本發(fā)明涉及一種從藻體表面去除多糖和外源微生物的方法，屬于藻體分離領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：藻體和微生物之間存在密切關(guān)系，微生物不僅附著在藻體的表面，還寄身于藻體的細(xì)胞內(nèi)部。對于具有粘附性的外源微生物，藻類的表面為其生活和附著提供了生存條件，藻類分泌的糖類、脂類等代謝產(chǎn)物又能被細(xì)菌吸收利用，給細(xì)菌的生存提供營養(yǎng)。藻體脫落的部分也可以被外源微生物降解。反之，外源微生物能夠產(chǎn)生一些胞外產(chǎn)物，如生長因子、維生素等，為藻類的生長發(fā)育做出貢獻(xiàn)。因此，藻類與外生細(xì)菌之間既相互利用又拮抗，二者通過相互作用進(jìn)行雙向選擇。關(guān)于藻體和細(xì)菌之間的復(fù)雜關(guān)系，目前研究的主要方向有(a)藻類與藻際環(huán)境中微生物的相互關(guān)系：miranda等人在2013年的一篇研究中做了全面的研究并提出一個(gè)猜想：微生物產(chǎn)生藻類，以紫菜屬物種為研究對象，并推測和紫菜共存的一些細(xì)菌可能對于維持其形態(tài)結(jié)構(gòu)和一些營養(yǎng)物質(zhì)的生成存在不可或缺的作用。同時(shí)也有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)在綠藻和褐藻中也存在外源微生物影響藻體形態(tài)的現(xiàn)象。(b)藻類附生菌所產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)：許多學(xué)者致力于藻體附著外源微生物活性物質(zhì)如毒素、抑菌物質(zhì)和抗生素等等。（c）藻類附生菌的種群組成：為了研究藻類附生種群的類型，利用平板分離和16s擴(kuò)增鑒定種群多樣性（4）無菌藻種的獲得：通過添加抗生素來抑制外源微生物的生長而獲得無菌材料，或者是通過反復(fù)沖洗獲得無菌材料。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，基因組學(xué)的研究逐漸成為熱門領(lǐng)域，然而對于海洋生物來說，外源微生物的存在成為制約其基因組學(xué)發(fā)展的一大障礙。許多學(xué)者致力于藻類無菌化的培養(yǎng)，然而比較成功的技術(shù)手段尚未見到相關(guān)報(bào)道。在藻類無外源微生物dna污染的高質(zhì)量dna制備過程中，仍然存在很大的問題：1、目前的研究來看，藻類的dna樣本是一個(gè)高度復(fù)雜的樣本，即提取的dna中存在藻體本身的dna同時(shí)也存在大量外源微生物的dna，在基因組的拼接組裝過程中很難利用生物信息學(xué)技術(shù)將外源微生物的dna片段徹底去除，因此會影響基因組拼接組裝的準(zhǔn)確性，從而影響后續(xù)基因組特性的分析；2、藻類無菌材料的獲得和維持是非常困難的，即使加入抗生素，也很難去除所含的細(xì)菌，推測某些細(xì)菌為其內(nèi)共生微生物?，F(xiàn)有技術(shù)中對于無菌藻株的獲得和維持仍然存在很大的問題。例如在利用抗生素抑制外源微生物的污染，有的物種長期加入抗生素就會產(chǎn)生抗性或者是不同的物種需要添加不同的抗生素類型。即使獲得無菌的藻株，在無菌培養(yǎng)的過程中也很難維持。也有研究者利用超聲波的方法反復(fù)沖洗樣品，但這個(gè)技術(shù)的可重復(fù)性和操作性比較差。即使是除菌效果的檢測，單純的依靠平板培養(yǎng)也是不可靠的，因?yàn)?0%的細(xì)菌是不可培養(yǎng)的。因此在目前藻類基因組項(xiàng)目的實(shí)施過程中，我們可以看到，一些學(xué)者是加入抗生素處理，而更多的是在獲得基因組信息以后，從序列入手，包括和已有的外源微生物進(jìn)行比對，根據(jù)相似性去除外源微生物的序列?；蛘呤歉鶕?jù)測序的覆蓋度來剔除外源微生物的序列。這兩種技術(shù)手段都存在弊端，有可能剔除不干凈或者是將自己本身的基因組序列剔除掉。因此，在進(jìn)行項(xiàng)目之前，就應(yīng)該尋找一種從材料上解決外源微生物污染的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明一種從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法，該方法結(jié)合藻類的特性，探索出一種降低藻類外源微生物污染的方法，其主要包括振蕩前準(zhǔn)備預(yù)處理、機(jī)械振蕩、藻體孵育三個(gè)步驟，其不僅可以去除粘附在藻體表面的多糖，而且可以有效防止藻體表面附著的外源微生物的污染?？傊ㄟ^機(jī)械振蕩的方法，可以有效的解決叢藻類表面多糖和細(xì)菌的問題，促進(jìn)藻類基因組工作的開展。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)效果：一種從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法，其具體包括下述步驟：1）振蕩前準(zhǔn)備：向研磨管內(nèi)加入孔徑為25-50目的石英砂0.05-0.15質(zhì)量份，鋼珠0.05-0.15質(zhì)量份、玻璃珠0.05-0.15份，然后在再向研磨管中加入0.1質(zhì)量份的藻體，向其中加入1體積份的無菌海水，混合均勻得到振蕩材料；2）機(jī)械振蕩：將載有藻體的振蕩材料在振蕩儀上進(jìn)行機(jī)械振蕩，控制振蕩轉(zhuǎn)速在5000-6000rpm之間，振蕩時(shí)間為5-30s；3）藻體孵育：振蕩完成后將材料取出置于0.05%吐溫80緩沖液中孵育4-8min，使用無菌海水進(jìn)行沖洗3-4次，然后將藻體置于無菌海水中，使用紗布過濾去除藻體表面的粘液，即可得到脫除多糖和外源微生物的藻體。上述所述的從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法中，所述步驟1中的振蕩材料中包括25-50目的石英砂0.1質(zhì)量份，鋼珠0.1質(zhì)量份、玻璃珠0.1份。上述所述的從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法中，所述藻體孵育步驟中材料在0.05%吐溫80緩沖液中孵育時(shí)間為5min。上述所述的從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法中，所述步驟2中的振蕩速度為6500rpm，振蕩時(shí)間為20s。藻體在經(jīng)過不同介質(zhì)和強(qiáng)度的振蕩以后，由于藻體收到巨大的機(jī)械力很有可能造成細(xì)胞破裂，綜合藻體損失率、藻細(xì)胞成活率以及多糖及微生物的去除率可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明實(shí)施例1對應(yīng)的藻體損失率最低，藻細(xì)胞成活率以及多糖及微生物的去除率最高，為本發(fā)明的最佳實(shí)施例，即本發(fā)明所述工藝的最佳處理?xiàng)l件為：步驟1中的振蕩材料中包括25-50目的石英砂0.1質(zhì)量份，鋼珠0.1質(zhì)量份、玻璃珠0.1份；藻體孵育步驟中材料在0.05%吐溫80緩沖液中孵育時(shí)間為5min；步驟2中的振蕩速度為6500rpm，振蕩時(shí)間為20s。本發(fā)明所述的從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法不僅可以去除粘附在藻體表面的多糖，而且可以有效防止藻體表面附著的外源微生物的污染?？傊?，通過機(jī)械振蕩的方法，可以有效的解決叢藻類表面多糖和細(xì)菌的問題，促進(jìn)藻類基因組工作的開展。附圖說明圖1為處理前后藻體表面附著細(xì)菌的掃描電鏡檢測情況，左圖為處理之前，右圖為處理之后,。圖2外源微生物去除之前藻體dna中g(shù)c含量與contig深度分布圖。圖3為外源微生物去除之后藻體dna中g(shù)c含量與contig深度分布圖。具體實(shí)施方式以下通過具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但所述領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解，所述實(shí)施例并不以任何方式限定本發(fā)明專利保護(hù)的范圍。實(shí)施例1本發(fā)明從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法一種從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法，其具體包括如下步驟：1）振蕩前準(zhǔn)備：稱取孔徑25-50目的0.1g石英砂、0.1g的鋼珠、0.1g的玻璃珠加進(jìn)研磨管；然后稱取0.1g藻體加進(jìn)研磨管，加入1ml無菌海水；2）機(jī)械振蕩：以上加入不同研磨介質(zhì)的材料通過不同的振蕩強(qiáng)度和時(shí)間進(jìn)行機(jī)械振蕩，轉(zhuǎn)速為500rpm的轉(zhuǎn)速，振蕩時(shí)間20s；振蕩完成以后，將材料從研磨管中取出放在培養(yǎng)皿中；3）藻體孵育：振蕩完成后將材料取出置于0.05%吐溫80緩沖液中孵育5min，使用無菌海水進(jìn)行沖洗3-4次，然后將藻體置于無菌海水中，使用紗布過濾去除藻體表面的粘液，即可得到脫除多糖和外源微生物的藻體。藻體在經(jīng)過不同介質(zhì)和強(qiáng)度的振蕩以后，由于藻體收到巨大的機(jī)械力，很有可能會造成細(xì)胞破裂，因此把藻體拿出來以后放在在0.05%吐溫80緩沖液中孵育以保持細(xì)胞的滲透壓穩(wěn)定，從而維持細(xì)胞的活性；進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)之前，應(yīng)該把藻體拿出來在比重為1.030的海水中初步?jīng)_洗3次，去除緩沖液的影響。研磨完以后的材料，可觀察到無菌海水的表面形成了一層粘液，這就表明已經(jīng)將藻體表面的多糖已經(jīng)剝離下來，同時(shí)也會將附著的細(xì)菌剝離下來。為了進(jìn)一步分開藻體和剝離下來的表面多糖，用滅菌海水在燒杯中充分沖洗材料，然后用紗布過濾去除，將藻體葉片留在紗布上，含有多糖和細(xì)菌的溶液被過濾掉，通過多次的反復(fù)沖洗和過濾，將藻體的剝離多糖（含細(xì)菌）徹底出去。為了驗(yàn)證本發(fā)明處理工藝對于表面附著多糖和微生物的處理效果，對處理前后的藻體表面的細(xì)菌和微生物進(jìn)行了驗(yàn)證。1.處理前后藻體表面附著細(xì)菌的掃描電鏡檢測圖1為處理前后藻體表面附著細(xì)菌的掃描電鏡檢測情況（左圖為處理之前，右圖為處理之后）。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，除菌之前藻體的表面會由于多糖的存在，附生細(xì)菌聚集在藻體表面形成一層菌膜。這些附著細(xì)菌在經(jīng)歷掃描電鏡樣品的制備過程中的多次清洗，也很難去除，因此證明這些細(xì)菌是牢固粘附在藻體的表面，如果用這樣的材料去進(jìn)行藻類基因組的研究，勢必會影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，藻體的表面由于振蕩作用和反復(fù)沖洗，藻體表面的菌膜已經(jīng)被全部剝離，只有藻體本身的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，說明藻體表面的細(xì)菌已經(jīng)得到很好的去除。2.利用高通量測序技術(shù)鑒定未處理前后藻體總dna成分鑒定為了進(jìn)一步驗(yàn)證外源微生物處理前后dna的復(fù)雜成分，我們采用ctab法提取基因組dna（未處理的材料），構(gòu)建了基因組文庫，并進(jìn)行高通量測序工作，圖2外源微生物去除之前藻體dna中g(shù)c含量與contig深度分布圖。從k-mer分布圖可以看出，k-mer個(gè)數(shù)與深度關(guān)系分布圖異常，自左向右出現(xiàn)多了峰圖。初步推斷該藻類樣品可能存在嚴(yán)重的外源微生物污染。構(gòu)建contig覆蓋度及gc含量的分布圖，結(jié)果顯示gc含量分布在20-80%之間，不符合該物種gc分布的特征；contig覆蓋度分為1-55,56-399，及400-600三個(gè)不同的區(qū)域，也是出現(xiàn)分布不集中的現(xiàn)象。將這三個(gè)不同的區(qū)域的contig與現(xiàn)有的ncbinucleotidedatabases數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對，結(jié)果顯示：覆蓋度在1-55區(qū)間及400-600區(qū)間內(nèi)的contig主要比對到海洋菌類（roseobacter，ruegeria,erythrobacter等）。覆蓋度在55-399區(qū)間內(nèi)的contig，主要比對到藻類序列以及兩種少量的海洋菌類(roseobacter，lacinutrix)。進(jìn)一步證明了藻類dna成分的復(fù)雜性。經(jīng)過機(jī)械振蕩以后同樣提取了總dna，進(jìn)行高通量測序。圖3為外源微生物去除之后藻體dna中g(shù)c含量與contig深度分布圖。結(jié)果顯示：contig深度和gc含量分布圖比較集中，證明dna的成分比較單一。且經(jīng)過和數(shù)據(jù)庫的比對，細(xì)菌的比例極低。說明通過本實(shí)驗(yàn)達(dá)到了降低藻類外源微生物污染的效果，樣品可以滿足下一步基因組工作的需求。實(shí)施例2-實(shí)施例8本發(fā)明從藻體表面脫除多糖和外源微生物的方法申請人發(fā)現(xiàn)，藻體在經(jīng)過不同介質(zhì)和強(qiáng)度的振蕩以后，由于藻體收到巨大的機(jī)械力，很有可能會造成細(xì)胞破裂，這顯著影響著后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)效果，為此有必要對本發(fā)明的工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。表1實(shí)施例2-實(shí)施例8所述處理工藝表2本發(fā)明所述方法對去除效果和藻體細(xì)胞成活率的影響藻體損失率（%）細(xì)胞成活率（%）多糖去除率（%）微生物去除率（%）實(shí)施例15.3195.398.799.4實(shí)施例28.6290.194.596.7實(shí)施例310.2686.793.698.1實(shí)施例48.1488.694.797.6實(shí)施例56.2392.495.396.3實(shí)施例69.1891.896.895.8實(shí)施例77.2490.497.896.9實(shí)施例85.8488.998.695.2由表2所述的處理結(jié)果來看，實(shí)施例1對應(yīng)的藻體損失率最低，藻細(xì)胞成活率以及多糖及微生物的去除率最高，為本發(fā)明的最佳實(shí)施例，即本發(fā)明所述工藝的最佳處理?xiàng)l件為：步驟1中的振蕩材料中包括25-50目的石英砂0.1質(zhì)量份，鋼珠0.1質(zhì)量份、玻璃珠0.1份；藻體孵育步驟中材料在0.05%吐溫80緩沖液中孵育時(shí)間為5min；步驟2中的振蕩速度為6500rpm，振蕩時(shí)間為20s。當(dāng)前第1頁12