65引物：

70、seq?id?no:23:ssr65-f:5’-ttatctcacctggcacttgg-3’；

71、seq?id?no:24:ssr65-r:5’-tgtggaatagggacctcatg-3’；

72、(13)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr33引物：

73、seq?id?no:25:ssr33-f:5’-attaaattccacgccatca-3’；

74、seq?id?no:26:ssr33-r:5’-ggaggtgtcccaacaaac-3’；

75、(14)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr31引物：

76、seq?id?no:27:ssr31-f:5’-tcgctgttggatgaagtg-3’；

77、seq?id?no:28:ssr31-r:5’-ctaagcatggtttgtggg-3’；

78、(15)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr172引物：

79、seq?id?no:29:ssr172-f:5’-ccttcattcaactcactccaa-3’；

80、seq?id?no:30:ssr172-r:5’-aaaaacccccataaatcccta-3’；

81、(16)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr09引物：

82、seq?id?no:31:ssr09-f:5’-ccctccagtgaaatacga-3’；

83、seq?id?no:32:ssr09-r:5’-gcatctgtcccacttctg-3’；

84、(17)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr22引物：

85、seq?id?no:33:ssr22-f:5’-tggaaataaggacgaatg-3’；

86、seq?id?no:34:ssr22-r:5’-aacacggcaaataactc-3’；

87、(18)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr55引物：

88、seq?id?no:35:ssr55-f:5’-acggcgttcgtttattcc-3’；

89、seq?id?no:36:ssr55-r:5’-ggtccttcccatcctgtg-3’；

90、(19)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr182引物：

91、seq?id?no:37:ssr182-f:5’-taaagaagcagtgagaacaagcatc-3’；seq?id?no:38:ssr182-r:5’-ggtatcaataaaagtcaagcgaagt-3’；

92、(20)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr92引物：

93、seq?id?no:39:ssr92-f:5’-cccaaccaccaacggcac-3’；

94、seq?id?no:40:ssr92-r:5’-tgagaaaaaggtcgtagaggagg-3’；

95、(21)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr70引物：

96、seq?id?no:41:ssr70-f:5’-gatgggtatggaaagacga-3’；

97、seq?id?no:42:ssr70-r:5’-ataaacttgccaggctcaa-3’；

98、(22)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr34引物：

99、seq?id?no:43:ssr34-f:5’-ttgtgggatgctgtttgc-3’；

100、seq?id?no:44:ssr34-r:5’-ttggtggtactggaagaagt-3’；

101、(23)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr46引物：

102、seq?id?no:45:ssr46-f:5’-cgccaatgggtccttcgt-3’；

103、seq?id?no:46:ssr46-r:5’-tgggcactttctggagtgtatt-3’；

104、(24)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr162引物：

105、seq?id?no:47:ssr162-f:5’-cacaaaagtcactatccctctcg-3’；

106、seq?id?no:48:ssr162-r:5’-ttcaaggtttaggcaccacaata-3’；

107、(25)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr114引物：

108、seq?id?no:49:ssr114-f:5’-cactcgtgttctccttggctt-3’；

109、seq?id?no:50:ssr114-r:5’-gaatcggtcaggtacttggcta-3’；

110、(26)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr06引物：

111、seq?id?no:51:ssr06-f:5’-acctggtttccgacttga-3’；

112、seq?id?no:52:ssr06-r:5’-acacgcacatcattccct-3’；

113、(27)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr118引物：

114、seq?id?no:53:ssr118-f:5’-caaaccacaatacaggtcgca-3’；

115、seq?id?no:54:ssr118-r:5’-tgttttgtattttcgtcctttgg-3’；

116、(28)擴(kuò)增ssr分子標(biāo)記的ssr175引物：

117、seq?id?no:55:ssr175-f:5’-agaacaaatatccaaaaccacaa-3’；

118、seq?id?no:56:ssr175-r:5’-cagaaggtataacaaagtagccg-3’。

119、進(jìn)一步的，所述組合為ssr40、ssr99、ssr109、ssr14、ssr03、ssr15的組合。

120、第三方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒至少包含上述的艾葉ssr標(biāo)記引物或艾葉ssr標(biāo)記引物組合。

121、第四方面，本發(fā)明提供了上述的艾葉ssr標(biāo)記引物、艾葉ssr標(biāo)記引物組合或試劑盒在如下任意一種或多種中的應(yīng)用：

122、1)艾葉遺傳多樣性分析；

123、2)構(gòu)建艾葉遺傳圖譜；

124、3)艾葉的種質(zhì)鑒定；

125、4)艾葉親緣關(guān)系分析；

126、5)艾葉功能基因挖掘；

127、6)艾葉分子標(biāo)記輔助育種；

128、優(yōu)選的，所述應(yīng)用2)中，構(gòu)建艾葉遺傳圖譜具體為構(gòu)建艾葉指紋圖譜。

129、第五方面，本發(fā)明提供了一種艾葉遺傳多樣性或種質(zhì)鑒定或構(gòu)建艾葉指紋圖譜的方法，包括以下步驟：

130、(1)提取待測(cè)艾葉樣品的總dna；

131、(2)使用上述艾葉ssr標(biāo)記引物、艾葉ssr標(biāo)記引物組合或試劑盒，每對(duì)引物的正向引物加上通用m13接頭序列，得到m13接頭正向引物；

132、(3)以步驟(1)提取的總dna作為模板，分別用上述艾葉ssr標(biāo)記引物、艾葉ssr標(biāo)記引物組合或試劑盒中所述的每對(duì)引物的反向引物、m13接頭正向引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到熒光pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

133、(4)所述熒光pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，獲得電泳數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)條帶檢測(cè)結(jié)果；

134、(5)根據(jù)步驟(4)中的統(tǒng)計(jì)條帶檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行艾葉遺傳多樣性分析、聚類分析多態(tài)信息含量pic計(jì)算及dna指紋圖譜的構(gòu)建。

135、其中，所述艾葉樣品為艾葉幼嫩葉片。

136、進(jìn)一步的，所述步驟(3)中，所述pcr擴(kuò)增的體系為10μl，包括：2μl濃度為50ng/μl的dna模板、5μl的2×es?taq?msatermix、0.04μl濃度為10pmol/μl的m13接頭正向引物、0.25μl濃度為10pmol/μl的反向引物、0.15μlm13熒光修飾基團(tuán)、2.56μl的h2o。

137、進(jìn)一步的，所述步驟(3)中，所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min、94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s、共35個(gè)循環(huán)；最終72℃末端延伸5min，4℃保存。

138、進(jìn)一步的，所述步驟(5)的遺傳多樣性分析和種質(zhì)遺傳鑒定的具體方法如下：

139、a.根據(jù)所述步驟(4)中條帶檢測(cè)結(jié)果，記錄每對(duì)引物對(duì)應(yīng)的每個(gè)艾葉樣本的擴(kuò)增片段大小；

140、b.根據(jù)綜合整理得到的擴(kuò)增片段大小，利用popgen32軟件計(jì)算各引物對(duì)的以下遺傳多樣性參數(shù)，如等位基因數(shù)量(na)、有效等位基因數(shù)量(ne)、香農(nóng)信息指數(shù)(i)和不同引物等位基因頻率等，在用popgen32軟件計(jì)算不同引物等位基因后，用pic_cale軟件計(jì)算多態(tài)信息含量(pic)；

141、c.根據(jù)所述步驟a中綜合整理得到的擴(kuò)增片段大小，按照擴(kuò)增片段從大到小編號(hào)和讀取，有擴(kuò)增條帶出現(xiàn)記為“1”，無(wú)條帶出現(xiàn)記為“0”，建立原始矩陣，導(dǎo)入mega11軟件繪制n-j樹(shù)并使用原始矩陣構(gòu)建139份艾葉種質(zhì)資源的dna指紋圖譜。

142、第六方面，本發(fā)明提供了一種艾葉指紋圖譜，所述艾葉指紋圖譜由權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述方法構(gòu)建而成，其中，等位基因全部轉(zhuǎn)化為1/0格式，以1和0分別代表檢測(cè)到和未檢測(cè)到的相應(yīng)片段。

143、進(jìn)一步的，所述艾葉指紋圖譜包括139種艾葉品種；

144、進(jìn)一步的，所述艾葉指紋圖譜由所述艾葉ssr標(biāo)記引物ssr40、ssr99、ssr109、ssr14、ssr03、ssr15的組合構(gòu)建。

145、第七方面，本發(fā)明提供了上述的艾葉指紋圖譜在艾葉種質(zhì)資源的品系區(qū)分中的應(yīng)用。

146、為了開(kāi)展分子生物學(xué)ssr標(biāo)記輔助鑒定艾葉種質(zhì)資源，促進(jìn)艾葉良種選育，加快種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用，保護(hù)艾葉種質(zhì)資源多樣性，本發(fā)明開(kāi)發(fā)了艾葉的ssr引物，為艾葉種質(zhì)資源評(píng)估、dna指紋圖譜構(gòu)建、篩選核心種質(zhì)等研究提供科學(xué)依據(jù)。

147、具體的，以139份艾葉種質(zhì)資源為材料，通過(guò)ssr標(biāo)記技術(shù)對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析和dna指紋圖譜構(gòu)建，為艾葉種質(zhì)資源的分子鑒定提供了依據(jù)。

148、上述技術(shù)方案中的一個(gè)或一些技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)或有益效果：

149、1.本發(fā)明通過(guò)艾葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)出的ssr分子標(biāo)記具有較高的多態(tài)性潛能，在種質(zhì)鑒定方面有著較高的實(shí)用性；通過(guò)試驗(yàn)篩選到了28對(duì)ssr引物，利用ssr技術(shù)進(jìn)行了139份艾葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，為艾葉核心種質(zhì)的構(gòu)建以及種質(zhì)資源的育種利用奠定基礎(chǔ)。

150、2.本發(fā)明利用ssr標(biāo)記，以艾葉種質(zhì)資源圃中已收集的種質(zhì)為試材，通過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)，根據(jù)引物的多態(tài)信息含量進(jìn)一步簡(jiǎn)化引物的使用量，篩選出6對(duì)核心標(biāo)記，建立了首個(gè)包含139份艾葉種質(zhì)的dna指紋圖譜，該方法快速、準(zhǔn)確、精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，并且可以同時(shí)鑒定多個(gè)品種，方便快捷，同時(shí)為艾葉種質(zhì)資源的鑒定與分類、種質(zhì)創(chuàng)新及新品種選育提供理論與技術(shù)支撐。