本發(fā)明涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，進(jìn)一步涉及陰道微生態(tài)環(huán)境的調(diào)節(jié)及細(xì)菌性陰道疾病的治療，具體涉及一種植物乳桿菌及其用于制備陰道抑菌藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：健康婦女陰道內(nèi)存在多種微生物，它們與宿主、環(huán)境之間構(gòu)成了相互制約、相互協(xié)調(diào)、動(dòng)態(tài)平衡的陰道微生態(tài)系統(tǒng)。健康婦女的陰道菌群主要由乳桿菌構(gòu)成，包括植物乳桿菌、詹氏乳桿菌、格氏乳桿菌、卷曲乳桿菌、陰道乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等。正常情況下乳桿菌對(duì)陰道可以起到保護(hù)作用，當(dāng)陰道微生態(tài)的乳桿菌紊亂可以導(dǎo)致致病菌入侵而產(chǎn)生陰道炎。細(xì)菌性陰道病(bv)的發(fā)生是由于陰道菌群失調(diào)，寄主自身的乳桿菌減少而導(dǎo)致其他條件性病原微生物如加德納菌、各種厭氧菌、彎曲弧菌等的大量繁植，通常bv實(shí)際上是以加德納氏菌為主的一種混合感染。應(yīng)用抗生素治療，可暫時(shí)緩解bv的癥狀，但也使本已減少的乳桿菌進(jìn)一步減少，加重陰道微生態(tài)失調(diào)，從而使bv反復(fù)復(fù)發(fā)。如何控制復(fù)發(fā)、徹底根治細(xì)菌性陰道病是婦產(chǎn)科醫(yī)生亟需解決的棘手問題。研究表明：產(chǎn)h2o2和乳酸的乳桿菌是健康婦女陰道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌，是保護(hù)女性陰道免受病原體感染的重要因素，另外乳桿菌代謝產(chǎn)生的酸和一些抗微生物因子也可有效地抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)繁植。健康婦女陰道內(nèi)存在多種乳桿菌，具有個(gè)體差異性，且乳桿菌各株間抗致病菌能力差異明顯。選擇乳桿菌益生菌時(shí)，需要綜合考慮乳桿菌的種類，其產(chǎn)酸、產(chǎn)h2o2能力，及與陰道上皮細(xì)胞粘附的能力，其中乳桿菌能否在陰道成功定植，是乳桿菌持續(xù)作用的基礎(chǔ)，也是乳桿菌發(fā)揮療效的關(guān)鍵因素。植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，為乳桿菌屬，是人體正常菌群之一，廣泛分布于人體腸道中，在女性陰道中也有分布。對(duì)于常規(guī)菌株而言，在現(xiàn)有技術(shù)的認(rèn)知范疇中其并不具有特異性的抑菌作用。目前市面已有制品“德氏乳桿菌”實(shí)際并非我國(guó)婦女陰道優(yōu)勢(shì)菌群，定植能力較差，也不能維持穩(wěn)定的活菌含量，不能滿足婦科臨床的需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在提供一種特定的植物乳桿菌，以解決現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)植物乳桿菌不具有陰道致病菌抑制能力的技術(shù)問題。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是常規(guī)植物乳桿菌產(chǎn)過氧化氫生產(chǎn)能力較低。本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是常規(guī)植物乳桿菌的乳酸產(chǎn)量較低。本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)植物乳桿菌在陰道中的定殖、存活效果不佳。本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)陰道致病菌的菌劑類抑菌藥物治療效果不佳。為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種分離的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，本發(fā)明中將其編號(hào)為rd-0025(植物乳桿菌)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為cgmccno.14111。上述植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)rd-0025為中國(guó)健康育齡婦女陰道分泌物中篩選得來，已于2017年5月10日保藏于在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc)，保藏單位地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏登記號(hào)為cgmccno.14111，該菌株的分類命名為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)。上述分離的植物乳桿菌rd-0025，采用16srdna進(jìn)行測(cè)序，與genbank數(shù)據(jù)庫中植物乳桿菌堿基序列最高同源性分值大于98％。在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述植物乳桿菌用于制備陰道致病菌抑菌藥物的應(yīng)用。作為優(yōu)選，所述藥物是菌劑，該菌劑在陰道環(huán)境中定殖并存活于陰道上皮細(xì)胞上。作為優(yōu)選，所述藥物是菌劑，該菌劑在陰道環(huán)境中代謝產(chǎn)h2o2。作為優(yōu)選，所述致病菌是陰道加德納氏菌。作為優(yōu)選，所述致病菌是阿托波菌。作為優(yōu)選，所述致病菌是白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌或沙門氏菌。同時(shí)，本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述植物乳桿菌用于制備陰道疾病預(yù)防或治療藥物的應(yīng)用。作為優(yōu)選，所述陰道疾病是外陰陰道假絲酵母菌病、滴蟲性陰道炎、老年性陰道炎、非特異性陰道感染或混合性陰道感染。本發(fā)明首先分離得到了一株植物乳桿菌，研究其代謝性能發(fā)現(xiàn)，該菌株具備優(yōu)良的乳酸生產(chǎn)能力和產(chǎn)過氧化氫能，對(duì)致病菌的抑菌能力很強(qiáng)，同時(shí)具有突出的陰道上皮細(xì)胞粘附能力?；谝陨习l(fā)現(xiàn)的新性質(zhì)，本發(fā)明確定了利用其制備陰道抑菌藥物的新用途，實(shí)現(xiàn)了多種細(xì)菌性陰道疾病的治療。采用上述技術(shù)方案產(chǎn)生的有益效果在于：(1)本發(fā)明的植物乳桿菌rd-0025菌株可以長(zhǎng)期保存，并抵抗細(xì)菌性陰道病和各種陰道感染，包括白色念珠菌性陰道炎，淋病，病毒性陰道炎，以及泌尿道感染等。(2)本發(fā)明的菌株直接采集于健康人體，具有活躍穩(wěn)定的生物學(xué)特性，無需馴化和復(fù)壯工藝，可直接制劑使用。(3)本發(fā)明的菌株具有抑制陰道加德納氏菌等抑制致病菌的作用，與市售對(duì)照菌相比較、具有優(yōu)勢(shì)的陰道上皮細(xì)胞黏附力，具有在靈長(zhǎng)類動(dòng)物陰道定植的優(yōu)勢(shì)能力。附圖說明附圖1是本發(fā)明的植物乳桿菌rd-0025菌落形態(tài)的正面照片；附圖2是本發(fā)明的植物乳桿菌rd-0025的革蘭氏染色鏡檢照片；附圖3是本發(fā)明的植物乳桿菌rd-0025的16srdna基因pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；附圖4是本發(fā)明的植物乳桿菌rd-0025的乳酸檢測(cè)圖譜；附圖5是本發(fā)明的植物乳桿菌rd-0025過氧化氫顯色5min和10min圖片；附圖6是本發(fā)明的植物乳桿菌rd-0025對(duì)萬古霉素、慶大霉素和紅霉素的抗生素敏感性試驗(yàn)菌落圖；附圖7是本發(fā)明的植物乳桿菌rd-0025(左)和德氏乳桿菌(右)對(duì)陰道加德納菌的抑菌效果照片；附圖8是本發(fā)明的植物乳桿菌rd-0025(左)和德氏乳桿菌(右)對(duì)大腸埃希菌的抑菌效果照片；附圖9是本發(fā)明的植物乳桿菌rd-0025(左)和德氏乳桿菌(右)對(duì)金色葡萄球菌的抑菌效果照片；附圖10是本發(fā)明的植物乳桿菌rd-0025定植食蟹猴陰道后食蟹猴陰道微生物區(qū)部分菌株16srdna片段pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。具體實(shí)施方式以下將對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值；以下實(shí)施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中所用到的細(xì)菌培養(yǎng)基成分及配制方法如下：1、肉湯固體培養(yǎng)基(mrs)配制：(1)將瓊脂粉配成溶液，1.5g/100ml去離子水；(2)加入mrs培養(yǎng)基17.91g/100ml瓊脂溶液，混勻；(3)放入滅菌鍋，1.0mpa蒸汽滅菌20分鐘；(4)待培養(yǎng)基溫度降至室溫后倒入培養(yǎng)皿，根據(jù)培養(yǎng)皿大小約10ml/個(gè)或20ml/個(gè)；(5)于超凈臺(tái)內(nèi)操作。冷卻后成瓊脂狀，標(biāo)記培養(yǎng)基名稱及配制日期，放于4℃冰箱待用。2、肉湯液體培養(yǎng)基(mrs)配制：(1)將mrs培養(yǎng)基加入去離子水，比例為17.9lg/100ml；(2)放入滅菌鍋，1.0mpa蒸汽滅菌20分鐘；(3)待滅菌鍋無壓力后取出，分裝至ep管中，每個(gè)1.0ml。標(biāo)記培養(yǎng)基名稱及配制日期，放于4℃冰箱待用。3、過氧化氫(h2o2)鑒定培養(yǎng)基配制：(1)同肉湯固體培養(yǎng)基(mrs)配制步驟(1)至(4)；(2)待滅菌鍋無壓力后取出，稍冷卻，但仍為液體狀態(tài)時(shí)于超凈臺(tái)內(nèi)加入tmb(終濃度0.25mg/m1)、hrp(終濃度0.01mg/m1)，混勻；(3)待培養(yǎng)基溫度降至約45℃后倒入培養(yǎng)皿，冷卻后成瓊脂狀，標(biāo)記培養(yǎng)基名稱及配制日期，放于4℃冰箱待用。實(shí)施例1(植物乳桿菌rd-0025菌群的分離和接種、純化、增菌培養(yǎng))1、植物乳桿菌rd-0025菌群的分離和接種：用兩個(gè)無菌棉拭子采集受試者陰道側(cè)壁上的分泌物，以不同濃度接種于裝有配制好的mrs培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，并標(biāo)記信息，將培養(yǎng)皿置于厭氧罐中，并放入co2產(chǎn)氣袋，置于37℃孵育箱，孵育48h以上。2、植物乳桿菌菌株rd-0025的純化、增菌培養(yǎng)：按照菌落不同形態(tài)(表面、邊緣等)、大小分別計(jì)數(shù)，形態(tài)相同、大小一致的記為一種，接種環(huán)挑取單個(gè)菌落中少許細(xì)菌，按“斜線法”接種至mrs固體培養(yǎng)基以得到分離純化的單菌落；無菌牙簽挑取mrs固體培養(yǎng)基上的單菌落少許細(xì)菌，接種至mrs液體培養(yǎng)基，置于37℃孵育箱，厭氧培養(yǎng)24h-48h，篩選出新的菌株。實(shí)施例2(植物乳桿菌rd-0025菌株的鑒定及保藏)1、培養(yǎng)特性、染色鏡檢及形態(tài)學(xué)特征：培養(yǎng)后得到的菌落如附圖1，菌落一般呈白色圓形，直徑約3mm，中間凸起，表面光滑，細(xì)密；取該菌純培養(yǎng)物涂片進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如附圖2，呈現(xiàn)革蘭氏陽性，圓端直桿，單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀分布，結(jié)果表明：所分離菌株初步判定為乳桿菌屬。2、16srdna基因序列鑒定：以細(xì)菌基因組dna提取試劑盒進(jìn)行dna提取，并采用引物對(duì)27f(5’-agagtttgatcmtggctcag-3’)，1492r(5’-tacggytaccttgttacgactt-3’)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，取pcr產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，確定16srdna基因片段，在約1500bp處得到單一清晰的pcr產(chǎn)物條帶，見附圖3中。將pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化及dna序列測(cè)定，采用sanger測(cè)序法，測(cè)序引物對(duì)為27f/1492r，測(cè)序儀器abi3730xl，測(cè)序結(jié)果與genbank數(shù)據(jù)庫比對(duì)，其與植物乳桿菌同源性相似度大于99％。最終鑒定的屬種為植物乳桿菌。其16srdna的可變區(qū)序列見序列表seqidno:1。3、生理生化特征：通過七葉苷水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)(mr試驗(yàn))、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(vp試驗(yàn))、靛基質(zhì)試驗(yàn)、三糖鐵試驗(yàn)、克氏雙糖鐵試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、丙二酸鈉試驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)(枸櫞酸鹽實(shí)驗(yàn))、硝酸鹽還原試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)測(cè)定菌株生理生化反應(yīng)，所得結(jié)果如表1所示：表1植物乳酸桿菌rd0025的生理生化特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果生理生化項(xiàng)目結(jié)果七葉苷水解試驗(yàn)+甲基紅試驗(yàn)(mr試驗(yàn))+乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(vp試驗(yàn))-靛基質(zhì)試驗(yàn)-三糖鐵試驗(yàn)-克氏雙糖鐵試驗(yàn)-尿素酶試驗(yàn)-苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)-氨基酸脫羧酶試驗(yàn)-明膠液化試驗(yàn)-丙二酸鈉試驗(yàn)-檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)(枸櫞酸鹽實(shí)驗(yàn))-硝酸鹽還原試驗(yàn)-石蕊牛奶試驗(yàn)-細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)-+：表示陽性；-：表示陰性采用法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的api50chl乳桿菌鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行生化鑒定，鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表2所示表2植物乳酸桿菌rd0025api50ch試驗(yàn)條反應(yīng)結(jié)果+：表示陽性；-：表示陰性由此生化圖譜判定菌株生化特性符合植物乳桿菌的生化特性。3、菌株的保藏本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)rd-0025從中國(guó)健康育齡婦女陰道分泌物中篩選得來，已于2017年5月10日保藏于在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc)，保藏單位地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏登記號(hào)為cgmccno.14111，該菌株的分類命名為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)。實(shí)施例3(植物乳桿菌rd-0025代謝產(chǎn)物測(cè)定)1.植物乳桿菌rd-0025代謝產(chǎn)物中乳酸含量測(cè)定：采用高效液相法(0.005m硫酸水溶液(0.28ml硫酸(98％)-1000ml水，ph約為2.1)對(duì)本菌株培養(yǎng)24-48h發(fā)酵液的乳酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果標(biāo)明乳酸(l/d乳酸總和)約為30mg/ml，遠(yuǎn)高于德氏乳桿菌(市售)的乳酸含量(約15mg/ml)，本發(fā)明的乳酸檢測(cè)圖譜參見附圖42.植物乳桿菌rd-0025代謝產(chǎn)物中過氧化氫含量測(cè)定：按mcgroarty等的過氧化物酶法進(jìn)行過氧化氫半定量測(cè)定，將已分離鑒定的植物乳桿菌rd-0025接種于h2o2鑒定mrs-tmb平板，37℃厭氧培養(yǎng)24h后，取出平板，在空氣中暴露菌體。產(chǎn)h2o2乳桿菌菌落將變?yōu)樗{(lán)色，而不產(chǎn)h2o2菌落不變色，根據(jù)變色時(shí)間對(duì)產(chǎn)生的h2o2進(jìn)行半定量，結(jié)果見圖5，圖中5min時(shí)菌落已有明顯藍(lán)色顯現(xiàn)，10min時(shí)大量藍(lán)色明顯出現(xiàn)，顯然本菌很容易產(chǎn)生過氧化氫，產(chǎn)過氧化氫能力很強(qiáng)，以上結(jié)果說明本植物乳桿菌rd-0025能顯著產(chǎn)生乳酸和過氧化氫，有助于維持陰道微生態(tài)平衡。實(shí)施例4(抗生素敏感試驗(yàn))按照2015年版藥典第三部微生態(tài)活菌制品總論中抗生素敏感性試驗(yàn)的要求，采用瓊脂擴(kuò)散紙片法測(cè)定菌株對(duì)抗生素的敏感性，考察0代(c0)和傳代30(c30)代的植物乳桿菌rd-0025對(duì)各抗生素的敏感性，根據(jù)抑菌圈的大小判斷菌株對(duì)抗生素敏感性級(jí)別，測(cè)定結(jié)果如表3所示：表3植物乳酸桿菌rd0025的抗生素敏感試驗(yàn)結(jié)果抑菌圈小于10mm判定為輕度敏感，在10-20mm為中度敏感，大于20mm為敏感。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明本菌對(duì)紅霉素、氟羅沙星輕度敏感，對(duì)美羅培南和慶大霉素中度敏感，對(duì)氨芐西林、苯唑西林、青霉素g、卡那霉素、四環(huán)素、克林霉素、紅霉素、哌拉西林、頭孢曲松、氟羅沙星、萬古霉素、阿莫西林/克拉維酸、阿奇霉素、阿莫西林、桿菌肽敏感。其中對(duì)萬古霉素、慶大霉素和紅霉素的抗生素敏感圖見附圖6.實(shí)施例5(毒性試驗(yàn))5只spf級(jí)昆明種小鼠，每只小鼠陰道注入0.5ml植物乳桿菌rd-0025懸浮菌液(大于1×109cfu/只鼠)。按2015版中國(guó)藥典要求，每天測(cè)量每只小鼠體重，并觀察、記錄每只小鼠注射前后的行為和生理等變化。結(jié)果顯示7天內(nèi)所有動(dòng)物體重均有增加，未見明顯中毒癥狀，活動(dòng)行為無異常，無動(dòng)物死亡，認(rèn)為該菌株屬于無毒類菌株。實(shí)施例6(植物乳桿菌rd-0025傳代穩(wěn)定性測(cè)試)本實(shí)施例從生長(zhǎng)特性、形態(tài)學(xué)、生化特點(diǎn)、代謝物成分、抗生素敏感特性、遺傳特性以及毒性測(cè)試等方面對(duì)本植物乳桿菌菌株rd-0025進(jìn)行了傳代30代(c30)的穩(wěn)定性考察。1、植物乳桿菌rd-0025分離純化、菌落形態(tài)觀察、染色鏡檢及生化特性檢測(cè)方法同實(shí)施例1和實(shí)施例2的第一部分。結(jié)果表明：經(jīng)過傳代，菌落形態(tài)見為白色圓形菌落，大小約3mm，中間凸起，表面光滑，未發(fā)生顯著變化，傳代穩(wěn)定；革蘭氏染色呈現(xiàn)為革蘭氏陽性桿菌，染色鏡檢照片與0代沒有變化。2、遺傳特性分析：方法同實(shí)施例2的第二部分。分別對(duì)植物乳桿菌rd-0025的第0代(c0)、第30代(c30)菌株進(jìn)行16srdna片段pcr擴(kuò)增，將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析，目的條帶清晰且單一，大小約為1500bp，擴(kuò)增正確，c0、c30兩次pcr擴(kuò)增結(jié)果一致，將測(cè)得序列使用ncbi中的blast工具與genbank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對(duì)分析，為植物乳桿菌，同源性相似度100％。3、代謝產(chǎn)物測(cè)定：方法同實(shí)施例3，乳酸測(cè)定含量約30mg/ml，過氧化氫實(shí)驗(yàn)顯示各代菌落均在5min時(shí)均已出現(xiàn)藍(lán)色，10min時(shí)大量藍(lán)色明顯出現(xiàn)，證明菌株代謝產(chǎn)生過氧化氫能力和產(chǎn)乳酸能力穩(wěn)定。4、抗生素敏感試驗(yàn)：方法同實(shí)施例4，采用采用瓊脂擴(kuò)散紙片法測(cè)定菌株對(duì)抗生素的敏感性，根據(jù)藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判定本植物乳桿菌株對(duì)紅霉素、氟羅沙星輕度敏感，對(duì)美羅培南和慶大霉素中度敏感，對(duì)氨芐西林、苯唑西林、青霉素g、卡那霉素、四環(huán)素、克林霉素、紅霉素、哌拉西林、頭孢曲松、氟羅沙星、萬古霉素、阿莫西林/克拉維酸、阿奇霉素、阿莫西林、桿菌肽敏感。5、毒性試驗(yàn)：方法同實(shí)施例5，用小鼠陰道注入傳代30代(c30)的植物乳桿菌rd-0025菌液進(jìn)行了毒性測(cè)試，其中測(cè)試的濃度＞109cfu/只鼠。結(jié)果為：全部受試小鼠7天內(nèi)均未見中毒癥狀，體重均有增加，無動(dòng)物死亡。根據(jù)上述結(jié)果，按《新藥藥理、毒理研究技術(shù)要求補(bǔ)充說明》，該菌株屬于無毒類菌株。綜合，本實(shí)施例將植物乳桿菌rd-0025用mrs培養(yǎng)基培養(yǎng)多次傳代，從形態(tài)學(xué)、生化學(xué)、代謝物特點(diǎn)及遺傳特性、藥敏特性、毒性試驗(yàn)等方面探討了傳代繁植對(duì)植物乳桿菌的影響。結(jié)果表明：用mrs培養(yǎng)傳代在30代以內(nèi)其形態(tài)學(xué)、生化學(xué)、遺傳特性、代謝物及藥敏特性與最初分離菌株一致。實(shí)施例7(植物乳桿菌rd-0025菌株藥效學(xué)實(shí)驗(yàn))一、植物乳桿菌rd-0025菌株體外抑菌實(shí)驗(yàn)(1)植物乳桿菌rd-0025和德氏乳桿菌體外抑制陰道加德納菌的實(shí)驗(yàn)：按照3％接種濃度制備植物乳桿菌rd-0025的mrs瓊脂菌餅，于37℃下厭氧培養(yǎng)24h，同法制備市售德氏乳桿菌菌餅；取陰道加德納菌100μl，接種于10mlbhi固體培養(yǎng)基中，放入植物乳桿菌rd-0025和德氏乳桿菌菌餅，37℃厭氧培養(yǎng)48h；乳桿菌周圍會(huì)出現(xiàn)明顯抑菌圈。結(jié)果見圖7，其中左圖為植物乳桿菌rd-0025抑菌圈效果，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑為32.3mm，右圖為德氏乳桿菌抑菌圈效果，抑菌直徑為21.5mm，結(jié)論為植物乳桿菌rd-0025對(duì)陰道加德納菌的抑菌效果強(qiáng)于德氏乳桿菌。(2)植物乳桿菌rd-0025和德氏乳桿菌體外抑制金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌，銅綠假單胞菌和沙門氏菌的實(shí)驗(yàn)：按照3％接種濃度制備植物乳桿菌rd-0025的mrs瓊脂菌餅，于37℃下厭氧培養(yǎng)24h，同法制備市售德氏乳桿菌菌餅；將金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌，銅綠假單胞菌和沙門氏菌接種在胰酪大豆胨液體(tsb)瓊脂培養(yǎng)基，放入植物乳桿菌rd-0025和德氏乳桿菌菌餅。于33℃培養(yǎng)18-24h，觀察抑菌圈，游標(biāo)卡尺測(cè)量rd-0025抑菌圈直徑約為22mm，右圖為德氏乳桿菌抑菌圈效果，抑菌直徑為12mm，結(jié)論為植物乳桿菌rd-0025對(duì)金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌，銅綠假單胞菌和沙門氏菌的抑菌效果強(qiáng)于德氏乳桿菌，代表性圖見附圖8-9二、細(xì)胞黏附力實(shí)驗(yàn)：根據(jù)黏附在陰道上皮細(xì)胞單細(xì)胞層上的乳桿菌個(gè)數(shù)，確定不同乳桿菌的黏附性能。方法如下：取人類陰道上皮細(xì)胞vk2/e6e7和人類子宮頸癌上皮細(xì)胞hela，將細(xì)胞以50萬每孔的密度接種于一個(gè)12孔板中，待48小時(shí)后vk2/e6e7形成單細(xì)胞層；每孔以不同數(shù)量的cfu分別加入市售乳桿菌(德氏乳桿菌)和植物乳桿菌rd-0025，粘附4小時(shí)，粘附過程中在搖床上面輕輕振蕩，各組分別設(shè)有兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)；當(dāng)粘附結(jié)束后，用1ml0.05％tritonx-100裂解細(xì)胞，制成懸浮菌液，稀釋，分別取100ul菌液均勻地接種于mrs瓊脂培養(yǎng)基平板上；厭氧培養(yǎng)48小時(shí)后，統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板的克隆數(shù)。結(jié)果顯示：植物乳桿菌rd-0025的4h黏附率分別為35.2％和45.3％，市售同類德氏乳桿菌菌株4h黏附率分別為23.6％和20.7％，植物乳桿菌rd-0025的黏附力高于市售同類乳桿菌德氏乳桿菌菌株。三、家兔陰道定植實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)方法選擇10只健康動(dòng)物按體重進(jìn)行分層隨機(jī)分組，分成2組，陽性對(duì)照組動(dòng)物5只，實(shí)驗(yàn)組5只：定植用植物乳桿菌rd-0025制備：稱取植物乳桿菌rd-0025的冷凍干燥菌粉，使定植量為106。對(duì)照組使用上市品(德氏乳桿菌膠囊)，無菌操作條件下，各加入mrs液體培養(yǎng)基0.5ml，混合均勻，用陰道給藥器全部吸取后陰道植入。定植造模及取樣：在可觀察到正常月經(jīng)周期的猴子月經(jīng)后，連續(xù)7天植入造模菌。每周對(duì)動(dòng)物的陰道進(jìn)行一次觀察，檢查陰道分泌物的顏色，性狀及分泌量及測(cè)定陰道分泌物ph，取2只無菌棉簽取樣，其中一只棉簽用于陰道分泌物清潔度鏡檢，另一支棉簽用于菌群分析。陰道菌的分離和純化培養(yǎng)：將采集的陰道分泌物，在2mld-hanks緩沖液中振蕩，以磷酸鹽緩沖液做梯度稀釋，分別涂布于mrs瓊脂板上并且在37℃，厭氧條件下培養(yǎng)24～48h。記錄單菌落形態(tài)等信息，重新劃線mrs瓊脂板以得到純化的菌落并進(jìn)行生化和分子鑒定。分子生物學(xué)方法鑒定(16srdna基因序列分析)：對(duì)所分離純化出的菌株進(jìn)行16srdna的序列擴(kuò)增、測(cè)序及分析，將鑒定為16srdna片段的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物使用切膠回收法對(duì)目的片段純化后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的16srdna基因序列使用ncbi中的blast工具與genbank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對(duì)分析，同源性為99％，鑒定為同一物種。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析陰道粘膜及分泌物一般觀察：植入后每周觀察一次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有試驗(yàn)動(dòng)物陰道粘膜分泌物未發(fā)現(xiàn)明顯異常。陰道分泌物ph值測(cè)定：在植物乳桿菌rd-0025植入后，大部分實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物陰道分泌物ph值明顯低于上市品對(duì)照組，且相對(duì)于植入前明顯下降，ph值測(cè)定結(jié)果如表4所示。表4植物乳酸桿菌rd0025對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物陰道分泌物ph影響試驗(yàn)結(jié)果陰道分泌物清潔度：植入前后相比，對(duì)照組陰道雜菌數(shù)量明顯增加，清潔度降低；而實(shí)驗(yàn)組在植物乳桿菌rd-0025植入后，陰道分泌物清潔度明顯優(yōu)于對(duì)照組，可見到數(shù)量不等的革蘭氏陽性陰道桿菌，清潔度明顯高于對(duì)照組。陰道分泌物清潔度判定結(jié)果如表5所示。表5植物乳酸桿菌rd0025對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物陰道分泌物清潔度影響試驗(yàn)結(jié)果ⅰ～ⅲ為清潔程度，ⅲ表示潔凈度最低。將實(shí)驗(yàn)組分泌物進(jìn)行擴(kuò)增分離純化，經(jīng)過陰道菌群分析，從實(shí)驗(yàn)組全部3只動(dòng)物陰道分泌物中均發(fā)現(xiàn)供試植物乳桿菌rd-0025，分離出的供試植物乳桿菌rd-0025的信息如圖10所示。從圖中可看出，受試動(dòng)物陰道分泌物中均發(fā)現(xiàn)供試植物乳桿菌rd-0025，因此可以看出植物乳桿菌rd-0025可以有效定植于中華食蟹猴陰道內(nèi)。實(shí)施例8(植物乳桿菌rd-0025凍干保存及凍干粉穩(wěn)定性)為了檢測(cè)植物乳桿菌rd-0025在發(fā)酵和凍干情況下的存活率，將植物乳桿菌rd-0025在ph6.5的改良mrs培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，使用100升規(guī)模的發(fā)酵罐發(fā)酵。在平臺(tái)期早期收集菌體，其活菌數(shù)達(dá)到約3×109cfu/ml。通過離心分離收集菌體，用磷酸緩沖液洗滌后，與凍干保護(hù)劑(包括脫脂奶粉和蔗糖等)混合。然后，將混合物置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥。樣品在-40℃下冷凍約2小時(shí)，然后在-20℃下真空干燥20-30小時(shí)，再在30℃干燥3-5小時(shí)。干粉用鋁箔袋分裝，并存儲(chǔ)在4℃和室溫(25℃)。在第0、1、3、6、9、12月通過平板計(jì)數(shù)測(cè)定活菌數(shù)。初始的植物乳桿菌rd-0025每克干粉含有高達(dá)500億活菌(5×1010cfu/g)，在4℃下具有最佳的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。4℃下儲(chǔ)存6個(gè)月后，保留初始活菌數(shù)的80％，見表6。表6植物乳酸桿菌rd0025凍干粉菌劑穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>廣東強(qiáng)基藥業(yè)有限公司；廣東龍創(chuàng)基藥業(yè)有限公司；趙湘江<120>一種植物乳桿菌及其用于制備陰道抑菌藥物的應(yīng)用<160>1<210>1<211>1471<212>dna<213>人工序列<400>1aatctctggtccacttaggcggctggttctaaaaggttac40cccaccgactttgggtgttacaaactctcatggtgtgacg80ggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggca120tgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtagg160cgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggctttaag200agattagcttactctcgcgagttcgcaactcgttgtacca240tccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcat280gatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcac320cggcagtctcaccagagtgcccaacttaatgctggcaact360gataataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaaca400tctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgta440tccatgtccccgaagggaacgtctaatctcttagatttgc480atagtatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttc520gaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgt560caattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccag600gcggaatgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcgg640aaaccctccaacacttagcattcatcgtttacggtatgga680ctaccagggtatctaatcctgtttgctacccatactttcg720agcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgcc760actggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctaca800catggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttccca840gtttccgatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcac880atcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaa920taaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggc960tgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaaatacc1000gtcaatacctgaacagttactctcagatatgttcttcttt1040aacaacagagttttacgagccgaaacccttcttcactcac1080gcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtggaagat1120tccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctc1160agtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgt1200atcattgccatggtgagccgttaccccaccatctagctaa1240tacgccgcgggaccatccaaaagtgatagccgaagccatc1280tttcaaactcggaccatgcggtccaagttgttatgcggta1320ttagcatctgtttccaggtgttatcccccgcttctgggca1360ggtttcccacgtgttactcaccagttcgccactcactcaa1400atgtaaatcatgatgcaagcaccaatcaataccagagttc1440gttcgactgcatgtatagcacgccgcacctc1471當(dāng)前第1頁12