本發(fā)明涉及基因工程，特別是涉及一種靶向ush2a基因pre-mrna的snrna及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、usher綜合征(usher?syndrome)是一類遺傳性疾病，又稱耳聾-色素性視網(wǎng)膜炎綜合征，其特征是不同程度的先天性感音神經(jīng)性耳聾，以及色素性視網(wǎng)膜炎(rp)引起的進(jìn)行性視力喪失。

2、在臨床上usher綜合征可分為3種類型：1、i型usher綜合征，患者的聽力方面會出現(xiàn)先天性重深度感音神經(jīng)性耳聾，前庭反應(yīng)方面會出現(xiàn)前庭反應(yīng)消失，視力方面會在青春期前出現(xiàn)色素性視網(wǎng)膜炎，然后逐漸致盲，與該類型關(guān)聯(lián)的基因有myo7a、cdh23、ush1c、pchd15等；2、ii型usher綜合征，患者的聽力方面會出現(xiàn)先天性中重度感音神經(jīng)性耳聾，前庭反應(yīng)正常，視力方面會在青春期出現(xiàn)色素性視網(wǎng)膜炎，逐漸致盲，與該類型關(guān)聯(lián)的基因有ush2a、gpr98、whrn等；3、iii型usher綜合征，患者的聽力方面會出現(xiàn)進(jìn)行性感音神經(jīng)性耳聾，前庭反應(yīng)正常，視力方面會在青春期末出現(xiàn)色素性視網(wǎng)膜炎，逐漸致盲，與該類型關(guān)聯(lián)的基因有clrn1等。

3、上述三種類型的usher綜合征中，ii型usher綜合征占usher綜合癥的比例超過50％，而ush2a基因突變是usher綜合征ii型的最常見原因，涵蓋超過50％的usher綜合征患者。同時，ush2a基因的突變也是導(dǎo)致非綜合征性視網(wǎng)膜色素變性(nsrp)的重要原因之一。

4、ush2a定位于1q41(第1號染色體，長臂，4區(qū)，1帶)，其在基因組中的跨度超過800kb，編碼一個大型跨膜蛋白u(yù)sherin，其錨定在視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和內(nèi)耳毛細(xì)胞的質(zhì)膜上，是纖毛發(fā)育和維持必不可少的組分。在視網(wǎng)膜中，usherin是ush2復(fù)合物的重要部分，被認(rèn)為在穩(wěn)定光感受器的外節(jié)段發(fā)揮作用。ush2a具有2個亞型，在視網(wǎng)膜細(xì)胞中主要的亞型含有72個exon，編碼區(qū)長度約為15.6kb。usherin蛋白的胞外部分包含許多重復(fù)的結(jié)構(gòu)域，包括10個laminin?egf-like(le)結(jié)構(gòu)域和35個fibronectin?type?3(fn3)結(jié)構(gòu)域。人ush2a外顯子13長度為642bp，編碼著第723～936位氨基酸，為usherin蛋白中10個le結(jié)構(gòu)域中的4個。

5、迄今為止已經(jīng)鑒定出超過1000個分布在整個ush2a基因中的致病性突變。ush2a基因的第17號外顯子、第24號外顯子、第45號外顯子和第50號外顯子的突變會引發(fā)usher綜合征，而這四個外顯子位于重復(fù)的laminin?egf-like(le)結(jié)構(gòu)域或fibronectin?type?3(fn3)結(jié)構(gòu)域，長度分別為495bp、102bp、210bp、219bp，因此該外顯子的剪接跳躍不會引起閱讀框移碼。迄今為止，ush2a基因第17號外顯子的致病性突變，包括c.3332t>g、c.3368a>g、c.3403_3404del、c.3407g>a、c.3420_3423del、c.3464_3468del、c.3507g>c、c.3518c>a、c.3544t>c、c.3558del、c.3629t>c、c.3635c>t、c.3680del、c.3680dup、c.3684t>a、c.3713c>g、c.3722_3729delinstca、c.3737dup、c.3754c>t、c.3788g>a；ush2a基因第24號外顯子的致病性突變，包括c.4894del、c.4933g>t、c.4948g>a、c.4957c>t；ush2a基因第45號外顯子的致病性突變，包括c.8890dup、c.8906c>g、c.8917_8918del、c.8917_8918delct、c.8954del、c.8972_8973del、c.8981g>a、c.9002a>g、c.9014g>c。迄今為止，ush2a基因第50號外顯子的致病性突變，包括c.9751t>c、c.9753t>a、c.9770dup、c.9788_9808del、c.9791del、c.9799t>c、c.9801c>g、c.9804t>a、c.9811del、c.9815c>t、c.9844t>c、c.9860_9875del、c.9866g>t、c.9874c>t、c.9882c>g、c.9883t>c、c.9912dup、c.9915g>c、c.9924_9927dup、c.9958g>t。而針對以上基因突變引起的視網(wǎng)膜疾病尚無相關(guān)基因治療方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，有必要針對上述由于ush2a基因突變引起的視網(wǎng)膜疾病尚無相關(guān)基因治療方法的問題，提供一種靶向ush2a基因pre-mrna的snrna，該snrna可促進(jìn)外顯子17、24、45、50跳讀，且具有較高的跳讀效率，從而可通過對ush2a基因外顯子17、24、45、50的跳讀，針對該ush2a基因引起的視網(wǎng)膜疾病進(jìn)行基因治療。

2、本發(fā)明公開了一種靶向ush2a基因pre-mrna的snrna，該snrna的識別結(jié)構(gòu)域與ush2a基因pre-mrna序列反向互補(bǔ)，所述snrna通過與ush2a基因pre-mrna結(jié)合從而誘導(dǎo)第17號外顯子、第24號外顯子、第45號外顯子或第50號外顯子剪接跳躍。

3、本發(fā)明人對ush2a進(jìn)行調(diào)查研究后發(fā)現(xiàn)，因?yàn)閡sh2a編碼區(qū)長度約為15.6kb，常規(guī)的基因治療遞送方法(如重組慢病毒、重組腺相關(guān)病毒等)難以包裝如此龐大的編碼序列，所以難以通過直接遞送ush2a進(jìn)行治療。因而考慮可針對發(fā)生致病性突變的外顯子被誘導(dǎo)發(fā)生剪接跳躍實(shí)現(xiàn)治療。

4、在其中一些實(shí)施例中，所述ush2a基因pre-mrna序列選自以下區(qū)域：ush2a第17號外顯子、第24號外顯子、第45號外顯子、第50號外顯子及各外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子序列。

5、經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人ush2a外顯子17、24、45、50長度分別為495bp、102bp、210bp、219bp，移除該外顯子并沒有造成后續(xù)的移碼突變。同時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在分別敲除了ush2a的外顯子17、24、45、50后，截?cái)嗟膗sherin依然能夠正確定位并且行使部分功能。因此，對于包含致病性突變的人ush2a外顯子17、24、45、50，可以利用一系列手段使其發(fā)生跳讀進(jìn)行治療。

6、在其中一些實(shí)施例中，所述ush2a基因pre-mrna序列對應(yīng)的基因組定位區(qū)域選自：chr1：216199619-216200129、chr1：216086701-216086835、chr1：215845811-215846043、chr1：215798892-215799134。

7、在其中一些實(shí)施例中，所述ush2a基因pre-mrna序列選自：seq?id?no.1-seq?idno.4所示序列。

8、在其中一些實(shí)施例中，所述ush2a基因pre-mrna序列對應(yīng)的基因組定位選自：chr1：216200104-216200133、chr1：216199615-216199644、chr1：216086701-216086745、chr1：216086765-216086794、chr1：216086809-216086838、chr1：215845834-215845884、chr1：215846018-215846047、chr1：215845962-215845991、chr1：215798940-215798969、chr1：215798889-215798918。。

9、在其中一些實(shí)施例中，所述ush2a基因pre-mrna序列選自：seq?id?no.5-seq?idno.14所示序列。

10、在其中一些實(shí)施例中，所述snrna的識別結(jié)構(gòu)域與所述ush2a基因pre-mrna序列中至少16bp的連續(xù)序列反向互補(bǔ)。

11、在其中一些實(shí)施例中，所述snrna的識別結(jié)構(gòu)域選自：seq?id?no.15-seq?idno.26、seq?id?no.30-seq?id?no.69所示序列。

12、在其中一些實(shí)施例中，所述ush2a基因pre-mrna序列對應(yīng)的基因組定位選自：chr1：216199619-216199641、chr1：216200107-216200129、chr1：216086701-216086723、chr1：216086723-216086745、chr1：216086769-216086791、chr1：216086813-216086835、chr1：215845834-215845856、chr1：215845862-215845884、chr1：215846021-215846043、chr1：215845965-215845987、chr1：215798892-215798914、chr1：215798944-215798966。

13、在其中一些實(shí)施例中，所述snrna的識別結(jié)構(gòu)域選自：seq?id?no.15-seq?idno.26所示序列。

14、在其中一些實(shí)施例中，所述ush2a基因pre-mrna序列對應(yīng)的基因組定位選自：chr1：216199619-216199641、chr1：216086701-216086723、chr1：216086723-216086745、chr1：216086769-216086791、chr1：216086813-216086835、chr1：215845834-215845856、chr1：215845862-215845884、chr1：215798892-215798914、chr1：215798944-215798966。

15、在其中一些實(shí)施例中，所述snrna的識別結(jié)構(gòu)域選自：seq?id?no.15、seq?idno.17、seq?id?no.18、seq?id?no.19、seq?id?no.20、seq?id?no.21、seq?id?no.22、seq?idno.25、seq?id?no.26所示序列。

16、在其中一些實(shí)施例中，上述的snrna包含至少兩條snrna。

17、在其中一些實(shí)施例中，至少兩條所述snrna的識別結(jié)構(gòu)域靶向不同的ush2a基因pre-mrna序列區(qū)域。

18、在其中一些實(shí)施例中，至少兩條所述snrna的識別結(jié)構(gòu)域無重疊序列。

19、在其中一些實(shí)施例中，至少兩條所述snrna的識別結(jié)構(gòu)域靶向ush2a基因pre-mrna序列不同的外顯子及其對應(yīng)內(nèi)含子序列。

20、在其中一些實(shí)施例中，所述snrna為u1-snrna或u7-snrna。

21、考慮到細(xì)胞內(nèi)有核小rna(small?nuclearrna，snrna)，它是真核生物轉(zhuǎn)錄后加工過程中rna剪接體(spliceosome)的主要成分，通過與snrnp蛋白結(jié)合參與mrna前體的加工過程。其長度在哺乳動物中約為100-215個核苷酸，共分為7類，由于含u豐富，故編號為u1-u7。但u7-snrnp不參與剪接，而是復(fù)制依賴型組蛋白(rdh)pre-mrna獨(dú)特3'末端加工的關(guān)鍵因素。

22、因此，本發(fā)明人將u7-snrna的非規(guī)范sm結(jié)合位點(diǎn)替換為衍生自主要剪接體u-snrnps的共有序列，將u7-snrna的5'區(qū)的組蛋白結(jié)合序列改變?yōu)榇揎椈虻幕パa(bǔ)序列，可以通過靶向外顯子來誘導(dǎo)外顯子的剪接跳躍。

23、在其中一些實(shí)施例中，所述snrna包括sm序列。

24、在其中一些實(shí)施例中，所述sm序列為smopt序列，所述smopt序列如seq?id?no:27所示。

25、在其中一些實(shí)施例中，所述snrna還包括募集剪接調(diào)控蛋白的基序。

26、在其中一些實(shí)施例中，所述剪接調(diào)控蛋白包括hnrnpa1、srsf1、rbm4、dazap1或sr中的至少1種。

27、本發(fā)明還公開了一種核酸，該核酸包括編碼上述snrna的核苷酸序列。

28、本發(fā)明還公開了一種基因表達(dá)盒，該基因表達(dá)盒包括上述的核酸。

29、本發(fā)明還公開了一種載體，該載體包括上述的snrna，包括上述的核酸，和/或包括上述的基因表達(dá)盒。

30、本發(fā)明還公開了一種病毒顆粒，該病毒顆粒包括上述的snrna，包括上述的核酸，和/或包括上述的載體。

31、本發(fā)明還公開了一種細(xì)胞，該細(xì)胞包括上述的snrna，包括上述的核酸，包括上述的載體，和/或上述的病毒顆粒。

32、本發(fā)明還公開了一種藥物組合物，該藥物組合物包括上述的snrna，包括上述的核酸，包括上述的載體，和/或包括上述的病毒顆粒。

33、本發(fā)明還公開了一種獲得外顯子17、外顯子24、外顯子45、或外顯子50缺失的usherin蛋白的方法，該方法通過使ush2a基因的pre-mrna與上述的snrna，上述的核酸，上述的載體，上述的基因表達(dá)盒，上述的病毒顆粒，上述的細(xì)胞，和/或上述的組合物接觸。

34、本發(fā)明還公開了上述snrna、上述核酸、上述基因表達(dá)盒、上述載體、上述病毒顆粒、上述細(xì)胞、上述藥物組合物或上述方法，在制備預(yù)防眼病和/或耳病的藥物，或制備治療眼病和/或耳病的藥物中的應(yīng)用。

35、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

36、本發(fā)明的靶向ush2a基因pre-mrna的snrna，選擇ush2a第17、24、45、50號外顯子作為靶向區(qū)域，誘導(dǎo)外顯子17、24、45、50發(fā)生剪接跳躍，從而治療ush2a外顯子17、24、45、50的錯義、移碼、終止密碼、無義、同義突變等引起ush2a蛋白功能異常的眼部和耳部疾病。

37、并且，本發(fā)明的靶向ush2a基因pre-mrna的snrna，利用u7-snrnp不參與剪接，而是復(fù)制依賴型組蛋白(rdh)pre-mrna獨(dú)特3'末端加工關(guān)鍵因素的特性，且修飾后的u7-snrna是通過將u7-snrna的非規(guī)范sm結(jié)合位點(diǎn)替換為衍生自主要剪接體u-snrnps的共有序列，將u7-snrna的5'區(qū)的組蛋白結(jié)合序列改變?yōu)榇揎椈虻幕パa(bǔ)序列的特有工作機(jī)制，結(jié)合靶向靶向ush2a基因pre-mrna的snrna，實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)ush2a基因pre-mrna的外顯子17、24、45、50的高效剪接跳躍。

38、同時，本發(fā)明還對比了采用snrna誘導(dǎo)剪接跳躍與常規(guī)aon技術(shù)誘導(dǎo)的基因編輯，發(fā)現(xiàn)二者的靶位點(diǎn)敏感性并不相同，顯示盡管兩種技術(shù)都可能具有誘導(dǎo)外顯子剪接跳躍的功能，但作用機(jī)制不同，其靶位點(diǎn)的敏感性也不同。