本發(fā)明涉及一種降解蝦塘中亞硝酸鹽及抑制病原菌的微生物制劑，尤其是一種降解亞硝酸鹽的微生態(tài)制劑，屬于養(yǎng)殖
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：目前隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，高密度養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，水體污染日益嚴(yán)重，其中氨氮和亞硝酸鹽過高，不僅對養(yǎng)殖動物有直接的危害作用，同時惡化的水環(huán)境使致病菌大量繁殖，導(dǎo)致疾病暴發(fā)。微生物制劑用于降低水體的氨氮和亞硝酸鹽得到了廣泛的認(rèn)可。目前已經(jīng)出現(xiàn)很多復(fù)配的微生物制劑，然而使用效果卻不穩(wěn)定。自養(yǎng)型的硝化細(xì)菌相對于亞硝化細(xì)菌，繁殖速度緩慢，且不適用于水體嚴(yán)重富營養(yǎng)化的養(yǎng)殖水體。尤其當(dāng)水質(zhì)惡化后，池塘溶氧長時間處于較低水平，投入的硝化細(xì)菌對氨氮和亞硝酸鹽的降解作用有限，因此常常出現(xiàn)使用效果不穩(wěn)定的問題。光合細(xì)菌可以降低水體中的氨氮水平，但對降低水體亞硝酸鹽效果差；枯草芽孢桿菌可以降低水體氨氮和亞硝酸鹽水平，但效果有限；自養(yǎng)型的硝化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌，不適用于高度富營養(yǎng)化的養(yǎng)殖水體。反硝化細(xì)菌已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于污水處理中的脫氮反應(yīng)，在生物反硝化系統(tǒng)中，反硝化菌可能利用碳源作為電子供體，硝酸根和亞硝酸根作為電子受體，將硝酸鹽和亞硝酸鹽還原成氮氣，同時達(dá)到去除有機(jī)物和氮污染物的效果。目前已經(jīng)分離出較多的菌株(如cgmccno.7330，cgmccno.7650，gcmccno.8539)，甚至包括異養(yǎng)硝化——厭氧反硝化的菌株(cctcc02m207075)。據(jù)我們對養(yǎng)殖水質(zhì)跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在青魚塘和蟹塘水體和底泥中存在相當(dāng)數(shù)量的反硝化細(xì)菌，這些菌株在培養(yǎng)基中對亞硝酸鹽具有良好的降解作用，但是在養(yǎng)殖水體仍然出現(xiàn)高氨氮和亞硝酸鹽的積累，表明其作用過程受阻。在高密度養(yǎng)殖水體，氨氮和亞硝酸鹽最主要的來源即為飼料中的蛋白質(zhì)分解。相對于禽畜養(yǎng)殖，水產(chǎn)動物相對較高的蛋白質(zhì)含量決定了其飼料較高的蛋白質(zhì)水平，而不同的養(yǎng)殖對象其飼料的蛋白質(zhì)含量差異很大。蝦蟹料和一些肉食性魚類的飼料具有較高的蛋白質(zhì)含量，從調(diào)查中可以發(fā)現(xiàn)，在蝦蟹塘更容易出現(xiàn)氨氮和亞硝酸的積累，水體中的cod/tn約為6：1，c/n值顯然更低。在污水處理中c/n值至少達(dá)到20才具有良好的氮去除率，而養(yǎng)殖水體較低的c/n值不利于反硝化作用的進(jìn)行。因此，我們推測水體發(fā)生氨氮和亞硝酸鹽積累的關(guān)鍵因素在于底泥和水體中碳源不足，導(dǎo)致反硝化細(xì)菌和異養(yǎng)硝化細(xì)菌對氮的代謝受阻，造成氨氮和亞硝酸鹽積累。碳源是反硝化過程所不可缺少的一種物質(zhì)。在污水處理中常用加外碳源主要包括：甲醇、乙醇、乙酸鈉等。乙酸鈉屬于低分子簡單化合物，易被微生物利用，且降解過程相對簡單。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在以乙酸鈉為外加碳源進(jìn)行反硝化時，即使投加過量，出水cod值也能維持在較低水平。在反硝化系統(tǒng)中，用乙酸鈉作為碳源具有效應(yīng)速度快，優(yōu)先進(jìn)行反硝化，而不是菌體繁殖的特點，因此更能促進(jìn)菌劑的使用效果。國內(nèi)目前有益微生物在水質(zhì)凈化方面的應(yīng)用日益被接受和重視，但研究僅處于起步階段，微生態(tài)制劑主要關(guān)注在功能性微生物的簡單混合，而忽略了水質(zhì)環(huán)境對其功能發(fā)揮的影響。特別是在降解水體中的氨氮與亞硝酸鹽方面，目前已經(jīng)分離出許多具有降解氨氮亞硝酸鹽的菌株，但是其使用效果不穩(wěn)定，主要原因是忽略了使用環(huán)境對微生物代謝的影響。另外，微生物可減少水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的發(fā)生，但僅限于作用效果的簡單描述，對其作用機(jī)理知之甚少，本發(fā)明通過對養(yǎng)殖水體弧菌數(shù)量及病害發(fā)性情況進(jìn)行監(jiān)測，明確了其在實際生產(chǎn)中對水產(chǎn)動物疾病的控制作用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種降解養(yǎng)殖池塘中亞硝酸鹽的復(fù)合微生態(tài)制劑，具有抑制弧菌的作用，以解決亞硝酸鹽積累與細(xì)菌性病害相繼發(fā)生的問題。針對這一問題，本發(fā)明明確了本微生物制劑的使用對象為青魚、蝦類等高蛋白飼料投入的養(yǎng)殖池塘。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明選用小分子碳源乙酸鈉或丙酸鈉或檸檬酸鈉等作為碳源，促進(jìn)水體的反硝化作用，以降低水體亞硝酸鹽水平；選用具有反硝化作用的假單胞菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，以麩皮、沸石粉、玉米淀維粉為輔料，制成粉劑小顆?；旌系奈⑸鷳B(tài)制劑。其中，假單胞菌為弗雷德里克斯堡假單胞菌(pseudomonasfrederiksbergensis)。其中，輔料沸石粉，用于吸附微生物，并使之沉入水底。其中，輔料麩皮，用于吸附微生物使之較長時間懸浮在水體中。其中，輔料乙酸鈉或雙乙酸鈉或丙酸鈉或檸檬酸鈉，作為小分子碳源，促進(jìn)反硝化細(xì)菌對氨氮、亞硝酸鹽的降解速率。其中，輔料淀維粉，一方面，作為分散劑，保持菌劑干燥；另一方面，淀維粉極易溶于水，可作為碳源，或小分子碳源的補(bǔ)充劑。所述微生態(tài)制劑，顆粒型，以弗雷德里克斯堡假單胞菌粉與枯草芽孢桿菌粉，與輔料乙酸鈉或丙酸鈉或檸檬酸鈉以質(zhì)量比2：1：2制粒。所述微生態(tài)制劑，粉劑型，以弗雷德里克斯堡假單胞菌粉、枯草芽孢桿菌粉、解淀粉芽孢桿菌粉，與輔料乙酸鈉或丙酸鈉或檸檬酸鈉、玉米淀維粉均勻混合，質(zhì)量比為2：1：1：6：2。所述微生態(tài)制劑，顆粒型與粉劑型以質(zhì)量比1：3混合。本發(fā)明一方面，將小分子碳源引入水體，增強(qiáng)池塘原有反硝化細(xì)菌、異氧硝化細(xì)菌的代謝活動；另一方面，通過不同比重的吸附劑，使微生物菌在池底和水體同時發(fā)揮作用，減少池底氨氮和亞硝酸鹽的釋放；第三，通過解淀粉芽孢桿菌的使用，在改良水質(zhì)的同時可抑制弧菌等病原菌的數(shù)量，以減少魚病的發(fā)生。河蟹塘在使用本微生物菌劑后，降解氨氮和亞硝酸鹽效果顯著。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。一種微生態(tài)制劑，該微生態(tài)制劑配方為弗雷德里克斯堡假單胞菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌及輔料。所述微生態(tài)制劑，顆粒型，以弗雷德里克斯堡假單胞菌粉、枯草芽孢桿菌粉、輔料乙酸鈉或丙酸鈉或檸檬酸鈉以質(zhì)量比2：1：2制粒。所述微生態(tài)制劑，粉劑型，以弗雷德里克斯堡假單胞菌粉、枯草芽孢桿菌粉、解淀粉芽孢桿菌粉，與輔料乙酸鈉或丙酸鈉或檸檬酸鈉、玉米淀維粉均勻混合，質(zhì)量比為2：1：1：6：2。所述微生態(tài)制劑，顆粒型與粉劑型以質(zhì)量比1：3混合。所述的微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用。所述的微生態(tài)制劑用于降低水體中的亞硝酸鹽、氨氮的含量。所述的微生態(tài)制劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病的防治?？莶菅挎邨U菌(bacillussubtilis)保藏于中國典型培養(yǎng)物菌種保藏中心，保藏號為cctccab90008。弗雷德里克斯堡假單胞菌(pseudomonasfrederiksbergensis)，保藏于中國典型培養(yǎng)物菌種保藏中心，保藏號為cctccab212328。解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)jssw-la，保藏于中國典型培養(yǎng)物菌種保藏中心，保藏號為cctccm2015602。具體實施方式實施例1：弗雷德里克斯堡假單胞菌粉劑的制備(1)種子罐培養(yǎng)：準(zhǔn)備一個內(nèi)裝玻璃珠的無菌三角瓶,用無菌水將茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下來,裝入三角瓶,振蕩分散菌泥,獲得均勻的菌懸液，以體積比2％-10％的接種量接入100l種子罐,種子罐的裝量系數(shù)為60％-70％(v/v),即100l種子罐裝培養(yǎng)基60-70l。種子罐培養(yǎng)條件為:攪拌轉(zhuǎn)速200r/min,通氣量1-3m3/h,培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)時間為20-48h。種子罐培養(yǎng)基：葡萄糖6g/l、酵母粉12g/l、mgso4.7h2o3.5g/l、kh2po42.5g/l、cacl21.5g/l，ph7.0-7.2。(2)發(fā)酵培養(yǎng)：種子培養(yǎng)液以體積比5.0％-10.0％的接種量接入1t發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝量系數(shù)為60％-70％(v/v)，溫度25℃，攪拌速度為200r/min，通氣量1-3m3/h，培養(yǎng)48h-72h。發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液菌體數(shù)量≥8×108cfu/ml。發(fā)酵罐培養(yǎng)基：葡萄糖10g/l、酵母粉10g/l、mgso4.7h2o3.5g/l、kh2po42.5g/l、cacl21.5g/l，ph7.0-7.2。(3)微膠囊制備：a.包埋劑的制備將步驟(2)所得發(fā)酵液通過離心收集濕菌體，加入無菌水制成菌懸液，菌體濃度≥1.0×1010cfu/ml。制備含有重量百分比濃度為0％～2.0％的海藻酸鈉，0.2％～0.5％的乙酸鈉或丙酸鈉或檸檬酸鈉三者之一，0.5％～3.0％的明膠，再含有0.1％～1.0％的淀維粉，所使用的溶劑為去離子水，充分混合制得包埋劑。b.交聯(lián)劑的制備配制重量百分比濃度為2.0％～3.0％的氯化鈣去離子水溶液，滅菌待用；c.微膠囊顆粒的制備按體積比為菌液:包埋劑＝1:3～5配制成壁材與菌液的混合膠液，充分?jǐn)噭蚝?，將混合膠液噴霧至磁力攪拌的已滅菌的濃度為2.0％～3.0％的氯化鈣去離子水溶液中，形成2～3mm的微膠囊，靜置固化12～24h，即得弗雷德里克斯堡假單胞菌微膠囊顆粒，每ml菌液可制得200-300粒2～3mm的微膠囊；(4)微膠囊顆粒內(nèi)活菌數(shù)測定：將上述1ml菌液制得的微膠囊顆粒加入到9ml0.2mol/l檸檬酸鈉溶液振蕩溶解微膠囊顆粒，采用平板計數(shù)法進(jìn)行活菌計數(shù)。(5)粉劑的制備：將步驟(3)獲得的微膠囊顆粒進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥后的微膠囊顆粒用粉碎機(jī)粉碎，過篩，按上述方法制得的弗雷德里克斯堡假單胞菌活菌數(shù)≥5.0×108cfu/ml。實施例2：枯草芽孢桿菌粉劑的制備(1)菌種活化：無菌開啟枯草芽孢桿菌的凍干保藏菌種，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂試管斜面，于30-37℃培養(yǎng)24-48h，然后劃線轉(zhuǎn)接于營養(yǎng)瓊脂茄子瓶斜面，30-37℃培養(yǎng)24-48h；鏡檢，當(dāng)90％以上菌體形成芽孢時，即為成熟。斜面培養(yǎng)基組成以g/l計：蛋白胨10，牛肉膏3，nacl5，瓊脂15-20，以蒸餾水定容配制，ph7.0-7.2；種子罐培養(yǎng)：準(zhǔn)備一個內(nèi)裝玻璃珠的無菌三角瓶，用無菌水將茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下來，裝入三角瓶，振蕩分散菌泥，獲得均勻的菌懸液。將菌懸液在80℃水浴中加熱10分鐘,以體積比2％-10％的接種量接入100l種子罐，種子罐的裝量系數(shù)為60％-70％(v/v)，即100l種子罐裝培養(yǎng)基60-70l。發(fā)酵培養(yǎng)：種子培養(yǎng)液以體積比5.0％-10.0％的接種量接入1t發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝量系數(shù)為60％-70％(v/v)，溫度37℃，攪拌速度為200r/min，通氣量1-3m3/h，培養(yǎng)15h-30h。培養(yǎng)基組成以g/l計：淀粉1.0-5.0，麩皮1.0-5.0，nacl1.0-2.0，酵母膏2.0-10.0，kh2po40.1-0.5，ph7.0-7.2。菌粉制劑制備：將步驟(3)所得發(fā)酵液通過連續(xù)離心收集濕菌體，根據(jù)離心菌體質(zhì)量制備含有重量百分比濃度為1.0-3.0％淀維粉和1.0-3.0％明膠，充分混合，進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為160℃-180℃，出風(fēng)溫度為60℃-80℃，獲得的枯草芽孢桿菌粉劑，其菌濃度≥5.0×109cfu/g。實施例3：解淀粉芽孢桿菌粉劑的制備(1)菌種活化：無菌開啟解淀粉芽孢桿菌jssw-la的凍干保藏菌種，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂試管斜面，于30-37℃培養(yǎng)24-48h，然后劃線轉(zhuǎn)接于營養(yǎng)瓊脂茄子瓶斜面，30-37℃培養(yǎng)24-48h；鏡檢，當(dāng)90％以上菌體形成芽孢時，即為成熟。斜面培養(yǎng)基組成以g/l計：蛋白胨10，牛肉膏3，nacl5，瓊脂15-20，以蒸餾水定容配制，ph7.0-7.2；(2)種子罐培養(yǎng)：準(zhǔn)備一個內(nèi)裝玻璃珠的無菌三角瓶，用無菌水將茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下來，裝入三角瓶，振蕩分散菌泥，獲得均勻的菌懸液。將菌懸液在80℃水浴中加熱10分鐘,以體積比2％-10％的接種量接入100l種子罐，種子罐的裝量系數(shù)為60％-70％(v/v)，即100l種子罐裝培養(yǎng)基60-70l。(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)：種子培養(yǎng)液以體積比5.0％-10.0％的接種量接入2t發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝量系數(shù)為60％-70％(v/v)，溫度37℃，攪拌速度為200r/min，通氣量1-3m3/h，培養(yǎng)15h-30h。培養(yǎng)基組成以g/l計：麩皮5-30，酵母膏1.0-3.0，nacl2.0-5.0，以蒸餾水定容配制，ph7.0；(4)菌粉制劑制備：方法與實施例2相同，獲得的解淀粉芽孢桿菌粉劑，其菌濃度≥5.0×109cfu/g。實施例4：復(fù)合微生態(tài)制劑的制備顆粒型：將弗雷德里克斯堡假單胞粉劑與枯草芽孢桿粉劑，與輔料乙酸鈉或丙酸鈉或檸檬酸鈉以重量比2:1:2混合均勻，造粒。其中，造粒工藝：利用圓盤造粒機(jī)造粒：造粒過程中間歇性用噴水壺噴水，顆粒不超過50℃的條件下風(fēng)干至含水量至20％以下分篩，成品粒徑在1-4mm，即為顆粒型制劑。粉劑型：以弗雷德里克斯堡假單胞粉劑、枯草芽孢桿粉劑、解淀粉芽孢桿菌粉劑，與輔料乙酸鈉或丙酸鈉或檸檬酸鈉、玉米淀維粉均勻混合，重量比為2:1:1:6:2。所述微生態(tài)制劑，顆粒型與粉劑型以質(zhì)量比1:3混合均勻。實施例5：室內(nèi)實驗實驗池3個，體積一方，取池塘中氨氮和亞硝酸鹽高的水，于三個池子中，為模仿養(yǎng)殖池塘動態(tài)，每個池子分別放養(yǎng)10尾小鯉魚，三天后測水體氨氮、亞硝酸鹽為初始值，使用微生物菌劑2ppm，使用一次后，每天測定水體的氨氮、亞硝酸鹽。水質(zhì)氨氮數(shù)據(jù)表氨氮(mg/l)初始值第二天第三天第四天第七天17.196.075.044.211.7124.384.063.652.381.1335.284.673.522.181.25水質(zhì)亞硝酸鹽數(shù)據(jù)表實施例6：蟹塘實驗相鄰河蟹塘3個，每個50畝，4月底開始出現(xiàn)亞硝酸鹽積累，至5月份情況不見好轉(zhuǎn)，5月21號開始使用微生態(tài)制劑，第一次500克/畝，以后每周使用200克/畝。使用前測定水體氨氮、亞硝酸鹽水平。使用后跟蹤測定水體氨氮、亞硝酸鹽，取其平均值(6月5日第1次檢測，6月25日第2次檢測，7月5日第3次檢測，7月25日第3次檢測。)。水質(zhì)氨氮數(shù)據(jù)表氨氮(mg/l)初始值1234何0.730.270.540.440.23dc50.520.440.340.240.13邱0.370.540.20.10.4水質(zhì)亞硝酸鹽數(shù)據(jù)表微生物制劑使用后，發(fā)病情況：河蟹塘在使用微生物菌劑后，降解氨氮和亞硝酸鹽效果顯著。三個蟹塘開始定期使用本微生態(tài)制劑，每周使用一次按200克/畝，使用后，蟹塘未發(fā)生大面積死亡。尤其在6、7月份經(jīng)常陰天降雨的情況下，此三個蟹塘水質(zhì)相對穩(wěn)定，未出現(xiàn)大面積死亡，而在鄰近的蟹塘死亡量相對較大。6-7月，每月兩次采樣監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，使用微生物菌劑的蟹塘，水體中弧菌數(shù)量平均為23cfu/ml，而未使用微生物菌劑的發(fā)病蟹塘，弧菌數(shù)量平均為130cfu/ml。最后所應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁12