一種用于防控雛禽腸道病原的復(fù)合微生態(tài)制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于防控雛禽腸道病原的復(fù)合微 生態(tài)制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在當(dāng)前禽類養(yǎng)殖規(guī)?；⒓s化發(fā)展的過程中，雛禽的健康養(yǎng)殖對(duì)養(yǎng)殖的成敗有 著關(guān)鍵作用。而雛禽在從種雞場(chǎng)孵出到進(jìn)入養(yǎng)殖場(chǎng)這一階段，體質(zhì)弱，腸道菌群發(fā)育不完 善，抵抗力差，極易感染沙門氏菌、致病性大腸桿菌等病原引起的下痢、臍炎等疾病，導(dǎo)致較 高的死亡率，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖效益。當(dāng)前在養(yǎng)殖實(shí)踐中，多采用抗生素來防治或治療雛禽易于 產(chǎn)生的疾病，從雛雞開口進(jìn)食即開始給藥。然而，雛禽抗生素的濫用，抑制腸道正常菌群的 建立，影響內(nèi)臟器官和免疫系統(tǒng)的發(fā)育，且在隨后的養(yǎng)殖中，抗生素藥物使用成為常態(tài)，最 終禽類產(chǎn)品的藥物殘留嚴(yán)重。隨著禽類綠色、健康養(yǎng)殖成為發(fā)展的趨勢(shì)，養(yǎng)殖中抗生素的使 用受到越來越多的限制，微生態(tài)制劑替代抗生素的使用成為國內(nèi)外研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。
[0003]飼用微生態(tài)制劑具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群、抑菌抗病、調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫、提升動(dòng)物生長 和生產(chǎn)性能的作用，且無藥殘、無污染，可作為實(shí)現(xiàn)禽類綠色、健康養(yǎng)殖的有效理想途徑。針 對(duì)雛禽養(yǎng)殖面臨的腸道菌群不完善，易感染病原等實(shí)際問題，已有一些相關(guān)研究利用微生 態(tài)制劑進(jìn)行防控。如中國發(fā)明專利ZL201010175469. 0公開了 "復(fù)合菌劑及其在幼禽增重 及防治下痢中的應(yīng)用"，該發(fā)明復(fù)合了芽孢桿菌屬和腸球菌屬的多株細(xì)菌，用以防治幼畜禽 下痢，促進(jìn)幼畜禽增重。申請(qǐng)公開的中國發(fā)明專利"調(diào)整禽畜腸道菌群益生菌微生物菌劑 及其制備方法"，申請(qǐng)公布號(hào)：CN103060247A，公開了由產(chǎn)朊假絲酵母、糞鏈球菌、枯草芽孢 桿菌、納豆芽孢桿菌、植物乳桿菌和沼澤紅假單胞菌構(gòu)成的菌群，用以調(diào)整禽畜腸道菌群結(jié) 構(gòu)，促進(jìn)有益菌生長并抑制有害菌生長。因此，調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道環(huán)境，進(jìn)而產(chǎn)生包括 抑制病原在內(nèi)的一系列有益功能，將是現(xiàn)有微生態(tài)制劑的主要作用模式。然而，其作用需要 一個(gè)過程，尤其是在抑制腸道病原方面沒有針對(duì)性，無法真正滿足替代抗生素的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)雛禽腸道菌群不完善，易感染沙門氏菌、大腸桿菌引起下 痢等疾病的實(shí)際情況，提供一種能有效防控雛禽腸道病原，促進(jìn)腸道菌群發(fā)育的復(fù)合微生 態(tài)制劑。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述適用于防控雛禽腸道病原，促進(jìn)腸道菌群發(fā)育的 復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法。
[0006]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 一種用于防控雛禽腸道病原，促進(jìn)腸道菌群發(fā)育的復(fù)合微生態(tài)制劑，所述的制 劑包括保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（ChinaGeneral MicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，保藏號(hào)為 11255 的多粘類芽抱桿 菌BPZ-1和保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，保藏號(hào) 為11256的干酪乳桿菌（ZacioAaciUiA?caseiOLCZ-l菌株。兩種菌在復(fù)合微生態(tài)制劑總 質(zhì)量中的質(zhì)量百分比分別為：多粘類芽孢桿菌55%~70%，干酪乳桿菌30%~45%。
[0007] 在一個(gè)優(yōu)選的方式中，該菌株通過以下方式獲得：于2013年從湖北襄陽、江蘇宿 州、浙江嘉興等地養(yǎng)雞場(chǎng)獲取約15日齡健康雛雞，宰殺后分離腸道內(nèi)容物，冷藏后帶回實(shí) 驗(yàn)室處理。獲得的樣本分別分為2份，分別用于芽孢類細(xì)菌和乳酸類細(xì)菌的分離。用于芽 孢類細(xì)菌分離的樣本，于空平板中，在20 °C-25 °C的室溫下放置約1周，隨后在60 °C的 烘箱中處理24h。處理后的樣本取1g加入裝有100ml無菌水的三角瓶中，在30°C的搖 床中培養(yǎng)過夜，靜止2h后取上清液lml做梯度稀釋，并在肉膏蛋白胨平板中涂布，培養(yǎng)，分 離菌株，最終獲得7株芽孢類菌。用于乳酸菌分離的樣本，取濕樣1g，接入200mLMRS肉 湯培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，一周后取100μL富集液接入新鮮的200mLMRS肉湯培養(yǎng)基中繼續(xù) 培養(yǎng)，再過一周后采用稀釋涂布平板法用加有1 %碳酸鈣的MRS瓊脂平板分離乳酸菌，共分 離獲得可產(chǎn)生透明圈的菌株11株。隨后以易引起雛雞下痢、臍炎的常見病原菌一沙門氏 桿菌、大腸桿菌為指示菌，通過體外抑菌法一牛津杯法，對(duì)篩選獲得到18株細(xì)菌進(jìn)行體外 拮抗試驗(yàn)，對(duì)沙門氏菌有較好抑菌效果的芽孢類菌株共3株，其中1株抑菌圈直徑大于6. 8 cm，乳酸菌4株，抑菌圈直徑均大于5. 5cm;對(duì)大腸桿菌有較好抑菌效果的芽孢類菌株共有 4株，抑菌圈直徑均大于6. 0cm，乳酸菌3株，抑菌圈直徑均大于5.1cm。隨后對(duì)獲得的菌 株進(jìn)行進(jìn)一步篩選，最終獲得對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌均有較好抑制效果的芽孢類菌和乳酸 菌各1株。這兩株菌經(jīng)16SrRNA基因序列分析和生理生化鑒定，確定為多粘類芽孢桿菌 和干酪乳桿菌（ZacioAaciUiA?casei)，分別命名為BPZ-1 和 LCZ-l〇
[0008] 兩株菌已于2015年8月20日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，保藏 號(hào)：11255和11256,地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中國科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101。 已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)菌株BPZ-1和LCZ-1在生長過程中具有較強(qiáng)的抑制沙門氏菌和大腸桿菌 生長效果，經(jīng)液體發(fā)酵后發(fā)酵液亦具有較強(qiáng)的抑菌活性。
[0009]
[0010] 本發(fā)明還提供了該用于防控雛禽腸道病原的復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，所述多 粘芽孢桿菌和干酪乳桿菌菌劑的制備方法，分別按以下步驟進(jìn)行： A.多粘芽孢桿菌菌劑的制備步驟： (1) 各級(jí)培養(yǎng)基的配置，其中： 斜面培養(yǎng)基：為牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，備用； 搖瓶菌種培養(yǎng)基和種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基：為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，備用； 批量生產(chǎn)培養(yǎng)基：玉米芯粉45~60%，麩皮30~40%，礱糠：5~10%，葡萄糖3%，酵 母膏2%，按料水比1 :0. 8加入水分； (2) 搖瓶菌種擴(kuò)增：將用斜面培養(yǎng)基活化的多粘芽孢桿菌BPZ-1，在無菌操作下，接入 100mL的搖瓶培養(yǎng)基中，在30°C，160rpm/min的搖床中，培養(yǎng)24h后備用； (3) 種子罐發(fā)酵：將步驟（1)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基放入種子罐中，在種子罐內(nèi)進(jìn)行蒸汽高 溫滅菌并冷卻后，按接種量5~8%接入步驟（2)的搖瓶菌種；開動(dòng)攪拌機(jī)在轉(zhuǎn)速160rpm/ min，溫度30°C，通氣量4m3/h，罐壓0. 1MPa，自然pH的條件下培養(yǎng)24h后備用； (4) 批量產(chǎn)品的制備：將步驟（1)固體培養(yǎng)基滅菌并冷卻，按制備菌劑重量的3~5 %的 比例稱取步驟（3)種子罐液體菌種，按菌種與水1 :5的比例放入無菌水中，再接入固體培養(yǎng) 基中并混勻；移入培養(yǎng)室，料厚3. 5~5cm，室溫控制在30~35 °C，培養(yǎng)72h后在低于60 °C的條件下烘干、粉碎、裝袋，備用，所獲多粘芽孢桿菌BPZ-1制劑活菌數(shù)量不低于40X10s CFU/g; B.干酪乳桿菌菌劑的制備步驟： (1) 各級(jí)培養(yǎng)基的配置，其中： 斜面培養(yǎng)基：為MRS瓊脂培養(yǎng)基，備用； 搖瓶菌種培養(yǎng)基和種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基，備用； 批量生產(chǎn)培養(yǎng)基：玉米粉50~60%，豆柏25~35%，麩皮10~15%，CaC03 1~1. 5 %， 物料高溫滅菌處理，按料水比1 7加入水分； (2) 搖瓶菌種擴(kuò)增：分別將用斜面培養(yǎng)基活化的干酪乳桿菌LCZ-1接入100mL的搖瓶 培養(yǎng)基中，在30°C，培養(yǎng)24h后備用； (