本發(fā)明涉及植物病害生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一株具有抑制水稻紋枯病的內(nèi)生芽孢桿菌菌株zy122及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻作為世界三大主糧之一，是全球約50%人口的主糧。其主要集中分布在熱帶或亞熱帶的高溫多雨地區(qū)，如我國長江流域、珠江三角洲和四川盆地，中南半島等，其中近90%產(chǎn)于亞洲。目前世界水稻種植面積約15500萬公頃，我國水稻種植面為3100萬公頃，約占世界種植面積的20%；我國的水稻總產(chǎn)量居世界第一，單產(chǎn)居世界第五。水稻在我國主要分布于六大產(chǎn)區(qū)，分別為：華南雙季稻作帶；華東、華中單雙季稻作帶；西北干燥稻作帶；華北單季稻作帶；東北早熟稻作帶和西南高原稻作帶。隨著人口不斷的增加，我國對稻谷的需求量也越來越大，如何保障稻米生產(chǎn)和消費的平衡已經(jīng)給我國稻米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提出嚴峻挑戰(zhàn)。在我國淡水資源緊張、勞動力短缺和生產(chǎn)成本增加等因素的影響下，水稻種植增糧與增收矛盾日益突出，再加上全球氣候及生態(tài)環(huán)境日益惡化，導(dǎo)致水稻的各種病蟲害呈現(xiàn)增加的態(tài)勢。

水稻紋枯病是當(dāng)前水稻生產(chǎn)上的主要病害之一，該病是由瓜亡革菌thanatephoruscucumeris所引起，瓜亡革菌thanatephoruscucumeris屬擔(dān)子菌亞門真菌，發(fā)生范圍廣、危害嚴重、防治困難。該病使水稻不能抽穗，或抽穗的秕谷較多，粒重下降。對于水稻紋枯病的防治既有傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑，也有新興的生物防控技術(shù)。國內(nèi)涉及到水稻紋枯病的專利技術(shù)約有400余項，其中化學(xué)藥劑相關(guān)的專利約占60%；生物技術(shù)約占30%；化學(xué)與生物防治兩者結(jié)合的專利技術(shù)約占10%。

芽孢桿菌廣泛地存在于自然界，具有繁殖快速、代謝快的特點；該屬細菌的重要特性是能夠產(chǎn)生對不利條件具有特殊抵抗力的芽孢。它們也存在于土壤、植物組織內(nèi)、水和空氣中，與自然界物質(zhì)轉(zhuǎn)化、土壤肥力、環(huán)境衛(wèi)生均密切相關(guān)。同時它們對有機質(zhì)分解力強，增殖的同時，會釋出高活性的分解酵素，合成多種有機酸、酶、生理活性等物質(zhì)，及其它多種容易被利用的養(yǎng)分，促進作物生長。隨著土壤的生物多樣性退化及土壤堿化，芽孢桿菌能夠在逆境中存活和生長，為土壤提供各種酶類和增加土壤微生物的多樣性。植物內(nèi)生菌是一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內(nèi)部的真菌或細菌。其普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，單子葉植物和雙子葉植物內(nèi)均有內(nèi)生細菌。內(nèi)生菌不僅可以給植物提供所需營養(yǎng)物質(zhì)及一些激素，對植物的生長發(fā)育、抵抗病蟲侵襲及不良環(huán)境等具有廣泛的生物學(xué)作用，還可以增強植物抗逆境、抗病蟲害的能力，目前已成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌或作為潛在的生防載體菌而加以利用。

內(nèi)生菌存在于植物體內(nèi)，可在植物體內(nèi)長期定殖并傳導(dǎo)，不易受外界環(huán)境條件的影響，有研究顯示，51％的從植物內(nèi)生菌分離的生物活性物質(zhì)是以前沒有發(fā)現(xiàn)的化合物，這對抗菌活性物質(zhì)來源的新領(lǐng)域的開發(fā)將具有十分重大的經(jīng)濟意義。篩選能夠?qū)Σ≡修卓棺饔玫难挎邨U菌在病害的生物防治、促進作物生長、改善土壤生態(tài)環(huán)境等方面具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株具有抑制水稻紋枯病的內(nèi)生芽孢桿菌菌株zy122，本發(fā)明提供的內(nèi)生芽孢桿菌菌株zy122可用于抑制水稻紋枯病，其對水稻紋枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris的抑菌率可達81.9％，防治效果可達70.0％以上。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述內(nèi)生芽孢桿菌菌株zy122在水稻紋枯病的生物防治中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的在于提供內(nèi)生芽孢桿菌菌株zy122在制備抑制水稻紋枯病的生物制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有抑制水稻紋枯病的的生物制劑。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一株具有抑制水稻紋枯病的內(nèi)生芽孢桿菌菌株zy122(bacillusvanilleazy122)，所述菌株于2017年4月11日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏地址為廣州市先烈中路100號，保藏編號為gdmccno.60161。

本發(fā)明中所述菌株含有如seq1所示的16srdna基因序列。

本發(fā)明的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122菌落形態(tài)特征：該菌株在lb培養(yǎng)基上生長速度較快（37℃，20h），呈灰白狀，為黏液型菌株，細胞微透明，呈（長1.3～1.8um寬0.4～0.7um）桿狀，菌落中間有凸起，能夠產(chǎn)生芽孢，周生鞭毛。

本發(fā)明的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122的生理生化特性：

革蘭氏陽性菌，兼性厭氧，ph生長范圍ph4.0～8.0（最佳為5.0～7.0），耐nacl可在0～8%(w/v)條件下可生長（最佳為1～4%），可適應(yīng)生長溫度區(qū)間為20～45℃（最佳為28～7℃），dna的g+c含量為46.4mol%。產(chǎn)氨試驗、乙酰甲醛甲醇測定均為陽性；尿酶試驗、甲基紅測定、過氧化氫酶試驗、檸檬酸利用試驗為陰性。能高效利用龍膽二糖、α–d–乳糖、β–甲基–d–葡萄糖苷、肝糖、d-木糖作為碳源，而以阿拉伯糖、蜜二糖、海藻糖和松二糖作為碳源則生長緩慢。菌株對50μg/ml氨芐青霉素、100μg/ml鏈霉素、300μg/ml四環(huán)素均具有耐受性；而對卡拉霉素、慶大霉素、氯霉素，新霉素、紅霉素耐受性差、低濃度（5μg/ml）的這幾種抗生素就能抑制其生長。

本發(fā)明提供的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122經(jīng)16srdna序列比對(ezbiocloud數(shù)據(jù)庫)與bacillusvanilleaxy18(t)芽孢桿菌的同源性為99.42%；該菌株的16srdna序列如序列表所示。

本發(fā)明芽孢桿菌bacillusvanilleazy122的分子分類地位的確定：

采用細菌16srrna基因通用引物25f和1492r進行擴增，將pcr產(chǎn)物直接進行序列測定。將獲得的dna序列輸入ezbiocloud進行比對，初步確定本發(fā)明的菌株在分類學(xué)中的屬、種的位置。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬bacillus，與bacillusvanilleaxy18(t)芽孢桿菌的同源性為99.42%，但二者的序列不完全一致，有0.58%的差異，表明二者是同種內(nèi)不同的菌株。結(jié)合上述的生理生化特性、16srdna序列分析，本發(fā)明的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122應(yīng)歸屬于芽孢桿菌屬bacillus。

本發(fā)明的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122可用于水稻紋枯病的生物防治。更具體地，所述芽孢桿菌菌株zy122可應(yīng)用于抑制水稻紋枯病病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris。芽孢桿菌bacillusvanilleazy122對水稻紋枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris抑菌率可達81.9％，對水稻紋枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris防治效果可達70.0％以上。

上述內(nèi)生芽孢桿菌菌株zy122在制備抑制水稻紋枯病的生物制劑中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

一種具有抑制水稻紋枯病的的生物制劑，所述生物制劑中含有權(quán)利要求1所述內(nèi)生芽孢桿菌菌株zy122。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明通過采用選擇性培養(yǎng)基，以水稻紋枯病的病原菌瓜亡革菌為防治對象，對生長于長期未施肥的健康野生稻植株中存在的拮抗內(nèi)生細菌進行分離、純化，得到一株拮抗水稻紋枯病的芽孢桿菌，為水稻紋枯病的生物防治奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的內(nèi)生芽孢桿菌菌株zy122的合理應(yīng)用可以減少化學(xué)藥劑對環(huán)境造成的污染，有利于保護生態(tài)平衡，對水稻的栽培和增收增產(chǎn)都能夠起到很大的提高和促進作用，具有一定的研究意義。

附圖說明

圖1為實施例1提供的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122在lb培養(yǎng)基上稀釋涂布的菌落圖片；

圖2為水稻紋枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris對照組在pda培養(yǎng)基上的生長圖；

圖3為實施例1提供的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122對病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris的拮抗效果圖；

圖4為實施例1提供的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122全基因組dna及16srdna的pcr產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實施方式

下面結(jié)合圖表對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但此說明并不做任何形式方面的限定，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍中。

實施例1芽孢桿菌bacillusvanilleazy122的分離、篩選以及分子分類學(xué)地位的確定本實施提供的抑制水稻紋枯病的生防菌株芽孢桿菌bacillusvanilleazy122保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏地址廣州市先烈中路100號，保藏日期為2017年4月11日，保藏編號為gdmccno.60161。

本實施方式的芽孢桿菌bacilluszy122來源于廣西梧州野生稻田，采用選擇性培養(yǎng)基對野生稻健康植株進行內(nèi)生細菌分離獲得，具體方法如下：

（1）野生稻內(nèi)生菌的分離

將采集的野生稻材料用蒸餾水洗凈，選取適量的根、莖、葉組織，用無菌剪刀剪成碎片狀，放入無菌培養(yǎng)皿中，用75％乙醇浸泡3min，然后在2％naclo溶液中浸泡3min，取出后用無菌水沖洗3次，每次5min，最后一次清洗的無菌水涂布lb，作為對照檢測是否材料消毒徹底。在無菌研缽內(nèi)加入無菌水研磨成勻漿，將勻漿稀釋十倍以后，用移液槍分別吸取100ul至無菌lb固體平板上，涂抹均勻后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察菌體的生長情況，用接種環(huán)挑取長勢好且形態(tài)不同的菌苔，用平板劃線法進行反復(fù)傳代培養(yǎng)，直至菌落的顏色、形狀、大小、質(zhì)地和透明度一樣。最后通過簡單染色（石碳酸復(fù)紅染色）和顯微鏡鏡檢（油鏡），進一步觀察其形態(tài)，以長度均一、寬度一致、染色情況統(tǒng)一為菌株純化標(biāo)準(zhǔn)。純化后的菌株于15%的甘油中-20℃和-80℃分別保存。

（2）內(nèi)生菌拮抗水稻紋枯病原菌的初篩

采用平板對峙法對野生稻內(nèi)生菌拮抗紋枯病病原真菌進行初篩。將水稻紋枯病病原菌用無菌水制成濃度為10⁸/ml^-1的菌懸液，取20ul平板涂布在pda培養(yǎng)基上，然后在涂布的pda平板上劃十字線分出4個區(qū)域，在每個區(qū)域中心分別用無菌牙簽接入少量已純化出的野生稻內(nèi)生菌，放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后觀察記錄抑菌圈的有無及大小，共重復(fù)3次。選出抑菌圈寬度最大的5株內(nèi)生菌進行復(fù)篩。

（3）內(nèi)生菌拮抗水稻紋枯病原菌的復(fù)篩

采用平板對峙法對內(nèi)生菌拮抗病原真菌進行復(fù)篩。將水稻紋枯病病原菌用無菌水制成濃度為10⁸/ml^-1的菌懸液，然后取20ul在pda培養(yǎng)基上涂布，在已涂布平板上劃十字線分出4個區(qū)域，每個區(qū)域中心分別用無菌牙簽接入初步篩選出來有拮抗作用的內(nèi)生菌，設(shè)無菌水為對照，重復(fù)3次。置于28℃恒溫條件下培養(yǎng)，5天后觀察抑菌效果，測量抑菌圈大小。選出效果最好的一株菌，保存?zhèn)溆谩?/p>

抑菌率(％)＝(處理組抑菌圈直徑－對照組抑菌圈直徑/處理組抑菌圈直徑)×100％

本實施例中所應(yīng)用的培養(yǎng)基配方如下：

lb培養(yǎng)基：酵母提取物5g、細菌學(xué)蛋白胨10g、nacl5g、agar20g、無菌水1l，ph=7.0。

pda培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、agar20g、無菌水1l，自然ph。

圖1為本實施例提供的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122在lb培養(yǎng)基上稀釋涂布的菌落圖片，左圖為菌落背面照，右圖為菌落正面照。由圖1可觀察到本發(fā)明的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122菌落形態(tài)特征：該菌株在lb培養(yǎng)基上生長速度較快（37℃，20h），呈灰白狀，為黏液型菌株，細胞微透明，呈（長1.3～1.8um寬0.4～0.7um）桿狀，菌落中間有凸起，能夠產(chǎn)生芽孢，周生鞭毛。

圖2為水稻紋枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris對照組在pda培養(yǎng)基上的生長圖，左圖為瓜亡革菌正面照，右圖為瓜亡革菌背面照；圖3為芽孢桿菌bacillusvanilleazy122對水稻紋枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris的抑菌效果圖，左圖為抑菌正面照，右圖為抑菌背面照。芽孢桿菌bacilluszy122對水稻紋枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris的抑菌率可達81.9％。

（4）芽孢桿菌bacillusvanilleazy122的分子分類學(xué)地位的確定

挑取拮抗芽孢桿菌bacillusvanilleazy122接種于lb固體培養(yǎng)基中，12h后收集菌體并提取菌株基因組dna，用1%瓊脂糖電泳驗證dna組片段的大小。圖4為本實施例提供的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122全基因組dna及16srdna的pcr產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中左圖為全基因組dna的1%瓊脂糖凝膠電泳圖，右圖為16srdna的pcr產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠電泳圖。由圖4可知：左圖中全基因組的電泳條帶單一清晰，全基因組大于10000bp；右圖中的pcr產(chǎn)物的電泳條帶單一清晰，片段長度約為1500bp左右。

以基因組dna為模板，應(yīng)用細菌16srdna基因通用引物：上游引物5’-agagtttgatc-ctggctcag-3’和下游引物5’-aaggaggtgatccagcc-3；

pcr反應(yīng)體系：10×pcrbuffer2.5μl，dntp2.0μl，上下游引物各0.5μl，dna模板1.0μl，taqdna聚合酶0.2μl，補雙蒸水至25μl。pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，循環(huán)擴增30次：最后72℃延伸10min。用1%瓊脂糖電泳驗證pcr產(chǎn)物dna片段的大小，如圖4可知，芽孢桿菌bacillusvanilleazy122dnapcr產(chǎn)物通過凝膠電泳擴增到單一條帶，條帶清晰，大小約為1500bp。將pcr產(chǎn)物委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序，獲得的dna序列輸入genbank進行blast比對，初步確定本發(fā)明的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122菌株在分類學(xué)中的屬、種的位置。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所述的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122，與bacillusvanilleaxy18(t)芽孢桿菌的同源性為99.42%，結(jié)合上述形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性、16srdna系統(tǒng)發(fā)育分析及文獻查閱，本發(fā)明的芽孢桿菌bacillusvanilleazy122應(yīng)歸屬于芽孢桿菌屬bacillus。

測序結(jié)果如下：

gctataatgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttaggagccagccgccgaag

本實施例中的病原菌為從水稻莖基部分離得到的瓜亡革菌thanatephoruscucumeris。

實施例2芽孢桿菌bacillusvanilleazy122在水稻紋枯病的生物防治中的應(yīng)用

本實施方式中芽孢桿菌bacillusvanilleazy122可用于水稻紋枯病的生物防治，防治效果實驗如下：

設(shè)置三個實驗組進行盆栽實驗，分別為健康對照組、感病對照組和防治組，每組20株水稻。用瓜亡革菌thanatephoruscucumeris配置成濃度為1×10⁸個/ml的孢子懸浮液。將水稻進行表面消毒后，用針刺法對健康對照組注入20μl無菌水，感病對照組和防治組各注入20μl瓜亡革菌懸浮液后接種于花盆中。并將防治組植株根部澆灌3ml拮抗芽孢桿菌培養(yǎng)液(濃度為0.6×10⁷～1×10⁹cfu/l)。保證每個實驗組的水稻在陰涼通風(fēng)處生長，每天進行澆灌，15d后觀察并記錄水稻發(fā)病情況。

防治效果＝(感病組植株數(shù)-對照組感病植株數(shù)-防治組感病植株數(shù))/接種植株數(shù)×100％。

表1芽孢桿菌bacillusvanilleazy122抑制瓜亡革菌thanatephoruscucumeris的測試

據(jù)實驗結(jié)果可知，芽孢桿菌bacillusvanilleazy122對瓜亡革菌thanatephoruscucumeris的防治效果可達70.0％以上。

sequencelisting

<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一株具有抑制水稻紋枯病的內(nèi)生芽孢桿菌菌株zy122及其應(yīng)用

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1428

<212>dna

<213>芽孢桿菌bacillusvanilleazy122的16srdna

<400>1

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