本發(fā)明屬于益生菌領(lǐng)域，具體涉及一種致病菌拮抗劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌是人體與動(dòng)物腸道中的常見(jiàn)致病菌，感染力強(qiáng)，少量的該菌就可以導(dǎo)致人腹瀉等腸道疾病，且被該菌感染后治療困難，尤其是艱難梭菌。大腸桿菌中的部分菌株也可以引起腸道疾病，它的數(shù)量穩(wěn)定對(duì)腸道的平衡也有著重要的意義。部分益生菌對(duì)腸道中的致病菌具有一定的抑制作用，其抑制機(jī)理比較復(fù)雜。體外研究單一菌體對(duì)以艱難梭菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制能力，為它們體內(nèi)對(duì)腸道條件治病菌的抑制提供借鑒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)不斷實(shí)驗(yàn)，從一種傳統(tǒng)的乳制品中分離一對(duì)天然互惠共生乳酸菌，共生體益生菌sr-19與cr-29，都為革蘭氏陽(yáng)性，兼性厭氧菌，其在致病菌拮抗方面產(chǎn)生了預(yù)料不到的效應(yīng)，可以作為本發(fā)明致病菌拮抗劑，本發(fā)明即是基于以上發(fā)現(xiàn)而完成。

本發(fā)明的第一個(gè)方面是公開(kāi)一種致病菌拮抗劑，其包括cgmcc編號(hào)11870的耐久腸球菌cr-29(enterococcusduranscr-29)和cgmcc編號(hào)11869的腸膜明串珠菌腸膜亞種菌sr-19(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidessr-19)。

優(yōu)選的，所述致病菌拮抗劑中，耐久腸球菌cr-29與腸膜明串珠菌腸膜亞種菌sr-19的cfu/g比例為1:10-10:1。

優(yōu)選的，所述致病菌為對(duì)腸道沙門氏菌(salmonellaenterica)、福氏志賀氏菌(shigellaflexneri)、單核細(xì)胞增生性李斯特菌(listeriamonocytonenes)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、艱難梭菌(clostridiumdifficile)、大腸桿菌(escherichiacoli)。

本發(fā)明的第二方面是公開(kāi)致病菌拮抗劑的培養(yǎng)方法，

采用液體培養(yǎng)基，腸膜明串珠菌腸膜亞種均sr-19與耐久腸球菌cr-29的接種量分別為5％與7％，初始ph6.8；

初始培養(yǎng)溫度為44℃(1.0-1.5小時(shí))；中段培養(yǎng)溫度為42℃(2.0-2.5小時(shí))，發(fā)酵中段為ph5.9；末段培養(yǎng)溫度為38℃(1.5-2.0小時(shí))；

振蕩頻率140r/min的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)4h后添加補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)繼續(xù)培養(yǎng)，至活菌數(shù)不小于1010cfu/ml收獲；

培養(yǎng)出的活菌體可通過(guò)低溫離心分離獲得；

所述液體培養(yǎng)基，即工業(yè)培養(yǎng)基，的配方為：脫脂奶粉100g/l,酵母粉10g/l，蔗糖50g/l，檸檬酸鈉2g/l,醋酸鈉0.5g/l，ph6.8-7.2；所述補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的配方為：牛肉膏與胡蘿卜原汁2:1體積混合溶液。

本發(fā)明的第三個(gè)方面是公開(kāi)一種致病菌拮抗劑的菌粉，通過(guò)以下方法制成：

活菌數(shù)不小于1010cfu/ml益生菌共生體發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾或離心，利用凍干保護(hù)劑進(jìn)行真空冷凍干燥，凍干曲線為：起始溫度-42℃，預(yù)凍4小時(shí)，-42℃至-5℃每小時(shí)升溫5℃；-5℃至11℃每小時(shí)升溫2℃，從10℃至40℃每小時(shí)升溫5℃；從40℃至50℃每小時(shí)升溫2℃，在30小時(shí)內(nèi)完成凍干制備，制得致病菌拮抗劑益生菌菌粉；以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

本發(fā)明的第四個(gè)方面是公開(kāi)一種致病菌拮抗劑，含有第一二三方面的致病菌拮抗劑和藥學(xué)上可以接受的輔料。

本發(fā)明的第五個(gè)方面是公開(kāi)致病菌拮抗劑在制備致病菌拮抗劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第六個(gè)方面是公開(kāi)致病菌拮抗劑在制備耐胃酸、耐腸液、耐膽汁的致病菌拮抗劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第七個(gè)方面是公開(kāi)述致病菌拮抗劑在制備預(yù)防和/或治療腹瀉藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第八個(gè)方面是公開(kāi)致病菌拮抗劑在制備耐胃酸、耐腸液、耐膽汁的預(yù)防和/或治療腹瀉藥物中的應(yīng)用。

在一些實(shí)施例中，該共生體益生菌的生產(chǎn)過(guò)程是通過(guò)：接種、復(fù)壯、發(fā)酵培養(yǎng)、分離、凍干等步驟。具體的，

共生體益生菌腸膜明串珠菌腸膜亞種sr-19與耐久腸球菌cr-29的接種量5％與7％，培養(yǎng)基為：牛奶(羊奶或馬奶)、脫脂奶粉、乳清蛋白、維生素k、礦物元素為原料，初始培養(yǎng)溫度為44℃(1.0-1.5小時(shí))；中段培養(yǎng)溫度為42℃(2.0-2.5小時(shí))；末段培養(yǎng)溫度為38℃(1.5-2.0小時(shí))。初始ph6.8，發(fā)酵中段為ph5.9，振蕩頻率140r/min的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)4h后以補(bǔ)料速度6.3m/h補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(牛肉膏與胡蘿卜汁2:1混合溶液)繼續(xù)培養(yǎng)至收獲可使益生菌菌活菌數(shù)不小于1010cfu/ml以上。培養(yǎng)出的活菌體可通過(guò)低溫離心分離(6000r/min)獲得，利用海藻酸鈉、木糖醇、初乳蛋白(2:1:1)作為凍干保護(hù)劑進(jìn)行真空冷凍干燥，凍干曲線為：起始溫度-42℃，預(yù)凍4小時(shí)，-42℃至-5℃每小時(shí)升溫5℃；-5℃至11℃每小時(shí)升溫2℃，從10℃至40℃每小時(shí)升溫5℃；從40℃至50℃每小時(shí)升溫2℃，在30小時(shí)內(nèi)完成凍干制備，制的共生體益生菌菌粉。

所述培養(yǎng)基與凍干保護(hù)劑配方：

益生菌共生體的培養(yǎng)基詳細(xì)配方，包括各組分和含量；

實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0.5g，硫酸錳0.25g，瓊脂15g，加蒸餾水至1000ml，ph6.4。

工業(yè)化培養(yǎng)基組成為:脫脂奶粉100g/l,酵母粉10g/l，蔗糖50g/l，檸檬酸鈉2g/l,醋酸鈉0.5g/l，ph6.8-7.2。補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：牛肉膏beefextract與胡蘿卜原汁2:1混合溶液按發(fā)酵總量的0.8％補(bǔ)充；

培養(yǎng)基121℃濕熱滅菌，備用。

凍干保護(hù)劑：海藻酸鈉50％、木糖醇25％、初乳蛋白25％(2:1:1)作為凍干保護(hù)劑按1:10比例與發(fā)酵液干物質(zhì)混合。

本發(fā)明涉及的主要儀器及設(shè)備：

4℃冰箱sc-276，海爾集團(tuán)；-86℃冰箱dw-fw3_51，中科美菱低溫科技有限公司；電子天平j(luò)a2003，上海精密科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯酸度計(jì)phs-2_5，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；無(wú)菌超凈工作臺(tái)sw-cj一1f，蘇凈airtech；高壓滅菌鍋ldzx-30kb，上海三申醫(yī)療器械有限公司；恒溫培養(yǎng)箱jb202，上海錦屏儀器儀表有限公司；無(wú)菌過(guò)濾裝置250ml，美國(guó)nalgene公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋hh-2，金壇市富華儀器有限公司；hitachiu-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；eppendorftgl-168高速臺(tái)式離心機(jī)；olympusbx50型光學(xué)顯微鏡；olympusbx50型攝像系統(tǒng)；722型分光光度計(jì)；厭氧罐(bblgaspark)；olympuspm-20型攝像系統(tǒng)；250m1聚丙烯離心管、(gilson)、涂菌平皿為國(guó)產(chǎn)；巴斯德吸管、吸管、微量加樣器8道排槍，eppendorf公司。

主要實(shí)驗(yàn)材料：耐久腸球菌cr-29，腸膜明串株菌sr-19，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，編號(hào)分別為cgmcc編號(hào)11870、和cgmcc編號(hào)11869。

保加利亞乳桿菌，嗜酸乳桿菌來(lái)自長(zhǎng)春中俄科技園中俄生物工程與技術(shù)聯(lián)合研發(fā)中心；青春雙歧桿菌來(lái)自俄羅斯莫斯科大學(xué)；糞腸球菌f-3由俄羅斯圣彼得堡國(guó)立大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)療技術(shù)系提供。腸道沙門氏菌(salmonellaenterica)、福氏志賀氏菌(shigellaflexneri)、單核細(xì)胞增生性李斯特菌(listeriamonocytonenes)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、艱難梭菌(clostridiumdifficile)、大腸桿菌(escherichiacoli)由吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院提供。

本發(fā)明中致病菌拮抗劑和益生菌共生體含義一致。

附圖說(shuō)明：

圖1為sr-19和cr-29益生菌共生體發(fā)酵上清液與福氏志賀氏菌共同培養(yǎng)下(5ml,37℃)電子顯微鏡照片；

1)為對(duì)照,2)為上清液作用30min后致病菌細(xì)胞出現(xiàn)膨脹與胞膜穿孔的現(xiàn)象3)60mi后細(xì)胞裂解的情況。

圖2為sr-19和cr-29益生菌共生體發(fā)酵上清液與金色葡萄球菌共同培養(yǎng)下(5ml,37℃，4):60min；5):90min；6):30min)電子顯微鏡照片；

1),2)，3)為對(duì)照組；4)，5)，6)為實(shí)驗(yàn)組。4)，5)為透射電子顯微鏡下基色葡萄球菌菌體破碎的情況；6)為掃描電子顯微鏡圖像，顯示受測(cè)菌體的表面出現(xiàn)凹凸不平的現(xiàn)象，疑似被益生菌細(xì)菌素作用下裂解的結(jié)果。

圖3為4℃下不同益生菌的保藏活菌數(shù)變化情況；

圖4為20℃下不同益生菌的保藏活菌數(shù)變化情況；

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但足本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1益生菌共生體對(duì)代表性腸道致病菌的體外抑制測(cè)定

通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑的大小測(cè)量單一益生菌菌體與益生菌共生體體外對(duì)代表致病菌的體外抑制程度。體外實(shí)驗(yàn)：?jiǎn)我灰嫔w與益生菌共生菌對(duì)腸道沙門氏菌(salmonellaenterica)、福氏志賀氏菌(shigellaflexneri)、單核細(xì)胞增生性李斯特菌(listeriamonocytonenes)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、艱難梭菌(clostridiumdifficile)、大腸桿菌(escherichiacoli)的抑制效果，具體方法如下：

1)分別將活化好的單一益生菌菌體與益生菌共生體點(diǎn)接到mrs培養(yǎng)基平板上，厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，然后將活化好的腸道沙門氏菌(salmonellaenterica)1％接菌量接菌到50℃左右液狀的bs瓊脂培養(yǎng)基，并分別將培養(yǎng)基快速均勻的倒在已培養(yǎng)益生菌的平板上，37℃倒置培養(yǎng)24小時(shí)。

2)分別將活化好的單一益生菌菌體與益生菌共生體點(diǎn)接到mrs培養(yǎng)基平板上，厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，然后將活化好的福氏志賀氏菌(shigellaflexneri)1％接菌量接菌到50℃左右液狀的lb培養(yǎng)基，并分別將培養(yǎng)基快速均勻的倒在已培養(yǎng)益生菌的平板上，37℃倒置培養(yǎng)24小時(shí)。

3)分別將活化好的單一益生菌菌體與益生菌共生體點(diǎn)接到mrs培養(yǎng)基平板上，厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，然后將活化好的單核細(xì)胞增生性李斯特菌(listeriamonocytonenes)1％接菌量接菌到50℃左右液狀的lb培養(yǎng)基，并分別將培養(yǎng)基快速均勻的倒在已培養(yǎng)益生菌的平板上，37℃倒置培養(yǎng)24-36小時(shí)。

4)分別將活化好的單一益生菌菌體與益生菌共生體點(diǎn)接到mrs培養(yǎng)基平板上，厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，然后將活化好的金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)1％接菌量接菌到50℃左右液狀的tsp瓊脂培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基快速均勻的倒在已培養(yǎng)益生菌菌的平板上，37℃倒置培養(yǎng)24-30小時(shí)。

5)分別將活化好的單一益生菌菌體與益生菌共生體點(diǎn)接到mrs培養(yǎng)基平板上，厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，然后將活化好的艱難梭菌1％接菌量接菌到50℃左右液狀的bhi瓊脂培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基快速均勻的倒在已培養(yǎng)益生菌的平板上，37℃倒置厭氧培養(yǎng)24-48小時(shí)。

6)分別將活化好的單一益生菌菌體與益生菌共生體點(diǎn)接到mrs培養(yǎng)基平板上，厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，然后將活化好的大腸桿菌1％接菌量接菌到50℃左右液狀的紫紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基快速均勻的倒在已培養(yǎng)乳酸菌的平板上，37℃倒置培養(yǎng)18-24小時(shí)。

通過(guò)測(cè)量各個(gè)平板上點(diǎn)種的益生菌的抑菌圈直徑，比較單一益生菌菌體與益生菌共生體的抑菌能力大小。結(jié)果見(jiàn)表1

表1益生菌的抑菌圈直徑

在pointagar測(cè)試中單一益生菌菌株對(duì)腸道沙門氏菌、福氏志賀氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌、大腸桿菌均顯示一定的抑制作用，而益生菌共生體的抑菌能力明顯高于單一菌株，對(duì)艱難梭菌的抑菌直徑達(dá)11mm,對(duì)大腸桿菌直徑高達(dá)17mm,并且兩個(gè)益生菌菌株表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌協(xié)同作用，其協(xié)同機(jī)理有待進(jìn)一步研究。這可能是營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)生h202以及細(xì)菌素等多方面綜合作用的結(jié)果。

益生菌共生體對(duì)致病菌的抑菌機(jī)理的初步研究

利用掃描電子顯微鏡(sem)和透射電子顯微鏡(tem)研究益生菌共生體對(duì)上述致病菌的抑菌機(jī)理。從而進(jìn)一步確認(rèn)益生菌共生體對(duì)致病菌的抑菌有效性；通過(guò)電鏡照片從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上研究益生菌的代謝產(chǎn)物拮抗致病菌的抑菌機(jī)理。具體方法如下：

1)益生菌上清液的制備:分別取單一益生菌sr-19、cr-29與及共生體的培養(yǎng)24h后的菌液，在無(wú)菌條件下離心(8000r/min,40c,20min)。收集離心上清液于無(wú)菌的4.0mlep管中，40c冰箱保存?zhèn)溆?。沉淀?.5ml生理鹽水洗脫，收集在無(wú)菌的1.5mlep管中，并保藏于40c冰箱備用。

2)實(shí)驗(yàn)方法：將腸道沙門氏菌(salmonellaenterica)、福氏志賀氏菌(shigellaflexneri)、單核細(xì)胞增生性李斯特菌(listeriamonocytonenes)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、艱難梭菌(clostridiumdifficile)、大腸桿菌(escherichiacoli)分別在對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基與生長(zhǎng)條件下平板培養(yǎng)出菌落，在無(wú)菌箱內(nèi)挑取于1ml的無(wú)菌pbs內(nèi)，充分震蕩成菌體渾濁液，而后分別加入4ml上述益生菌上清液于對(duì)應(yīng)致病菌的有氧或厭氧條件下混合培養(yǎng)(370c，30min,60min,90min,120min)后，按照掃描電子顯微鏡(sem)和透射電子顯微鏡(tem)的要求制作重金屬與切片標(biāo)本，進(jìn)行電鏡觀察。

表2在益生菌上清液作用下致病菌細(xì)胞裂解(或凋亡)的比例

注：數(shù)值為單位電鏡視野照片內(nèi)致病菌細(xì)胞裂解(或凋亡)占所有細(xì)胞的百分比(p<0.05),每組為50張照片。

通過(guò)電子顯微鏡研究抑菌細(xì)胞形態(tài)可知，sr-19和cr-29益生菌共生體上清液與其單一益生菌的發(fā)酵上清液相比具有更強(qiáng)的抑菌活性，這與之前的pointagar法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。通過(guò)對(duì)大量的不同致病菌的抑菌電鏡照片(>400張)研究表明，受測(cè)的致病菌細(xì)胞有明顯的胞膜穿孔，細(xì)胞液外溢的現(xiàn)象，在很大程度上，這是益生菌上清液中細(xì)菌素的作用結(jié)果，但需利用不同方法進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

實(shí)施例2

本混合體微生物能夠在胃酸中、堿環(huán)境和人體腸酶中保持生命活性；

單菌株與雙聯(lián)共生體菌株外耐受性檢測(cè)方法與結(jié)果

益生菌必須是活體進(jìn)入并定植于腸道才可發(fā)揮其益生功能，外界溫度與去存放時(shí)間對(duì)益生菌的活性有直接的影響，并且其進(jìn)入腸道則必須通過(guò)口腔，經(jīng)過(guò)胃后到達(dá)腸道，其中胃中的胃酸及胃蛋白酶和小腸中膽鹽及胰蛋白酶都具有抗菌作用，會(huì)影響活菌數(shù)目，從而影響益生菌發(fā)揮其效用。因此考量外界因素對(duì)菌活的影響與通過(guò)消化道且存活并定植于腸道是益生菌的篩選重要標(biāo)準(zhǔn)之一。

1.不同溫度下共生體益生菌比人工混合益生菌的保藏特性比較

將已活化好的四種株益生菌以10％接種量分別接入5ml滅菌的mrsbroth培養(yǎng)基中，分別將腸膜明串株菌sr-19與耐久腸球菌cr-29及混合接種液置于42℃水夾套恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，將保加利亞乳桿菌與嗜酸乳桿菌及其混合接種液置于38℃水夾套恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，分別放入冰箱4℃和恒溫箱20℃保存，每組重復(fù)三個(gè)平行，分別在第0,2,4,7,10,14,21.28d進(jìn)行活菌平板計(jì)數(shù)。

由于不同的益生菌遺傳因素不同，即使處于相同環(huán)境中的不同產(chǎn)品存放相同時(shí)間，活菌數(shù)也不同。4℃是常用的保藏食品的溫度，20℃是一般的室內(nèi)溫度，由圖1、圖2可以看出，三株菌在4℃下和20℃保藏期間活菌數(shù)是有一定程度的下降，這可能是由于保藏時(shí)培養(yǎng)基含有的代謝產(chǎn)物的抑制作用及在酸性環(huán)境下的“酸損傷”作用等所造成的。但4℃下總體上這四株菌在28天后單株或混合的情況下仍然有很高的存活率，其活菌數(shù)仍高達(dá)10⁸cfu/ml左右，其中腸膜明串株菌sr-19與耐久腸球菌cr-29的共生體混合液的活菌降低最少，28天后菌的存活仍在10⁹cfu/ml以上，并且20℃下存放28天亦含有10⁷cfu/ml活菌量，顯示了該益生菌共生體極強(qiáng)的穩(wěn)定特性。

2.耐胃酸能力測(cè)定

對(duì)于調(diào)節(jié)腸道菌群的乳酸菌而言，必須進(jìn)入人的腸道才能發(fā)揮其療效功能，然而，在從口腔到腸道的過(guò)程中，乳酸菌必須經(jīng)過(guò)人體的胃，因此研究乳酸菌在胃液中的耐受性就十分必要。在空腹時(shí)，胃液的ph值是1.5至1.8之間，在進(jìn)食過(guò)程中，由于食物成分、進(jìn)食量以及個(gè)體之間的差異，一般胃液的ph值在1.8至5.0之間波動(dòng)，通常在3.0左右，食用酸性食品可達(dá)1.5，食用堿性食品時(shí)可達(dá)4至5；此外，不同食物形態(tài)也影響其在胃中的消化時(shí)間，流體食物通常在胃中的平均消化時(shí)間是1.5-2h。

實(shí)驗(yàn)采用sr-19與cr-29的單一菌株與其組成的益生菌共生體在不同ph值的人工胃液中，在不同時(shí)間測(cè)定其活菌數(shù)。

(1)人造胃液的配制。取濃度為lmol/l的稀鹽酸，加水稀釋，將ph值分別調(diào)至1.5,2.0,2.5,3.5，每100ml液體中加入1g胃蛋白酶(酶活力453u/mg),混勻，用0.20μm的無(wú)菌濾器過(guò)濾待用。

(2)實(shí)驗(yàn)方法:將活化好的三種益生菌液以1％接種量分別接入上述不同ph值的人造胃液中，37℃恒溫水浴培養(yǎng)，在0,0.5,1,1.5,2,3h進(jìn)行活菌平板計(jì)數(shù)。每組重復(fù)三個(gè)平行，求代數(shù)平均值。

單一益生菌與其組成的益生菌共生體在不同ph下人造胃液下的存活狀況結(jié)果如下表所示:

表3不同ph值下單一菌體與共生體的人造胃液實(shí)驗(yàn)結(jié)果(lgcfu/ml)

結(jié)果表明:在ph＝1.5時(shí)，受測(cè)的單一菌株和兩種菌株組成共生體均不能存活；在ph＝2.0時(shí)，三株乳桿菌均可以存活，但在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)的存活菌數(shù)明顯高于較長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)的存活菌數(shù)；在ph值為2.5及以上時(shí)，人造胃液對(duì)單一菌株的有一定的影響，但對(duì)sr-19與cr-29菌株組成益生菌共生體的影響極小，這顯示該共生體的良好耐酸穩(wěn)定性。在ph值2.5以上時(shí)有的菌甚至出現(xiàn)了生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)椋?)人工胃液在該ph值下幾乎對(duì)該菌沒(méi)有影響，2)1％的接菌量帶進(jìn)了一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；3)所取菌種是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)旺盛的菌。

以上結(jié)果表明，共生體的耐酸能力強(qiáng)于單一菌株，共生體菌株具有協(xié)同作用。

3.耐腸液能力測(cè)定

在小腸內(nèi)生存著大量的微生物，不僅數(shù)量大，而且種類繁多，也是各種口服益生菌發(fā)揮作用的場(chǎng)所，無(wú)論怎樣，保持一定數(shù)量的存活菌數(shù)是其發(fā)揮作用的先決條件。小腸液的作用、小腸的蠕動(dòng)等是影響益生菌數(shù)量的因素。小腸液的ph值約為7.6，食物通過(guò)小腸的平均時(shí)間約為1.5h。

實(shí)驗(yàn)采用三株菌在不同ph值的人工腸液中，37℃恒溫水浴培養(yǎng)在不同時(shí)間測(cè)定其活菌數(shù)。

(1)人造腸液的配制:取磷酸二氫鉀0.8g，加水500ml溶解，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4％的氫氧化鈉溶液調(diào)ph值至6.8，加水稀釋至1000ml，每100ml液體中加入1g胰蛋白酶(酶活力11800u/mg)，混勻，用0.20μm的無(wú)菌濾器過(guò)濾待用。

(2)實(shí)驗(yàn)方法:將活化好的三種益生菌液以1％接種量分別接入上述不同ph值的人造腸液中，37℃恒溫水浴培養(yǎng)，在0,0.5,1,1.5,2,3h進(jìn)行活菌平板計(jì)數(shù)。每組重復(fù)三個(gè)平行，求代數(shù)平均值。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件得到結(jié)果如下表所示:

表4單一菌體與其共生體在不同時(shí)間的人造腸液耐受性試驗(yàn)結(jié)果(lg(cfu/ml))

結(jié)果表明：?jiǎn)我痪w在人工腸液中均有較高的存活數(shù)，并且對(duì)單一菌體組成的共生體來(lái)說(shuō)，人造腸液在時(shí)間變化過(guò)程中幾乎對(duì)活菌數(shù)沒(méi)有影響。因此，在模擬人體腸液環(huán)境下，sr-19與cr-29菌株組成益生菌共生體具有優(yōu)良的耐受性能。

以上結(jié)果表明，共生體的耐腸液能力強(qiáng)于單一菌株，共生體菌株具有協(xié)同作用。

4.耐膽鹽能力測(cè)定

膽汁耐受力是乳桿菌重要的特征之一，乳桿菌要到達(dá)并定殖于人的腸道，必須對(duì)膽鹽有一定的耐受性，其耐受力的高低意味著該菌株在腸道中的存活能力的高低。人體小腸中膽汁鹽含量在0.03％—0.3％范圍內(nèi)波動(dòng)。

在mrsbroth培養(yǎng)基中加入豬膽酸鹽，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.15％,0.2％,0.25％,0.3％,0.35％,0.4％，分裝于離心試管中，每支3ml，每個(gè)濃度5支，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4％溴鉀酚紫為指示劑。在121℃滅菌15min。將已活化好的三種益生菌液以1％接種量接入上述已處理好的培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，每組重復(fù)三個(gè)平行，觀察其顏色的變化。

表5單一菌體與共生菌體在不同濃度膽鹽中的生長(zhǎng)情況

注:“-”不生長(zhǎng)；“+”生長(zhǎng)；“++”生長(zhǎng)良好；“+++”生長(zhǎng)非常好

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了單一與共生菌體在不同濃度牛膽汁鹽中的生長(zhǎng)情況，可以看出，單一菌體具有優(yōu)良的耐膽汁酸能力，而共生菌體耐受膽鹽能力極強(qiáng)，在0.2％時(shí)可生長(zhǎng)旺盛，在膽鹽濃度0.4％時(shí)仍可以生長(zhǎng)，sr-19和cr-29能生長(zhǎng)的最高膽鹽濃度為0.25％和0.3％。

以上結(jié)果表明，共生體的耐膽汁能力強(qiáng)于單一菌株，共生體菌株具有協(xié)同作用。

盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。