本發(fā)明涉及一種微小rna分子的新用途,尤其涉及mirna-324-5p的新用途，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

炎癥性腸病(ibd)是一類病因不明的腸道慢性非特異性炎癥，包括潰瘍性結(jié)腸炎(uc)和克羅恩病(cd)。隨著研究的深入，人們逐漸意識(shí)到ibd是導(dǎo)致結(jié)直腸癌的一個(gè)危險(xiǎn)因素，并且將結(jié)直腸癌年輕化。近5年來(lái)，我國(guó)ibd患者數(shù)目是20世紀(jì)90年代同期的8倍，亟需得到廣泛關(guān)注。微小rna(microrna)是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的單鏈rna，長(zhǎng)度約為22bp。mirna通過(guò)介導(dǎo)mrna的降解和抑制mrna轉(zhuǎn)錄這兩種方式來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)，研究表明mirna參與多種類型腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，越來(lái)越多的研究證明mirna在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要的調(diào)控作用。dicer是mirna合成過(guò)程中重要的酶，目前科學(xué)家已經(jīng)利用體內(nèi)及體外dicer基因敲除的模型作為研究mirna在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的有效手段。申請(qǐng)人利用小鼠腸粘膜上皮細(xì)胞dicer基因敲除作為工具，發(fā)現(xiàn)純合子(dicer^loxp/loxp&villin^cre)小鼠和雜合子(dicer^loxp/+&villin^cre)小鼠腸道均有一定程度的自發(fā)炎癥，且純合敲除小鼠要重于雜合敲除小鼠；進(jìn)一步的利用aom合并dss誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的模型發(fā)現(xiàn)，dicer缺陷的小鼠易患更嚴(yán)重的腸癌。這一結(jié)果提示dicer及其下游mirna在炎癥性腸病及炎癥性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生中具有重要的調(diào)控作用。目前還沒(méi)有進(jìn)一步研究闡釋dicer及其下游某一特異的mirna參與這個(gè)病理過(guò)程，關(guān)于mir-324-5p激活物作為一種抑制炎癥性腸病及炎癥性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌藥物的用途和作為炎癥性腸病及炎癥性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌診斷標(biāo)志物的用途目前也尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中治療炎癥性腸病及炎癥性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌藥物的不足及臨床上炎癥性腸病診斷標(biāo)志物的局限，通過(guò)對(duì)dicer及其下游mirna的深入研究，在mirna-324-5p原有研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選，開發(fā)出mirna-324-5p新用途。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供mirna-34-5p在制備炎癥性腸病臨床檢測(cè)標(biāo)志物中的應(yīng)用。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供mirna-324-5p激活物在制備治療炎癥性腸病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供mirna-324-5p激活物在制備治療炎癥性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌中的應(yīng)用。

一種具有治療炎癥性腸病及炎癥性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌的藥物制劑，該藥物制劑為含有mirna-324-5p化合物的口服制劑或注射劑。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有治療炎癥性腸病及炎癥性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌的藥物制劑，其特征在于，所述的口服制劑為腸溶性片劑、膠囊劑、丸劑或顆粒劑。

mir-324-5p的核苷酸序列為cgcauccccuagggcauuggugu。其序列如no1。

本發(fā)明所述的mir-324-5p激活物為經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾過(guò)的mir-324-5p(cgcauccccuagggcauuggugu)序列，其序列如no2。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)腹腔注射給藥的方式將mir-324-5p激活物(agomir-324-5p)注入小鼠體內(nèi)。

本發(fā)明首先采用基因芯片的方法對(duì)3對(duì)(rko、dld1、hct116)dicer基因敲除(dicer^-/-)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系及其對(duì)照細(xì)胞系(dicer-wt)進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mir-324-5p水平在dcier敲除的細(xì)胞中下降最為明顯；對(duì)野生型小鼠和腸粘膜上皮細(xì)胞dicer基因敲除小鼠的腸粘膜組織進(jìn)行rt-pcr實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著小鼠自發(fā)ibd癥狀的加劇，mir-324-5p的水平也顯著下降。另外，用dicer基因敲除小鼠(dicer^loxp/+&villin^cre)和其同窩野生型小鼠(dicer^loxp/+)作為工具，aom合并dss誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸癌的動(dòng)物模型中，dicer^loxp/+&villin^cre小鼠更易患嚴(yán)重的結(jié)直腸癌。以上結(jié)果都表明mirna-324-5p水平下調(diào)和ibd及ibd相關(guān)結(jié)直腸癌的發(fā)生直接相關(guān)，因此通過(guò)mirna-324-5p激活物過(guò)表達(dá)可抑制ibd的發(fā)生及緩解其發(fā)展，也能夠成為治療ibd相關(guān)結(jié)直腸癌的有效藥物。

本發(fā)明應(yīng)用dss誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎動(dòng)物模型模擬人炎癥性腸病模型，用野生型小鼠(dicer^loxp/+)和dicer基因敲除小鼠(dicer^loxp/+&villin^cre)作為工具；通過(guò)腹腔注射mir-324-5p激活物的方式提高局部mir-324-5p的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mir-324-5p過(guò)表達(dá)后，dss誘導(dǎo)的dicer^loxp/+&villin^cre小鼠腸粘膜損傷顯著下降，腸粘膜屏障完整性升高，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，炎癥性腸病的癥狀得到顯著緩解，表明mir-324-5p激活物可提高腸粘膜完整性，發(fā)揮很好的抑制ibd的功效，因此對(duì)炎癥性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌的預(yù)防及治療都有一定的作用。

有益效果：本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mirna-324-5p在炎癥性腸病及炎癥性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。mir-324-5p下降伴隨著腸粘膜屏障損傷以及粘膜上皮細(xì)胞大量脫落，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加，腸道炎癥顯著加??；在持續(xù)的炎癥刺激下，患者易患結(jié)直腸腫瘤。因此，通過(guò)mirna-324-5p激活物來(lái)提高局部的mir-324-5p水平，能顯著緩解腸道炎癥，進(jìn)而預(yù)防與治療ibd及ibd相關(guān)結(jié)直腸腫瘤。因此mir-324-5p激活物可作為制備防治炎癥性腸病及炎癥腸病相關(guān)結(jié)直腸癌的藥物，同時(shí)mir-324-5p也可作為炎癥性腸病及的臨床檢測(cè)標(biāo)志物。

附圖說(shuō)明

圖1是dicer在3對(duì)結(jié)直腸癌dicer敲除細(xì)胞系中mrna水平的柱狀圖。

圖2是mirna-324-5p在3對(duì)結(jié)直腸癌dicer敲除細(xì)胞系中mrna水平的柱狀圖。

圖3是dicer基因敲除小鼠腸粘膜上皮細(xì)胞中dicer基因mrna水平的柱狀圖。

圖4是mir-324-5p在dicer基因敲除小鼠腸粘膜上皮細(xì)胞中mrna水平的柱狀圖。

圖5是野生型小鼠(dicer^loxp/+)和腸粘膜上皮細(xì)胞dicer敲除小鼠(dicer^loxp/+&villin^cre)在aom合并dss誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸癌模型的模式圖以及小鼠處死后腸腫瘤的照片。

圖6是圖5中所述動(dòng)物模型中腫瘤最大徑總和的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖(n＝8)。

圖7是圖5中所述動(dòng)物模型中結(jié)腸的重量/長(zhǎng)度的比值的統(tǒng)計(jì)圖(n＝8)。

圖8是圖5中所述動(dòng)物模型中每只小鼠結(jié)腸腫瘤數(shù)目的統(tǒng)計(jì)圖(n＝8)

圖9是dicer^loxp/+和dicer^loxp/+&villin^cre小鼠用dss誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎后腹腔注射mir-324-5p激活物的小鼠動(dòng)物模型處死后的結(jié)腸照片圖。

圖10是dicer^loxp/+和dicer^loxp/+&villin^cre小鼠用dss誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎后腹腔注射mir-324-5p激活物的小鼠動(dòng)物模型中將小鼠結(jié)腸稱重及測(cè)量長(zhǎng)度，計(jì)算結(jié)腸重量與長(zhǎng)度比值的柱狀圖。

圖11是dicer^loxp/+和dicer^loxp/+&villin^cre小鼠用dss誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎后腹腔注射mir-324-5p激活物的小鼠動(dòng)物模型，小鼠結(jié)腸組織he染色的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。

實(shí)施例1mir-324-5p作為炎癥性腸病診斷標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)

1.體外結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)：

3種野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞(rko、dld1、hct116)及其對(duì)應(yīng)的dicer基因敲除的細(xì)胞(dicer^-/-)培養(yǎng)在含10％fbs的1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于試驗(yàn)；細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度大于80％時(shí)，進(jìn)行傳代：pbs緩沖液洗2遍，胰酶體積約覆蓋細(xì)胞表面，37℃培養(yǎng)箱作用1min，顯微鏡明場(chǎng)下觀察，可見細(xì)胞收縮邊緣清晰時(shí)，棄去消化液，加入完全培養(yǎng)基終止消化，用移液器吹打瓶壁上的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種到新的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)。

2.小鼠的培育及觀察

小鼠飼養(yǎng)條件保持在溫度22-28℃，相對(duì)濕度40％-60％，噪音<60db，日夜溫差為2℃，晝夜交替各為12h。飲用水為高壓滅菌純凈水，每周換水3次，鼠籠及墊料每周更換。應(yīng)用含有l(wèi)oxp序列的dicer^loxp/loxp小鼠與含有腸粘膜上皮特定啟動(dòng)子villin驅(qū)動(dòng)的cre重組酶小鼠進(jìn)行數(shù)代的雜交。每天對(duì)比觀察野生型小鼠(dicer^loxp/+)、dicer雜合缺失型小鼠(dicer^loxp/+&villin^cre)和dicer純和缺失型小鼠(dicer^loxp/loxp&villin^cre)的進(jìn)食、飲水及活動(dòng)等日常狀態(tài)，定期記錄小鼠體重、生存時(shí)間。

3.rna提取

細(xì)胞的rna直接收取細(xì)胞后按照trizol法抽提總rna。小鼠原代腸粘膜上皮細(xì)胞的分離需要將小鼠結(jié)腸取出后置于冰pbs中清洗數(shù)次，將腸剪成長(zhǎng)度為2-3mm長(zhǎng)度的片段后放入螯合緩沖液(27mm檸檬酸鈉、5mmna2po4、96mmnacl、8mmkh2po4、1.5mmkcl、0.5mmdtt、55mm山梨醇、44mm蔗糖、6mmedta、5mmegta、ph7.3)中4℃劇烈搖晃45min；用100μm細(xì)胞過(guò)濾器去除組織碎片，細(xì)胞懸液1500rpm離心后得到腸上皮細(xì)胞；然后按照trizol法提取總rna。測(cè)定濃度后取1μg總rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cdna產(chǎn)物稀釋10倍用于rt-pcr的模板。

4.采用rt-pcr進(jìn)行mirna定量分析

mirna的定量分析采用特異性的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)行定量pcr檢測(cè)。購(gòu)買銳博生物公司(中國(guó)、廣州)的特異mir-324-5p頸環(huán)引物試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(bulge-loop^tmmirnaqrt-pcrprimersets)。

如圖1和圖2所示，采用rt-pcr的mirna定量分析結(jié)果表明，mirna-324-5p在dicer基因敲除的細(xì)胞中顯著降低；如圖3和圖4所示，取野生小鼠、dicer雜合敲除小鼠和dicer純合敲除小鼠腸粘膜細(xì)胞進(jìn)行mirna的rt-pcr實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示隨著dicer基因敲除程度的增加，mir-324-5p的水平顯著降低。以上結(jié)果表明隨著小鼠腸ibd的加劇，mir-324-5p作為dicer下游特異的mirna會(huì)顯著下降，因此mir-324-5p可作為炎癥性腸病臨床檢測(cè)標(biāo)志物。

5.aom合并dss誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癌的動(dòng)物模型

隨機(jī)選取6-8周dicer^loxp/+&villin^cre小鼠及同窩dicer^loxp/+小鼠，按注射濃度為10mg/kg氧化偶氮甲烷(aom)于第1、22、53天分三次腹腔注射于小鼠體內(nèi)，同時(shí)在第1、4、7周自由飲用含2％葡聚糖硫酸鈉(dss)的蒸餾水，第10周處死小鼠。如圖5所示，dicer^loxp/+&villin^cre小鼠結(jié)腸上肉眼所見腫瘤顯著多于dicer^loxp/+小鼠；圖6對(duì)腫瘤最大徑的總和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，表明dicer^loxp/+&villin^cre小鼠上腫瘤顯著大于dicer^loxp/+小鼠；圖7對(duì)兩組小鼠結(jié)腸重量/長(zhǎng)度的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(側(cè)面反映腫瘤重量)，結(jié)果顯示dicer^loxp/+&villin^cre小鼠顯著高于dicer^loxp/+小鼠；圖8對(duì)兩組小鼠上腫瘤的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)dicer^loxp/+&villin^cre小鼠顯著多于dicer^loxp/+小鼠。以上結(jié)果表明dicer缺失的小鼠易患更嚴(yán)重的結(jié)腸癌，而mir-324-5p作為dicer基因下游特異的mirna，其下降也會(huì)導(dǎo)致ibd相關(guān)腸癌的發(fā)生。

實(shí)施例2mirna-324-5p激活物治療炎癥性腸病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)分組：

選用6-8周、雄性野生型小鼠(dicer^loxp/+)和dicer雜合敲除小鼠(dicer^loxp/+&villin^cre)各自隨機(jī)分為三組：對(duì)照飲水組(水)，dss誘導(dǎo)組(dss)，dss誘導(dǎo)同時(shí)mir-324-5p激活物腹腔注射組(dss+agomir-324-5p)。

2.實(shí)驗(yàn)方法：

將分子量為dss(mw：36000-50000)溶于飲用水，配成3％dss溶液。同窩野生型小鼠(dicer^loxp/+)和dicer雜合敲除小鼠(dicer^loxp/+&villin^cre)小鼠分別自由飲用蒸餾水和含3％dss的蒸餾水。在第2天時(shí)進(jìn)行腹腔注射濃度為10nm的agomir-324-5p或其對(duì)照200μl/只，每天觀察小鼠進(jìn)食、飲水及活動(dòng)等日常狀態(tài)，并記錄小鼠體重。第7天處死小鼠觀察。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

dss誘導(dǎo)結(jié)腸炎后，mirna-324-5p激活物干預(yù)治療組小鼠體重比未干預(yù)的dicer^loxp/+&villin-cre小鼠體重顯著回升，具有明顯差異(p＜0.05)。

如圖9為小鼠處死后結(jié)腸的拍照?qǐng)D，結(jié)果顯示dss誘導(dǎo)下dicer^loxp/+小鼠和dicer^loxp/+&villin^cre小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度都顯著減少；當(dāng)腹腔注射agomir-324-5p后，dicer^loxp/+&villin^cre小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度出現(xiàn)回升。

如圖10為小鼠結(jié)腸重量與長(zhǎng)度(g/cm)比值的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果顯示agomir-324-5p干預(yù)后能夠顯著降低這個(gè)比值，表明干預(yù)后的炎癥性腸病癥狀得到明顯減輕，具有明顯差異(p＜0.05)。

如圖11為小鼠結(jié)腸組織石蠟切片的he染色結(jié)果，結(jié)果顯示dss誘導(dǎo)下dicer^loxp/+&villin^cre小鼠腸粘膜上皮細(xì)胞大量脫落，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)加劇，粘膜上皮失去原有組織形態(tài)，粘膜屏障消失；當(dāng)用mirna-324-5p激活物agomir-324-5p干預(yù)后，粘膜上皮細(xì)胞形態(tài)得到很好的恢復(fù)，炎癥程度減輕。

并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，未見有明顯不良反應(yīng)，有望開發(fā)成新一代安全有效，防治炎癥性腸病及炎癥性腸病相關(guān)結(jié)腸癌的新藥。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理和構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。