本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年7月6日的、發(fā)明名稱為“真核細(xì)胞的培養(yǎng)方法”的中國(guó)專利申請(qǐng)201080039284.5(pct/us2010/041082)的分案申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2009年6月6日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)no.61/223,313號(hào)的權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)參考引用的形式并入本文。

本發(fā)明涉及在含碳酸氫鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)真核細(xì)胞的裝置和方法，所述培養(yǎng)基允許在不直接向該培養(yǎng)基中添加堿的情況下維持細(xì)胞培養(yǎng)物的ph。

背景技術(shù)：

用于細(xì)胞建庫(kù)、用于細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)例如重組蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)，受到細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)條件變化的妨礙。雖然不銹鋼生物反應(yīng)器常被用于細(xì)胞生產(chǎn)，然而一次性用品(disposables)越來(lái)越多的在生物制品的制造的所有階段中使用(rao等，2009)。在上游工藝中，相比不銹鋼制品，一次性的生物反應(yīng)器存在諸多的優(yōu)勢(shì)(從減少交叉污染到成本和時(shí)間的節(jié)省)。wavebioreactor^tm是在生物醫(yī)藥工業(yè)中用于重組蛋白生產(chǎn)的一次性上游技術(shù)的一個(gè)文獻(xiàn)充分記載的實(shí)例(cronin等，2007；haldankar等，2006；ling等，2003；ye等，2009)。

由singh(singh，1999)所開(kāi)發(fā)的wavebioreactor^tm系統(tǒng)包含預(yù)先消毒的、柔性的、一次性的培養(yǎng)室(cellbag^tm)，co2-和/或o2-空氣混合控制器，和用于搖動(dòng)和加熱cellbag^tm的氣動(dòng)控制平臺(tái)。由該平臺(tái)產(chǎn)生的搖擺(rock)運(yùn)動(dòng)在cellbag^tm中提供了混合和氣體傳遞。

wavebioreactor^tm系統(tǒng)可以進(jìn)一步裝備以提供在線ph和溶解氧(do)監(jiān)控以及實(shí)時(shí)反饋控制(mikola等，2007；tang等，2007)。然而，對(duì)額外設(shè)備的需求以及對(duì)專門(mén)設(shè)計(jì)的以容納ph和do探測(cè)器的袋子的需求，增加了運(yùn)營(yíng)成本和系統(tǒng)的復(fù)雜性。另外，在ph控制生物反應(yīng)器中為使培養(yǎng)物ph增加到規(guī)定的設(shè)定點(diǎn)所需要的堿加入，會(huì)增加培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度。取決于生物反應(yīng)器中摩爾滲透壓濃度增加的程度，在細(xì)胞增長(zhǎng)和存活力方面的相關(guān)衰減(dezengotita等，2002；zhu等，2005)可能抵消ph值控制的優(yōu)勢(shì)。另外，如果ph探測(cè)器發(fā)生故障，由此產(chǎn)生的ph值混亂可能改變細(xì)胞代謝并促進(jìn)細(xì)胞死亡(miller等，1988；osman等，2002)。

對(duì)于某些細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用來(lái)說(shuō)嚴(yán)格的ph值和do控制不是必須的，諸如，例如在小規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)如搖瓶和轉(zhuǎn)瓶中用于細(xì)胞的維持和擴(kuò)大的常規(guī)細(xì)胞傳代。然而，ph值和do的極值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和生存力是不利的(lin等，1993；link等，2004；miller等，1988；osman等2001)，并可影響產(chǎn)品質(zhì)量(restelli等2006；yoon等，2005)。因此，對(duì)于生物制品制造的全階段，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)條件保持一些控制是極其重要的。研究人員先前證明，在6.8-7.3的ph值范圍內(nèi)和在10-100％空氣飽和度的do值范圍內(nèi)的cho細(xì)胞培養(yǎng)是成功的(link等2004；restelli等2006；trummer等2006；yoon等2005)。

向常規(guī)生物反應(yīng)器增加功能，如實(shí)時(shí)ph監(jiān)測(cè)和do監(jiān)控控制，將顯著增加生物制品制造中細(xì)胞培養(yǎng)的成本和勞動(dòng)強(qiáng)度。另外，這些功能的失靈或者故障可導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)的不可接受的變動(dòng)和潛在的損失，這是非常耗費(fèi)時(shí)間和資源的。

因此，需要用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的改進(jìn)方法，該方法將無(wú)需引入強(qiáng)堿以及無(wú)需額外地進(jìn)行ph值和do的監(jiān)測(cè)和實(shí)時(shí)控制。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中無(wú)需加入堿即可維持ph值的裝置和方法。在含碳酸氫鹽的細(xì)胞培養(yǎng)基中，基于碳酸-碳酸氫鹽緩沖液平衡(反應(yīng)式1)：

co2+hoh<＝＝＝>h2co3<＝＝＝>h⁺+hco3^-

ph＝pk-log([co2]/[hco3-])，

培養(yǎng)基中co2的量將影響培養(yǎng)基的ph值。

因此，本發(fā)明利用這種關(guān)系，通過(guò)使用細(xì)胞培養(yǎng)體系中液相和氣相的動(dòng)態(tài)界面來(lái)增加或者減少溶解的co2濃度，無(wú)需添加強(qiáng)酸或者堿，調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)基的ph值。本發(fā)明提供了一種用于實(shí)現(xiàn)此調(diào)節(jié)的方法和用于實(shí)施該方法的裝置。

一般地，向本發(fā)明的裝置供給空氣、氧氣或者這些氣體的組合，以維持細(xì)胞培養(yǎng)物的溶解氧。通過(guò)向裝置的頂部空間提供氣體混合物(可以操控其組成和引入速度)，取決于液相和氣相之間不同的co2濃度，co2可以被加入細(xì)胞培養(yǎng)基也可以從中移除。從頂部空間除去co2將增加培養(yǎng)ph值，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的溶解co2會(huì)擴(kuò)散進(jìn)入到頂部空間中。相反，當(dāng)以高于培養(yǎng)基中的濃度向所述裝置添加co2時(shí)，co2將溶解到培養(yǎng)基中并且培養(yǎng)ph值將減小。本發(fā)明提供了一種允許co2轉(zhuǎn)移入和轉(zhuǎn)移出細(xì)胞培養(yǎng)物以維持培養(yǎng)ph值而無(wú)需添加堿的方法。

因此，本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的方法，包括在容器中在含碳酸氫鹽的培養(yǎng)液中培養(yǎng)真核細(xì)胞，其中所述容器具有封裝細(xì)胞培養(yǎng)物的壁和位于所述細(xì)胞培養(yǎng)物上方的氣相頂部空間。該容器還包括至少一個(gè)提供氣體自所述頂部空間進(jìn)出的口(port)。攪動(dòng)該容器以提供在液相和氣相之間的動(dòng)態(tài)界面?？梢员O(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的ph，并且可以通過(guò)所述的口向頂部空間供應(yīng)氣體，其中所述氣體包含一定量的co2，以隨著更多的co2溶解到細(xì)胞培養(yǎng)物中而降低ph，或者可以通過(guò)該口，從頂部空間排出累積的co2，以使細(xì)胞培養(yǎng)物ph值增加。由此ph值被維持在一個(gè)預(yù)定的范圍。

一般地，在細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解的co2的分壓維持在1至200mmhg的量。在某些實(shí)施方式中，溶解的co2的分壓為10至180mmhg。在某些實(shí)施方式中，溶解的co2的分壓為20至150mmhg。在某些實(shí)施方式中，溶解的co2的分壓為100至180mmhg。在某些實(shí)施方式中，溶解的co2的分壓為20至80mmhg。在某些實(shí)施方式中，溶解的co2的分壓為30至60mmhg。在某些實(shí)施方式中，溶解的co2的分壓為35至50mmhg。在某些實(shí)施方式中，溶解的co2的分壓為40mmhg。

頂部空間清除可以連續(xù)地或間歇地進(jìn)行。

一般地，do值維持在10％以上。在某些實(shí)施方式中，do值維持在20％以上。在某些實(shí)施方式中，do值維持在30％以上。在某些實(shí)施方式中，do值維持在40％以上。在某些實(shí)施方式中，do值維持在50％以上。在某些實(shí)施方式中，do值維持在60％以上。

在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是每分鐘0.001頂部空間體積(hvm)。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0.005hvm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0.01hvm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0.02hvm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0.05hvm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0.1hvm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0.2hvm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0.5hvm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0.9hvm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是1.0hvm。

真核細(xì)胞可以是脊椎動(dòng)物細(xì)胞，例如但不限于青蛙、兔、嚙齒動(dòng)物、綿羊、山羊、狗、貓、牛、馬、豬、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人類的細(xì)胞。

該方法可以在具有硬的或者可塑的壁的容器中進(jìn)行，例如塑料容器或者一次性培養(yǎng)袋。

所述的容器可以通過(guò)任何能夠在容器中提供液相和氣相之間的動(dòng)態(tài)界面的工具來(lái)攪動(dòng)。這種攪動(dòng)(agitation)可以是例如搖擺(rocking)、定軌運(yùn)動(dòng)(orbitalmotion)、八字形運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)、振蕩(shaking)等。

在某些實(shí)施方式中，攪動(dòng)通過(guò)搖擺來(lái)實(shí)現(xiàn)。搖擺的速度和角度可以調(diào)整以達(dá)到所需的攪動(dòng)。在某些實(shí)施方式中，搖擺的角度是20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、或者1°。在某些實(shí)施方式中，搖擺的角度是6-16°之間。在某些實(shí)施方式中，搖擺的角度是在7-16°之間。在某些實(shí)施方式中，搖擺的角度是在8-12°之間。

在某些實(shí)施方式中，搖擺速度是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40rpm。在某些實(shí)施方式中，搖擺速度是在19-25rpm之間。在某些實(shí)施方式中，搖擺速度是在20-24rpm之間。在某些實(shí)施方式中，搖擺速度是在21-23rpm之間。

所述方法可以在包含允許氣體進(jìn)出培養(yǎng)物的頂部空間的單個(gè)口的容器中進(jìn)行?；蛘?，所述容器可以包含多數(shù)個(gè)進(jìn)出口。

培養(yǎng)物的ph值可以連續(xù)地或者間歇性地監(jiān)測(cè)，可以將氣體注入到頂部空間，如此提供在頂部空間中的氣體的co2水平，以增加或減少培養(yǎng)物液相中的溶解co2的濃度，從而將液相的ph值調(diào)整到預(yù)定值。

在一個(gè)備選實(shí)施方式中，所述的方法可以包括步驟：通過(guò)培養(yǎng)基進(jìn)口，將新鮮的培養(yǎng)基灌注到細(xì)胞培養(yǎng)物中。所述新鮮的培養(yǎng)基具有在加入后能調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)物的總ph的ph值，由此通過(guò)新鮮培養(yǎng)基的ph值，部分地將細(xì)胞培養(yǎng)物維持在預(yù)定ph值范圍。在培養(yǎng)方法中使用具有預(yù)定ph值的新鮮培養(yǎng)基來(lái)調(diào)整ph值是有幫助的，但是還不足以完全控制ph值。

所述的方法可以適應(yīng)于任何尺寸的培養(yǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述的方法在商業(yè)可得的一次性生物反應(yīng)袋中進(jìn)行。可用容積500ml，1l，2l，10l，20l，50l，100l，200l，500l和1000l的該生物反應(yīng)袋。

培養(yǎng)的多個(gè)參數(shù)可以被監(jiān)測(cè)和控制。參數(shù)可以通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行計(jì)算，在自動(dòng)化過(guò)程中控制?？梢詥为?dú)或者組合控制的一些參數(shù)，包括但不限于，氣體流量、ph值、溶解的co2濃度、溫度和攪動(dòng)。

本發(fā)明還提供了實(shí)施本發(fā)明方法的裝置。

附圖簡(jiǎn)介

圖1顯示本發(fā)明裝置的一個(gè)例子，該裝置包括灌注過(guò)濾器。所述裝置包括氣體入口和氣體出口、用于向培養(yǎng)物提供新鮮培養(yǎng)基的口、用于排出用過(guò)的培養(yǎng)基的灌注過(guò)濾器、搖擺板和基部。搖擺運(yùn)動(dòng)允許攪動(dòng)以提供在培養(yǎng)基內(nèi)和外有效的o2和co2傳遞。

圖2顯示用于測(cè)量在wavebioreactor^tm中的氧氣傳遞的無(wú)細(xì)胞研究。(圖a)在恒定的0.2l/min空氣流速下?lián)u擺速度和搖擺角度對(duì)kla的影響；(圖b)搖擺速度、搖擺角度和空氣流速對(duì)kla的影響；(圖c)對(duì)于不同的搖擺角度、搖擺速度和和恒定的0.2l/min(這里也被稱為lpm)氣體流速的原始do數(shù)據(jù)；(圖d)對(duì)于兩個(gè)的不同搖擺設(shè)定點(diǎn)，以不同的氣體流速得到的原始do時(shí)間-進(jìn)程數(shù)據(jù)。

圖3顯示：為評(píng)估在wavebioreactor^tm中co2剝離(stripping)速度進(jìn)行的無(wú)細(xì)胞研究。(圖a)；在恒定的氣體流速0.2lpm下不同搖擺角度和搖擺速度時(shí)原始ph值上升數(shù)據(jù)；(圖b)不同氣體流速下兩個(gè)不同搖擺設(shè)定點(diǎn)的原始ph值上升時(shí)間-進(jìn)程數(shù)據(jù)。(圖c)對(duì)于圖a所示的不同搖擺條件，計(jì)算的ph值變化速度；(圖d)對(duì)于圖b所示的不同搖擺條件和不同氣體流速，計(jì)算的ph值變化速度。實(shí)心條是頭5分鐘的ph值變化速度，空心條是計(jì)算出的下面55分鐘的ph值變化速度。

圖4顯示：對(duì)于wavebioreactor^tm分批培養(yǎng)，(圖a)vcc，(圖b)離線ph值，(圖c)離線pco2，以及(圖d)離線do曲線。工藝條件在下面表2中概述。對(duì)于(ⅰ)生產(chǎn)mabb的細(xì)胞系只評(píng)估了接種階段，而對(duì)于(ⅱ)生產(chǎn)mabc的細(xì)胞系則評(píng)估了接種和規(guī)模放大階段(在此期間，工作體積從6l增加到20l)。在每個(gè)階段，在第一天泵入到頂部空間的空氣以8％(v/v)、在第二天以5％(v/v)、其后以2％(v/v)補(bǔ)充了co2。

圖5顯示：對(duì)于wavebioreactor^tm灌流培養(yǎng)，使用生產(chǎn)maba的細(xì)胞系，在非優(yōu)化條件下運(yùn)行，(圖a)vcc、(圖b)培養(yǎng)物存活力、(圖c)離線ph，以及(圖d)do濃度。頭6天細(xì)胞以分批方式培養(yǎng)，隨后以灌流模式培養(yǎng)。在分批培養(yǎng)期間，cellbag^tm中的工作容積首先用6l培養(yǎng)物接種，第3天，通過(guò)添加新鮮的培養(yǎng)基，將此培養(yǎng)物體積增加到25l。在灌流培養(yǎng)期間，以每天1體積的灌注速度，將培養(yǎng)體積維持在25l。對(duì)于這組實(shí)驗(yàn)，搖擺速度18rpm，搖擺角度是8度，而進(jìn)入到頂部空間的空氣流速是0.2l/min。對(duì)于整個(gè)培養(yǎng)持續(xù)期間，用5％co2(v/v)補(bǔ)充此空氣。

圖6顯示：分批(0-6天)/灌流(6-14天)過(guò)程的細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)曲線和ph曲線。(圖a)用％pcv表示的收集細(xì)胞體積(packedcellvolume)；(圖b)細(xì)胞生活力；(圖c)ph值曲線；(圖d)由vicell^tmas測(cè)量的以活細(xì)胞數(shù)(vcc)表示的細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖7顯示：來(lái)自不同的頂部空間清除速率(hvm)的培養(yǎng)性能。(圖a)顯示：以一步增加氣流來(lái)實(shí)現(xiàn)頂部空間清除速率增加((◆)為0.1hvm和(-▲-)為0.02hvm)的2個(gè)實(shí)驗(yàn)。另一種頂部空間清除速率策略是在第10和11天的多步驟增加(0.007hvm至0.013hvm至0.02hvm)(-■-)。(圖b)通過(guò)nova400測(cè)量的溶解co2分壓。

圖8顯示：對(duì)于六種不同細(xì)胞系——每一種生產(chǎn)一種不同的mab，使用優(yōu)化工藝進(jìn)行wavebioreactor^tm培養(yǎng)，(圖a)vcc、(圖b)培養(yǎng)物生活力、(圖c)離線ph以及(圖d)do。在6l接種階段，培養(yǎng)物以21rpm搖擺，并且進(jìn)入到頂部空間的空氣流速是0.2l/min。第一天以8％(v/v)，第二天以5％(v/v)，隨后以2％(v/v)，在該空氣中補(bǔ)充co2。在20l放大階段(第3-6天)，重復(fù)該空氣流方式。在20l灌流模式培養(yǎng)期間(自第6天起)，進(jìn)入頂部空間的空氣流速維持在0.6l/min，無(wú)co2補(bǔ)充，而在進(jìn)口氣體中o2比空氣的混合在第8天由0％(v/v)增加到30％(v/v)，并且在剩余的培養(yǎng)期間維持在30％(v/v)。20l分批和灌流培養(yǎng)以23rpm搖擺。所有培養(yǎng)的搖擺角度恒定在10°。

圖9顯示：在wavebioreactor^tm(●)和攪拌釜生物反應(yīng)器(□)中生產(chǎn)mabe的細(xì)胞系的平行培養(yǎng)物的(圖a)vcc、(圖b)生活力、(圖c)離線ph以及(圖d)離線do。

發(fā)明詳述

本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知很多用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的方案和方法、以及用于該培養(yǎng)的許多培養(yǎng)基。在文獻(xiàn)和教科書(shū)中描述了這樣的方案和培養(yǎng)基，如動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，一種實(shí)用方法，第2版，rickwood,d.和hames,b.d.編著，牛津大學(xué)出版社，紐約(1992)。一般的使用方法也可以在互聯(lián)網(wǎng)上得到，如：protocol-online.org/prot/cell_biology/cell_culture。細(xì)胞培養(yǎng)基也可以從各種熟知的來(lái)源購(gòu)買(mǎi)獲得。這里引用的所有文獻(xiàn)以參考的形式特此并入。

定義

本文述及或提及的一般細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以及工藝是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知、和慣常以常規(guī)方法進(jìn)行使用的。如果適用的話，涉及使用商購(gòu)試劑盒以及試劑的操作，除非另有說(shuō)明，否則通常按照制造商所規(guī)定的操作方案和/或參數(shù)來(lái)進(jìn)行。

在描述本發(fā)明方法之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限于所描述的具體方法學(xué)、操作方案、細(xì)胞系、動(dòng)物種或?qū)?、?gòu)建體以及試劑，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然是可以變化的。還應(yīng)當(dāng)理解的是，這里使用的術(shù)語(yǔ)僅僅旨在用于描述特定實(shí)施方式，而不旨在對(duì)本發(fā)明范圍構(gòu)成限制，本發(fā)明范圍僅由后附權(quán)利要求限定。

必須注意的是，除非上下文清楚地另有說(shuō)明，這里以及在后附權(quán)利要求書(shū)中所使用的，單數(shù)形式“a”，“an”，和“the”包括復(fù)數(shù)對(duì)象。在說(shuō)明書(shū)和相關(guān)權(quán)利要求中所述及的所有數(shù)字(例如，1-200mmhg等)應(yīng)理解為受術(shù)語(yǔ)“約”修飾。

本文所提到的所有出版物通過(guò)參考而并入本文，以公開(kāi)和描述與被引用的出版物有關(guān)的方法和/或材料。本文引用的出版物因其早于本申請(qǐng)的申請(qǐng)日的公開(kāi)而被引用。在此無(wú)一應(yīng)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明人無(wú)權(quán)依據(jù)更早的優(yōu)選權(quán)日或在先發(fā)明日而享有早于這些出版物的權(quán)利。此外，實(shí)際出版日可能不同于所示的日期，需要單獨(dú)核實(shí)。

此處所使用“約”指比所述值多或少10％的值。

此處所使用的“攪動(dòng)”是指擾動(dòng)，以便培養(yǎng)物的液相和培養(yǎng)物上方的氣相處于動(dòng)態(tài)相互作用中。攪動(dòng)可以是指運(yùn)動(dòng)如振蕩、攪拌、搖擺、定軌振蕩、滾動(dòng)、八字型搖蕩、或者能使液相處于非靜止態(tài)從而增加氣體在液相內(nèi)和外的擴(kuò)散的任何方式。

此處使用的“氣體”是指純氣體或者氣體的混合物，其可以包括氮?dú)?、氧氣、以及二氧化碳。通常，氮?dú)庖钥倸怏w濃度的約60-90％的量存在，氧氣以總氣體濃度的約10-40％的量存在，二氧化碳以總氣體濃度的約0-50％的量存在。

此處使用的“含碳酸氫鹽的細(xì)胞培養(yǎng)液”是指用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的合適培養(yǎng)基，其包含碳酸氫鹽緩沖體系作為其組成的一部分。所述培養(yǎng)基還可包含其他緩沖劑如hepes或者mops等，但是必須包含碳酸氫鹽基體系。

此處使用的“細(xì)胞培養(yǎng)物”是指在包含緩沖劑和對(duì)于活細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或維持所必須的營(yíng)養(yǎng)素的液體培養(yǎng)基中包含真核細(xì)胞的液體制品。

此處所使用的“溶解co2的濃度”由以mmhg為單位的co2相對(duì)測(cè)量分壓表示。因此，溶解co2的分壓被用作溶解的co2的濃度的反映。

“do”是指溶解氧。

此處使用的“動(dòng)態(tài)界面”是指由攪動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)物引起的液相和氣相之間的增強(qiáng)氣體活躍交換。

此處所使用的“真核細(xì)胞”是指動(dòng)物細(xì)胞，其可以是非脊椎動(dòng)物或者脊椎動(dòng)物的細(xì)胞。

此處所使用的“頂部空間”是指用于培養(yǎng)細(xì)胞的容器中位于細(xì)胞培養(yǎng)物的液相上方的氣相。

此處使用的hvm是指每分鐘頂部空間體積，其指示頂部空間中的氣體被清除的速度。

kla是指體積氧傳質(zhì)系數(shù)(volumetricoxygentransfercoefficient)。

kla^co2是指體積二氧化碳傳質(zhì)系數(shù)。

lpm是指每分鐘的氣流公升數(shù)。

此處使用的“調(diào)整/調(diào)節(jié)”是指實(shí)現(xiàn)值的增加或者減小。

此處使用的“監(jiān)測(cè)”是指通過(guò)連續(xù)或者間歇地取樣和分析以確定特定的值來(lái)跟蹤該值。

pco2是指溶解的co2濃度的分壓。

此處使用的“口”是指出入一個(gè)封閉系統(tǒng)的點(diǎn)。

此處使用的“預(yù)定的”是指針對(duì)一個(gè)具體參數(shù)提前選擇的值，該值被用作目標(biāo)值。

此處使用的“rpm”是指每分鐘搖擺數(shù)。

vcc是指活細(xì)胞濃度。

此處使用的“容器”是指容納器物(container)。此處使用的容器可以是，例如，搖瓶，生物反應(yīng)器，一次性生物反應(yīng)袋，培養(yǎng)室等。

此處使用的“vvm”是指每分鐘的容器容積。

理論方面

在wavebioreactor^tm培養(yǎng)中o2的傳質(zhì)

為了確定wavebioreactor^tm中o2的傳質(zhì)速率，我們假定對(duì)在線do探測(cè)器有足夠快的響應(yīng)時(shí)間，在cellbag^tm中理想的混合，以及由液相界面引起的傳質(zhì)阻力占主要。在這些假定條件下，以下質(zhì)量平衡公式可以給出由氣相到液相的氧氣傳質(zhì)速率大概值：

其中o2*是培養(yǎng)基中飽和的do濃度，o2是培養(yǎng)基中do濃度。取時(shí)間0時(shí)的o2為0，則該公式得出：

作為時(shí)間的函數(shù)對(duì)制圖，最佳擬合線的斜率提供體系的kla。

為了增加wavebioreactor^tm中氧氣的傳質(zhì)速率(公式1)，我們可以增加體系的kla，或者增加濃度梯度(o2*-o2)，或者增加兩者。為了增加wavebioreactor^tm體系的kla，我們可以增加搖擺速度、搖擺角度或者空氣流速(mikola,2007；singh,1999)。為了增加濃度梯度(o2*-o2)(提供o2由氣相轉(zhuǎn)移至液相的驅(qū)動(dòng)力)，我們可以在進(jìn)口氣體中增加o2的百分比以增加o2*。

在wavebioreactor^tm培養(yǎng)中co2的傳質(zhì)

在簡(jiǎn)化模型中，在cellbag^tm中氣體的co2(co2(g))與在培養(yǎng)基中的溶解co2達(dá)成平衡而存在：

而co2(aq)又以在和碳酸(h2co3)的平衡中存在，碳酸可以解離為碳酸氫根(hco3^-)：

在ph4-8范圍內(nèi)hco3^-向碳酸根(co3^2-)的進(jìn)一步解離應(yīng)是可以忽略不計(jì)的(royce和thornhill,1991)。

對(duì)于從培養(yǎng)基中放出co2的限速步驟應(yīng)當(dāng)是氣-液傳質(zhì)(公式3)。假定界面處液體中的co2濃度處于與主氣體(bulkgas)中的co2濃度的平衡中，下面的質(zhì)量平衡公式將估計(jì)出由液相到氣相的co2傳質(zhì)速率：

其中是溶解的二氧化碳的體積傳質(zhì)系數(shù)。

在wavebioreactor^tm中無(wú)溶解co2探測(cè)器，不能進(jìn)行實(shí)時(shí)co2測(cè)量來(lái)直接計(jì)算co2(aq)傳質(zhì)速率。然而，基于我們對(duì)在我們的培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽緩沖體系的認(rèn)識(shí)，我們預(yù)計(jì)co2的離去可以增加培養(yǎng)物ph值，這是因?yàn)楣?和4中的平衡將向左邊移動(dòng)。如果對(duì)于在線ph探測(cè)器有足夠快的響應(yīng)時(shí)間，在動(dòng)態(tài)co2(aq)傳遞研究中它產(chǎn)生的ph曲線應(yīng)當(dāng)提供對(duì)co2(aq)剝離速度的間接估計(jì)。

為了提高培養(yǎng)物ph值，我們可以通過(guò)增加體系的kla^co2，或者通過(guò)增加co2傳遞的驅(qū)動(dòng)力(co2(aq)-co2(g))，或者通過(guò)增加二者，來(lái)增加wavebioreactor^tm中co2剝離速度(公式5)。具體來(lái)說(shuō)，為增加wavebioreactor^tm體系的kla^co2，我們可以增加搖擺速度和搖擺角度。為了增加驅(qū)動(dòng)力(co2(aq)-co2(g))，我們可以降低進(jìn)口氣體中co2的百分比以降低co2(g)。根據(jù)亨利定律(henry’slaw)，cellbag^tm頂部空間中co2(g)分壓(pco2(g))將限制培養(yǎng)基中co2(aq)濃度：

其中h＝co2的亨利定律常數(shù)。

相反，為減小培養(yǎng)物ph值，我們可以增加進(jìn)口氣體中co2(g)的濃度以增加co2(aq)，由此，使公式4中的平衡向右移動(dòng)。

本發(fā)明方法

本發(fā)明的方法中，真核細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基以及溫度下培養(yǎng)以允許細(xì)胞存活。本領(lǐng)域公知，不同的細(xì)胞類型可在不同的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇對(duì)特定細(xì)胞類型和/或特定應(yīng)用最合適的培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)基必須包含碳酸氫鹽緩沖體系，以允許通過(guò)co2調(diào)整ph。所述培養(yǎng)基可以包含其他作為緩沖劑的試劑。

可以在本發(fā)明方法中使用的真核細(xì)胞包括動(dòng)物細(xì)胞，其可以是非脊椎動(dòng)物細(xì)胞也可以是脊椎動(dòng)物細(xì)胞。非脊椎動(dòng)物細(xì)胞包括昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)，家蠶(bombyxmori)，粉紋夜蛾(trichoplusiani)細(xì)胞)。脊椎動(dòng)物細(xì)胞包括哺乳類動(dòng)物和非哺乳類動(dòng)物細(xì)胞。脊椎動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于來(lái)自蛙(例如非洲瓜蟾(xenopuslaevis))，兔形目動(dòng)物(lagomorpha)(例如，家兔和野兔)，嚙齒類動(dòng)物(例如，大鼠，倉(cāng)鼠，沙鼠(jirds)，沙鼠(gerbils)，小鼠)，貓，狗，綿羊，牛，山羊，豬，馬，非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物以及人類的細(xì)胞。

本發(fā)明方法中使用的細(xì)胞可以是重組的細(xì)胞或者非重組細(xì)胞。重組細(xì)胞可以包括表達(dá)特定蛋白質(zhì)的工程化細(xì)胞(如穩(wěn)定的或者瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)、或者產(chǎn)生特定rnas(例如，sirna，核酶等)的工程化細(xì)胞。

在合適培養(yǎng)基中的細(xì)胞被放入到培養(yǎng)容器中，將氣體注入到頂部空間。在某些實(shí)施方式中，頂部空間的清除速率是在約0.002-0.1hvm范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，頂部空間的清除速率是在約0.007-0.08hvm范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，頂部空間的清除速率是在約0.009-0.06hvm范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，頂部空間的清除速率是在約0.01-0.04hvm范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，頂部空間的清除速率是在約0.02-0.03hvm范圍內(nèi)。在其他實(shí)施方式中，頂部空間的清除速率是在約0.009-0.024hvm范圍內(nèi)。在另外的實(shí)施方式中，頂部空間的清除速率是在約0.007-0.02hvm范圍內(nèi)。“hvm”是氣體的體積流速(l/min)與頂部空間的體積(l)的比率。

在某些實(shí)施方式中，例如，在具有20l的培養(yǎng)物體積和30l的頂部空間體積的50lwavebioreactor^tm袋中，流入容器的氣體流速是0.1l/min-1l/min。在某些實(shí)施方式中，流入袋中的氣體流速是0.2l/min。在某些實(shí)施方式中，氣體流速是0.3l/min。在其他實(shí)施方式中，氣體流速是0.4l/min。在其他實(shí)施方式中，氣體流速是0.5l/min。在其他實(shí)施方式中，氣體流速是0.6l/min。在其他實(shí)施方式中，氣體流速是0.7l/min。在其他實(shí)施方式中，氣體流速是0.8l/min。在其他實(shí)施方式中，氣體流速是0.9l/min。

通常，細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)當(dāng)維持在約6-8的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，ph值維持在約6.6-7.6的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，ph值維持在約6.9-7.5的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，ph值維持在約6.8-7.2的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，ph值維持在約7.0-7.3的范圍內(nèi)。盡管本發(fā)明的方法無(wú)需監(jiān)測(cè)ph值以維持利于細(xì)胞在培養(yǎng)中生長(zhǎng)的ph值，但在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方式中，培養(yǎng)物的ph值也可以被監(jiān)測(cè)(間歇的或者連續(xù)的)。測(cè)量可以是原位或者離線進(jìn)行。

在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方式中，do值維持在10％以上。在其他實(shí)施方式中，do值維持在20％以上。在其他實(shí)施方式中，do值維持在30％以上。在其他實(shí)施方式中，do值維持在40％以上。在其他實(shí)施方式中，do值維持在50％以上。在其他實(shí)施方式中，do值維持在60％以上。在其他實(shí)施方式中，do值維持在70％以上。在其他實(shí)施方式中，do值維持在80％以上。在其他實(shí)施方式中，do值維持在90％以上。

液體培養(yǎng)基中co2濃度的監(jiān)測(cè)是現(xiàn)有技術(shù)已知的，并可以使用商業(yè)上可用的技術(shù)來(lái)完成。測(cè)量可以原位或離線進(jìn)行。

在本發(fā)明方法的一個(gè)特定的舉例說(shuō)明性實(shí)施方式中，使用分批工藝，其中細(xì)胞使用分步方式來(lái)培養(yǎng)。該方法中，使用具有20l培養(yǎng)物工作容積的50lwavebioreactor^tm系統(tǒng)袋，其中向頂部空間注入氣體，該氣體在第一天補(bǔ)充了8％co2(v/v)氣體，第二天補(bǔ)充了5％co2(v/v)氣體，隨后補(bǔ)充了2％co2(v/v)氣體。對(duì)于接種物，wavebioreactor^tm以10°和21rpm以及0.2l/min搖擺，然后，對(duì)于規(guī)模放大階段，采用23rpm，10°搖擺角，0.2l/min。在這種安排中，由于ph可以通過(guò)所使用的參數(shù)被維持，故監(jiān)測(cè)ph值不是必要的。

在本發(fā)明方法的一個(gè)特定舉例說(shuō)明性實(shí)施方式中，使用灌流工藝。該方法中，使用具有20l培養(yǎng)物工作體積的50lwavebioreactor^tm袋。在開(kāi)始灌流后兩天，向袋中注入補(bǔ)充30％(v/v)o2的氣體。氣體流速由第0天0.2l/min逐步增長(zhǎng)，接著在第3天增加到0.4l/min，然后在第6天再次增加到0.6l/min。在這種安排中，由于ph可以通過(guò)使用的參數(shù)而維持，故監(jiān)測(cè)ph值不是必要的。

在本發(fā)明方法的另外一個(gè)特定的舉例說(shuō)明性實(shí)施方式中，使用灌流工藝。該方法中，使用具有20l培養(yǎng)物工作體積的50lwavebioreactor^tm袋。在開(kāi)始灌流后兩天，向袋中注入用30％(v/v)o2補(bǔ)充的氣體。氣體流速維持在恒定的0.6l/min氣體流速。在這種安排中，由于通過(guò)使用的參數(shù)可以維持ph值，故監(jiān)測(cè)ph值不是必要的。

在本發(fā)明方法的再另外一個(gè)特定舉例說(shuō)明性實(shí)施方式中，使用灌流工藝。該方法中，使用具有20l培養(yǎng)物工作體積的50lwavebioreactor^tm袋。在開(kāi)始灌流后兩天，向袋中注入用30％(v/v)o2補(bǔ)充的氣體。氣體流速維持在恒定的1.0l/min流速。在這種安排中，因?yàn)橥ㄟ^(guò)使用的參數(shù)可以維持ph值，故監(jiān)測(cè)ph值不是必要的。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，明顯地，培養(yǎng)條件的參數(shù)(氣體濃度，流速，hmv，搖擺速度，搖擺角度等)，可以使用本文教導(dǎo)來(lái)調(diào)整以實(shí)現(xiàn)具有期望范圍的ph值。

裝置

容納細(xì)胞培養(yǎng)基的容器不限于任何特定尺寸。本發(fā)明的容器可以適用于常用生物反應(yīng)器的尺寸以及本領(lǐng)域中使用的一次性培養(yǎng)袋的尺寸，也可以適用于更大的或者更小的培養(yǎng)。

容器對(duì)制造容器使用的材料沒(méi)有限定。容器可以由固體材料制備，如玻璃或者硬塑料，或者可以由柔性材料制備，如軟塑料，如用于生產(chǎn)一次性生物反應(yīng)器袋的那些。

容器可任選地包含擋板以增加攪動(dòng)時(shí)培養(yǎng)基的湍流。

容器可以配備一個(gè)或多個(gè)口以允許添加或者移除氣體和液體。氣體可以經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)口進(jìn)入頂部空間和移出頂部空間。在一實(shí)施方式中，存在單一個(gè)允許氣體進(jìn)入和排出的口。在其他實(shí)施方式中，存在兩個(gè)口：一個(gè)用于氣體進(jìn)入，一個(gè)用于氣體排出。在其他實(shí)施方式中，使用多個(gè)口以允許氣體進(jìn)出。

在某些實(shí)施方式中，裝置也可以包含ph值監(jiān)測(cè)器，連續(xù)或者間歇監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基ph值?？梢允褂胮h值監(jiān)測(cè)器，和自動(dòng)化系統(tǒng)通訊，以向容器頂部空間進(jìn)氣和脫氣以改變co2的濃度，由此調(diào)整培養(yǎng)基的ph值。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的裝置包含co2監(jiān)測(cè)器，其連續(xù)或者間歇性監(jiān)測(cè)溶解co2的分壓作為培養(yǎng)基中co2濃度的指示。可以使用co2監(jiān)測(cè)器，和自動(dòng)化系統(tǒng)通訊，以向容器頂部空間進(jìn)氣或脫氣以改變?nèi)芙鈉o2的濃度，從而調(diào)整由co2監(jiān)測(cè)器測(cè)量到的co2實(shí)際濃度至預(yù)定值。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的裝置包含有溫度監(jiān)測(cè)器，連續(xù)的或者間歇性的監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基的溫度?？梢允褂脺囟缺O(jiān)測(cè)器，和自動(dòng)化系統(tǒng)通訊，以增加或者降低溫度，從而調(diào)整由監(jiān)測(cè)器測(cè)量到的實(shí)際溫度到預(yù)定的值。

各種參數(shù)監(jiān)測(cè)器可以單獨(dú)或者聯(lián)合使用，并且可以使用由電腦控制的自動(dòng)化控制系統(tǒng)進(jìn)行控制。電腦可以編程以執(zhí)行必要的計(jì)算來(lái)確定待用氣體輸入的或者待由頂部空間除去的co2的量以調(diào)整培養(yǎng)基的ph值。計(jì)算機(jī)還可以執(zhí)行與溫度、攪拌速度、培養(yǎng)基灌流和其他參數(shù)有關(guān)的計(jì)算和控制工具以自動(dòng)化方式調(diào)整參數(shù)。

任選的，本發(fā)明的裝置包括攪拌器以攪拌容器使得細(xì)胞培養(yǎng)基不是靜態(tài)的而是出于與頂部空間氣體的動(dòng)態(tài)界面中。攪拌有利于氣體進(jìn)出細(xì)胞培養(yǎng)基的擴(kuò)散。攪拌器可以是本領(lǐng)域中已知的任何形式，但包括非限制性的例子如搖床、定軌搖床、旋轉(zhuǎn)混合器(rotator)、八字形搖床、搖擺式平臺(tái)、旋轉(zhuǎn)式平臺(tái)等。

自動(dòng)氣體傳輸和氣體清除系統(tǒng)(gaspurgingsystem)可包括閥門(mén)和泵系統(tǒng)以通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾器遞送加壓氣體，具有控制表用于控制氣體流入容器的流速。任何本領(lǐng)域中已知的傳輸氣體和排出氣體的工具都可以使用?？梢皂憫?yīng)計(jì)算機(jī)計(jì)算的信號(hào)，在細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解co2的濃度偏離預(yù)定值時(shí)，引入氣體。當(dāng)測(cè)量的co2濃度偏離預(yù)定值時(shí)，自動(dòng)化系統(tǒng)計(jì)算需要添加到系統(tǒng)或者自系統(tǒng)移除的co2量，在現(xiàn)有氣體通過(guò)出口被清除時(shí)，將具有合適量的co2的氣體引入到頂部空間。計(jì)算機(jī)可以執(zhí)行涉及在此定義的公式1，2和/或3的計(jì)算、以及如本領(lǐng)域技術(shù)人員基于現(xiàn)有文獻(xiàn)、商業(yè)可用系統(tǒng)以及這里的教導(dǎo)可以知曉的，用于調(diào)節(jié)系統(tǒng)的其他計(jì)算。

備選地或者與使用監(jiān)測(cè)的co2濃度的響應(yīng)系統(tǒng)聯(lián)合，該自動(dòng)化系統(tǒng)也可以測(cè)量培養(yǎng)基的ph值，并且當(dāng)測(cè)量的ph值偏離用于培養(yǎng)細(xì)胞的預(yù)定ph時(shí)做出響應(yīng)。自動(dòng)化系統(tǒng)可以對(duì)偏離的co2濃度和/或ph值做出響應(yīng)，并且在清除現(xiàn)有氣體的同時(shí)使用氣體引入合適量的co2，如此以適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基的ph值。

現(xiàn)在參考圖1，在一個(gè)非限制性的實(shí)例中描述本發(fā)明裝置和方法。培養(yǎng)容器(40)包含細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞(110)和頂部空間(130)。帶有過(guò)濾器(50)的進(jìn)氣口(70)和容器(40)相連以允許氣體注入到頂部空間(130)。帶有過(guò)濾器(60)的出氣口(80)和容器(40)相連以允許氣體排出頂部空間(130)。容器安置在與搖擺裝置(20)和基部(10)相連的平臺(tái)(30)上，以允許細(xì)胞培養(yǎng)基(110)的搖擺運(yùn)動(dòng)和攪動(dòng)。頂部空間(130)中的攪動(dòng)和氣流允許o2和co2擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞培養(yǎng)基(110)。如果必需的話，用于保留細(xì)胞在培養(yǎng)容器中的任選灌流過(guò)濾器(90)經(jīng)由管(100)與培養(yǎng)基口(120)相連，以允許自細(xì)胞培養(yǎng)物移除廢培養(yǎng)基。

細(xì)胞在容器(40)中在細(xì)胞培養(yǎng)基(110)中培養(yǎng)。容器(40)中的頂部空間(130)充有氣體。氣體通過(guò)氣體進(jìn)口(70)流入和流出氣體出口(80)，使得氣體可以流過(guò)頂部空間(130)，以及使得當(dāng)通過(guò)在連接基部(10)的搖擺裝置上搖擺平臺(tái)(30)來(lái)攪動(dòng)培養(yǎng)物時(shí)自細(xì)胞培養(yǎng)基(110)擴(kuò)散出到頂部空間中的co2流出。細(xì)胞培養(yǎng)基(110)中溶解co2的減少導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基(110)的ph值增加。

細(xì)胞培養(yǎng)基(110)可以任選補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，所述新鮮培養(yǎng)基經(jīng)由培養(yǎng)基管(140)通過(guò)培養(yǎng)基口(150)供應(yīng)，并穿過(guò)灌流過(guò)濾器(90)、向上經(jīng)由培養(yǎng)基管(100)并通過(guò)培養(yǎng)基出口(120)向外排出。在本發(fā)明方法的此任選特征中，在最初的細(xì)胞培養(yǎng)基被耗盡營(yíng)養(yǎng)以及在細(xì)胞廢產(chǎn)物累積和ph值降低時(shí)，供應(yīng)新鮮培養(yǎng)基。供應(yīng)的新鮮培養(yǎng)基具有預(yù)定ph值，該ph值足以使混合后總的細(xì)胞培養(yǎng)基的ph值增加，致使細(xì)胞培養(yǎng)基達(dá)到預(yù)定的最佳ph范圍。

實(shí)施例

a.原理:

由于大部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系利用含碳酸氫鹽的細(xì)胞培養(yǎng)基，故主要通過(guò)堿/co2的添加來(lái)進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的ph值控制。該ph值控制利用碳酸-碳酸氫鹽緩沖體系。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在這種系統(tǒng)例如一次性袋生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)物的ph值可以通過(guò)操控培養(yǎng)基中溶解co2的濃度來(lái)調(diào)整，培養(yǎng)基中溶解co2的濃度可以通過(guò)調(diào)整頂部空間co2的濃度來(lái)調(diào)整。在本實(shí)施例中證實(shí)，通過(guò)調(diào)整頂部空間co2的濃度，可以實(shí)現(xiàn)雙向ph值調(diào)節(jié)。該方法使得無(wú)需使用堿來(lái)增加細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的ph值。如果一次性生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)的ph值需要降低，可通過(guò)用co2補(bǔ)充進(jìn)氣來(lái)增加頂部空間中co2的濃度。這將使得co2可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)物中。如果一次性袋中細(xì)胞培養(yǎng)物的ph值需要增加，可以降低頂部空間中co2的濃度或者可以增加頂部空間的清除速率，以利于co2從細(xì)胞培養(yǎng)物中移出。

這種ph值維持方法可以擴(kuò)展到如下生物反應(yīng)器體系，在該體系中氣體在生物反應(yīng)器中的傳遞主要是通過(guò)在生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的大表面積來(lái)推動(dòng)的。

在細(xì)胞建庫(kù)過(guò)程中基于co2添加或者移除的ph值維持策略：

在細(xì)胞培養(yǎng)的初始階段，當(dāng)存在相對(duì)較小數(shù)量的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)物的ph值通常是上升的。為了控制ph值，通常要將co2添加到生物反應(yīng)器中以降低ph值。通常，在常規(guī)攪拌釜生物反應(yīng)器中，此種添加通過(guò)將co2氣體噴射入細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)完成。在本發(fā)明的一次性生物反應(yīng)器中，通過(guò)改變頂部空間的二氧化碳濃度，使co2轉(zhuǎn)移的方向從氣相到液相。隨著細(xì)胞濃度在培養(yǎng)過(guò)程中增加，細(xì)胞培養(yǎng)物中的co2濃度也增加，因此通常要降低ph值。在具有常規(guī)ph值反饋控制的常規(guī)攪拌釜生物反應(yīng)器中，將添加堿以控制ph值。堿的添加可以增加細(xì)胞培養(yǎng)物的ph值。在本發(fā)明的一次性生物反應(yīng)器中，ph值的增加可以通過(guò)反轉(zhuǎn)co2轉(zhuǎn)移的方向，通過(guò)降低頂部空間的co2濃度以及增加頂部空間的清除速率來(lái)完成。這種通過(guò)操作培養(yǎng)基中co2濃度來(lái)維持細(xì)胞培養(yǎng)物ph值的方法，允許消除堿的使用。根據(jù)需求(要么增加要么降低ph值)，可以分別地降低或者增加頂部空間的co2濃度。

一次性生物反應(yīng)器系統(tǒng)可用作產(chǎn)生高細(xì)胞密度細(xì)胞庫(kù)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，例如但不限于主細(xì)胞庫(kù)(mcb)和工作細(xì)胞庫(kù)(wcb)。灌流細(xì)胞培養(yǎng)工藝被認(rèn)為可以在一次性生物反應(yīng)器中產(chǎn)生高細(xì)胞密度細(xì)胞庫(kù)。在開(kāi)發(fā)用于產(chǎn)生mcbs和wcbs的細(xì)胞培養(yǎng)工藝時(shí)，建議通過(guò)co2添加/移出方法來(lái)維持ph值。除了通過(guò)該氣體轉(zhuǎn)移方法來(lái)維持ph值外，細(xì)胞培養(yǎng)物的灌流允許額外的維持ph的機(jī)會(huì)。在灌流細(xì)胞培養(yǎng)工藝中，在連續(xù)的移除廢培養(yǎng)基的同時(shí)向生物反應(yīng)器中連續(xù)地添加新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基。灌流允許移除細(xì)胞培養(yǎng)副產(chǎn)物(其可能會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)物ph值)。除了移除細(xì)胞培養(yǎng)副產(chǎn)物，注入的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基的ph也可以改變細(xì)胞培養(yǎng)物的ph值。如果知道細(xì)胞培養(yǎng)物的ph值將降低，則可以增加進(jìn)入的培養(yǎng)基的ph值以彌補(bǔ)該ph值降低?；蛘?，也可以改變灌流速率以管理培養(yǎng)物ph值。所有上述方法對(duì)ph值都有影響，但是影響ph值最重要的因素是co2轉(zhuǎn)移法。因?yàn)樵谝淮涡陨锓磻?yīng)器中氣流速度和co2補(bǔ)充可以被有效控制而沒(méi)有太多問(wèn)題，故co2轉(zhuǎn)移也是一種更為可靠的方法。

當(dāng)我們最初嘗試在沒(méi)有ph值和do反饋控制下在wavebioreactor^tm中培養(yǎng)cho細(xì)胞時(shí)，我們認(rèn)識(shí)到幾個(gè)挑戰(zhàn)(圖5)：(1)分批培養(yǎng)階段(第0-6天)以約0.3天^-1緩慢生長(zhǎng)；(2)灌流培養(yǎng)階段(自第6天起)逐步更加緩慢的生長(zhǎng)，從頭3天期間的約0.5天^-1降低至此后的少于0.3天^-1；(3)初始培養(yǎng)物ph值有時(shí)超過(guò)7.3，并且隨后的培養(yǎng)物ph值常常降到ph6.8以下；(4)在第6天灌流開(kāi)始后，do水平往往低于20％空氣飽和度。在使用生產(chǎn)其他mabs的cho細(xì)胞系(沒(méi)有顯示數(shù)據(jù))時(shí)我們遇到了同樣的挑戰(zhàn)。我們將分批培養(yǎng)中的緩慢生長(zhǎng)歸咎于高的初始ph值，灌流培養(yǎng)中生長(zhǎng)速率的降低歸咎于ph值和do值的降低。

在無(wú)ph值反饋控制的wavebioreactor^tm中，這些碳酸氫鹽緩沖的培養(yǎng)物中的ph值將取決于cellbag^tm頂部空間中的co2含量。盡管在培養(yǎng)基中存在碳酸氫鹽和hepes緩沖液，但是由于乳酸累積的結(jié)果，培養(yǎng)ph值應(yīng)隨著時(shí)間最終降低。為了將培養(yǎng)ph值維持在我們期望的6.8-7.2范圍，我們的策略是操控cellbag^tm中的co2濃度。在分批培養(yǎng)的早期階段，我們?cè)黾酉蚺囵B(yǎng)基中的co2轉(zhuǎn)移以降低ph值。相反，在分批培養(yǎng)或者灌流培養(yǎng)的后期階段，我們將從培養(yǎng)基中剝離co2以增加ph值。在無(wú)do反饋控制的wavebioreactor^tm中，do水平將隨著細(xì)胞密度的增加而降低。為了維持do＞20％空氣飽和度，我們將通過(guò)增加wavebioreactor^tm系統(tǒng)的氧氣體積傳質(zhì)系數(shù)(kla)以及通過(guò)用o2補(bǔ)充進(jìn)口氣體來(lái)增加向培養(yǎng)物中的o2轉(zhuǎn)移。

b.材料和方法：

1.cho細(xì)胞系和培養(yǎng)基

實(shí)施例中使用的所有細(xì)胞系均源于適應(yīng)在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)的cho二氫葉酸還原酶缺陷型(dhfr-)宿主。產(chǎn)生特定單克隆抗體(mab)的每個(gè)細(xì)胞系通過(guò)使用編碼dhfr、mab輕鏈(lc)以及mab重鏈(hc)基因的dna質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)染dhfr-宿主得到。隨后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)過(guò)在包含氨甲蝶呤的化學(xué)成分明確的專利選擇性培養(yǎng)基中每2-5天傳代一次來(lái)維持。同樣的培養(yǎng)基——除了專利營(yíng)養(yǎng)混合物外還包含1.0g/lpluronicf-68，2.44g/l碳酸氫鈉，以及15mmhepes——用來(lái)在wavebioreactor^tm中在分批和灌流模式下培養(yǎng)細(xì)胞。

2.wavebioreactor^tm系統(tǒng)

wavebioreactor^tm系統(tǒng)(gehealthcare，piscataway,nj,usa)——用于在分批或者灌流模式下培養(yǎng)cho細(xì)胞——包括搖擺平臺(tái)、控制器組件和預(yù)消毒的柔性的一次性袋，袋子具有進(jìn)氣口和出氣口氣體過(guò)濾器以及多個(gè)采樣口(singh,1999；tang等,2007)。每個(gè)系統(tǒng)都裝配有加熱墊和氣體混合盒以分別提供溫度控制和所需的進(jìn)口氣體組合物(o2和/或co2與空氣混合)。所有的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)都是使用50lcellbag^tm在工作體積6或者20l，37℃溫度設(shè)定點(diǎn)，19-25rpm的搖擺速度，8-12°的搖擺角下進(jìn)行。在wavebioreactor^tm中沒(méi)有安裝在線ph或do探測(cè)器；相反，對(duì)不同氣體混合物和氣體流速策略，測(cè)試它們維持培養(yǎng)ph值和do水平在目標(biāo)范圍內(nèi)的能力。

3.wavebioreactor^tm中的分批培養(yǎng)

分批培養(yǎng)以6l在wavebioreactor^tm中通過(guò)以～7.5×10⁵細(xì)胞/ml接種常規(guī)或灌流cellbag^tm而開(kāi)始。接種后幾天，當(dāng)培養(yǎng)物積累了足夠細(xì)胞質(zhì)量時(shí)，加入新鮮的培養(yǎng)基以增加工作體積至20l。對(duì)于每一代，培養(yǎng)物在分批模式下維持2-5天。

4、在wavebioreactor^tm中灌流培養(yǎng)

除非另有說(shuō)明，灌流培養(yǎng)在分批培養(yǎng)累積了足夠的細(xì)胞質(zhì)量后在灌流cellbag^tm中以20l工作體積開(kāi)始，具有23rpm的搖擺速度和10°的搖擺角度，以及每天1工作體積的灌流速率。在灌流cellbag^tm中細(xì)胞保留裝置為過(guò)濾器，在培養(yǎng)期間其浮在液體表面上(tang等，2007)。在連續(xù)地添加新鮮培養(yǎng)基和移除濾液時(shí)，灌流過(guò)濾器使細(xì)胞保留在cellbag^tm中。通過(guò)使新鮮培養(yǎng)基添加速率匹配每天一個(gè)工作體積的濾液移除速率，在灌流wavebioreactor^tm中維持恒定的體積。

5.攪拌釜生物反應(yīng)器培養(yǎng)

為了比較在wavebioreactor^tm中和攪拌釜生物反應(yīng)器中培養(yǎng)物的性能，來(lái)自相同seedtrain源的細(xì)胞以～7.5×10⁵細(xì)胞/ml接種到wavebioreactor^tm生物反應(yīng)器中和20l不銹鋼攪拌釜生物反應(yīng)器(applikon,fostercity,ca,usa)中。細(xì)胞首先是在分批模式下培養(yǎng)，接著在累積足夠的細(xì)胞質(zhì)量后開(kāi)始灌流。在攪拌釜生物反應(yīng)器中工作體積是在分批模式下7l和在灌流模式下15l。培養(yǎng)溫度，do以及攪拌分別維持在37℃、30％空氣飽和度、以及125rpm的設(shè)定值。通過(guò)添加1m碳酸鈉以增加ph值或者噴射co2氣體以降低ph值來(lái)維持培養(yǎng)ph值在7.15，具有0.03的死區(qū)。在灌流操作期間，使用centritech離心機(jī)系統(tǒng)(centritechab,norsborg,sweden)將細(xì)胞從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分離；通過(guò)離心機(jī)，細(xì)胞被保留并返回到生物反應(yīng)器，而上清液被移除(johnson等,1996)。通過(guò)使新鮮培養(yǎng)基的添加速率匹配每天一個(gè)工作體積的上清液移除速率，維持生物反應(yīng)器中的恒定體積。

6、離線樣品分析

培養(yǎng)物被抽樣并用于活細(xì)胞濃度(vcc)和存活力(vi-cellas,beckmancoulter,fullerton,ca,usa)、以及用于ph,do,pco2,葡萄糖和乳酸(bioprofile400,novabiomedical,waltham,ma,usa)分析。

實(shí)施例1：無(wú)細(xì)胞研究：氣體傳質(zhì)測(cè)量

cellbag^tm中氣體傳質(zhì)特征影響培養(yǎng)性能，原因是它們對(duì)do和ph水平的影響。作為將ph和do維持在我們期望的范圍內(nèi)的第一步，進(jìn)行了cellbag^tm中無(wú)細(xì)胞研究以測(cè)量o2和co2的傳質(zhì)。

a.o2傳質(zhì)研究

在50l的cellbag^tm中o2傳質(zhì)，使用模擬的培養(yǎng)基，通過(guò)計(jì)算在搖擺速度(20,30,以及40rpm)、搖擺角度(8°,10°,以及12°)和氣流速(0.1,0.2,以及0.3l/min)的各種組合下o2體積傳質(zhì)系數(shù)(kla)來(lái)表征。經(jīng)典的動(dòng)態(tài)排氣法(gassing-outmethod)被用來(lái)計(jì)算kla(dunn和einsele,1975)。用于這些研究的測(cè)試培養(yǎng)基被設(shè)計(jì)用來(lái)模擬專利細(xì)胞培養(yǎng)基：它是由1.0g/lpluronicf-68，2.44g/l碳酸氫納，以及15mmhepes組成。來(lái)自同一制造商(broadley-jamescorporation,irvine,ca,usa)的連接到40型發(fā)送機(jī)(trasmitter)的do探測(cè)器被用來(lái)提供在線do測(cè)量。

在用于o2傳質(zhì)測(cè)試的準(zhǔn)備中，在將25l模擬培養(yǎng)基裝入50-lcellbag^tm后，使氮?dú)?n2)通過(guò)氣體進(jìn)入口。搖擺袋子以促進(jìn)n2轉(zhuǎn)移到模擬培養(yǎng)基中。當(dāng)模擬培養(yǎng)基的do含量跌到10％空氣飽和度以下時(shí)停止進(jìn)入頂部空間的氮?dú)饬鳌Ｔ诖嗣撗醪襟E后，按壓袋子以從頂部空間中排出殘留n2。然后在對(duì)液-氣界面干擾最小化時(shí)，向袋子中的頂部空間添加壓縮氣體。一旦袋子完全膨脹，在所定義的搖擺速度、搖擺角度以及氣流速測(cè)試條件下開(kāi)始氧氣傳質(zhì)測(cè)試。記錄do濃度得到的增加，并用來(lái)確定體系的kla。此外，頭5分鐘內(nèi)每一分鐘，此后每5分鐘測(cè)量離線do，以驗(yàn)證在線do讀數(shù)的準(zhǔn)確性。

在恒定的空氣流速，可能是通過(guò)增加用于氧氣傳質(zhì)的表面積，增加搖擺速度或者搖擺角度增加了kla(圖2a)。我們?cè)跍y(cè)試的最小搖擺速度(20rpm)得到的kla值比得上其他研究者所報(bào)道的wavebioreactor^tm系統(tǒng)的值(mikola等,2007；singh,1999)。這些kla值也比得上由我們的自制攪拌釜生物反應(yīng)器所得到的值(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。

在以恒定的20rpm搖擺速度進(jìn)行的wavebioreactor^tm系統(tǒng)的o2傳質(zhì)研究中，在2-l的規(guī)模下，空氣流速?gòu)?.01vvm增加到0.05vvm使kla從～2h^-1增加到～3h^-1，在20-l的規(guī)模下，空氣流速?gòu)?.01vvm增加到0.1vvm，使kla從～0.5h^-1增加到～3h^-1(singh，1999)。作為對(duì)比，在50-l規(guī)模的我們的研究中，在搖擺速度和搖擺角度的兩種不同組合下氣流速?gòu)?vvm增加到0.02vvm，沒(méi)有增加kla(圖2b)。我們使用的最大氣流速可能太低，不能實(shí)現(xiàn)在氣液界面的液體運(yùn)動(dòng)性，從而對(duì)kla沒(méi)有任何顯著的影響。

通過(guò)確定傳質(zhì)系數(shù)kla，評(píng)價(jià)了氧氣在50l一次性袋中的傳質(zhì)能力。圖2c顯示，對(duì)于恒定氣流速，隨時(shí)間的do濃度。圖2d顯示氣流速對(duì)溶解氧的影響。對(duì)于激烈的搖擺條件(更高搖擺速度和搖擺角度)，傳質(zhì)系數(shù)是高的。然而，令人驚訝的是，頂部空間的清除速率對(duì)氧氣傳質(zhì)的kla沒(méi)有影響，在開(kāi)始試驗(yàn)前，模擬培養(yǎng)基進(jìn)行去氧化。氣體中氧氣的濃度高于模擬培養(yǎng)基中氧氣的濃度。因此，氧氣從氣相傳質(zhì)到液相中。以激烈的搖擺條件，氣液界面由于更多波的形成而增加(此處稱作動(dòng)態(tài)界面)。這種表面積的增加看起來(lái)導(dǎo)致高氧氣傳質(zhì)速率。當(dāng)氣流速增加或者減少時(shí)，可以相應(yīng)地變化頂部空間的清除速率。頂部空間清除的該變化不改變氣相和液相之間的差異氧氣濃度。因此，氣流速看起來(lái)對(duì)氧氣傳質(zhì)系數(shù)沒(méi)有影響。當(dāng)模擬培養(yǎng)基中氧氣的濃度等于頂部空間中的濃度時(shí)，氧氣傳質(zhì)將停止。

b.co2傳質(zhì)研究

在模擬培養(yǎng)基通過(guò)使用用于o2傳質(zhì)研究的方法去氧化后，將co2通過(guò)用于供應(yīng)氮?dú)獾耐瑯舆M(jìn)氣口，供應(yīng)到cellbag^tm。當(dāng)在線ph值探測(cè)器讀數(shù)7.0時(shí)，停止co2的供應(yīng)，并且使用在o2傳質(zhì)研究中描述的同樣的方法來(lái)清除頂部空間。當(dāng)袋完全膨脹后，在所定義的搖擺速度、搖擺角度以及氣流速測(cè)試條件下開(kāi)始co2傳質(zhì)研究。用與同樣的制造商(gehealthcare,piscataway,nj,usa)提供的ph20發(fā)送機(jī)相連的一次性在線ph探測(cè)器，記錄引起的ph增加。ph值的增加是由于co2被從碳酸氫鹽基模擬培養(yǎng)基中去除而引起。為了驗(yàn)證在線ph值讀數(shù)的準(zhǔn)確性，頭5分鐘內(nèi)每一分鐘，此后每5分鐘測(cè)量模擬培養(yǎng)基的離線ph值。通過(guò)繪制在線ph測(cè)量值對(duì)時(shí)間的圖像，最佳擬合線的斜率提供了ph值的變化速率，由此表明cellbag^tm中co2從模擬培養(yǎng)基到頂部空間的傳質(zhì)速率。

盡管其他研究人員已經(jīng)表征了wavebioreactor^tm中o2的傳質(zhì)(mikola等,2007；singh,1999)，但我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)關(guān)于在具有wave誘導(dǎo)的攪動(dòng)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中co2傳質(zhì)的報(bào)道。為了表征wavebioreactor^tm中co2的傳質(zhì)，以和我們的細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中同樣的濃度(2.44g/l)，我們使用了包含碳酸氫鈉的模擬培養(yǎng)基。在這種碳酸氫鹽緩沖的無(wú)細(xì)胞體系中，在無(wú)活躍ph值控制下，從液相中移出co2將會(huì)增加體系的ph值。代替依賴于co2探測(cè)器在模擬培養(yǎng)基中直接測(cè)量co2，我們使用了源于wavebioreactor^tm中在線ph探測(cè)器的ph曲線以估算相對(duì)co2剝離速度。

在該研究中，在wavebioreactor^tm中ph曲線被分成兩個(gè)階段(圖3a和3b)。在第一階段，在0-5分鐘之間，ph值以每小時(shí)～1-4ph單位，迅速增加。在第二階段，從5-60分鐘，ph值以每小時(shí)<0.5ph單位，更為逐漸地增加。在第二階段(5-60分鐘)，不同的搖擺速度和搖擺角度對(duì)ph值增加速度有微不足道的影響：在恒定的0.2l/min的空氣流速下，ph值以每小時(shí)0.2單位增加，不論搖擺條件如何(圖3a)。相反，在第二階段(5-60分鐘)，較高的氣流速增加了ph變化速率：當(dāng)空氣流速由0l/min增加到0.6l/min時(shí)，ph值的變化速率由每小時(shí)0-0.1單位增加到每小時(shí)0.4單位(圖3b)。在無(wú)空氣流時(shí)(0l/min)，在第二階段(5-60分鐘)觀察到最小ph增加(≤0.1單位每小時(shí))，表明在大約5分鐘內(nèi)在cellbag^tm中模擬培養(yǎng)基和頂部空間之間的co2交換達(dá)到平衡。為在頭5分鐘以外實(shí)現(xiàn)額外的ph值增加，可以通過(guò)增加空氣流速以增加頂部空間的清除速率并由此使頂部空間的co2濃度最小化，提高用于co2剝離的驅(qū)動(dòng)力。

圖3c顯示了針對(duì)圖3a數(shù)據(jù)的計(jì)算出的ph變化速率。圖3d顯示的是針對(duì)圖3b數(shù)據(jù)的計(jì)算ph值變化速率。該兩相行為可以通過(guò)高氣體傳質(zhì)速率來(lái)解釋，該高氣體傳質(zhì)速率由波的高表面積和進(jìn)入氣體對(duì)頂部空間的連續(xù)清掃引起。高表面積促進(jìn)了從液相到氣相的迅速的co2傳質(zhì)?？焖俚膫髻|(zhì)是氣相和液相之間差異co2濃度的結(jié)果。這種濃度的差別在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段是最高的，并且隨著更多的co2由液相傳質(zhì)到氣相，這種差別持續(xù)減少。隨著氣相和液相之間的co2濃度差別減少，ph值變化速率也減少。圖3a中，相比第二階段(5-60分鐘)，第一階段(0-5分鐘)的ph值變化速率非常高。在圖3a中顯示的情形下氣體流速保持相同。在co2開(kāi)始傳質(zhì)后，co2的傳質(zhì)速率取決于頂部空間中的co2濃度。對(duì)于同樣的頂部空間清除速率，在開(kāi)始5分鐘后的ph值變化速率是相同的，不管搖擺條件如何。ph值變化速率的計(jì)算值在圖3c中顯示。

當(dāng)變化氣體流速時(shí)，也變化頂部空間的清除速率。對(duì)于不同氣體流速的ph值升高數(shù)據(jù)顯示在圖3b中。對(duì)于這些情況也觀察到兩相行為。然而，在具有相同氣體流速的情況和氣體流速變化的情況之間，差別在于第二階段(5-60分鐘)的ph值變化速率隨氣體流速的不同而變化，相比地在具有相同氣體流速的情況下這是類似的。由于改變氣體流速改變了頂部空間的清除速率，頂部空間的co2以不同的速度被移除。

初始快速的氣體傳質(zhì)是一次性袋的性質(zhì)造成大表面積的結(jié)果。初始?xì)怏w傳質(zhì)主要依賴于搖擺條件(搖擺速度和搖擺角度)。然而，co2從培養(yǎng)基中的持續(xù)移出，依賴于頂部空間co2的濃度。頂部空間的清除速率取決于氣體流速。

實(shí)施例2：細(xì)胞生長(zhǎng)特性研究

a.分批培養(yǎng)

1.初始實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)基：

無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基被用于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)基源自dmem和ham’sf-12的1：1混合物基培養(yǎng)基，其中改變某些組分如氨基酸、鹽、糖和維生素。該培養(yǎng)基缺乏甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷。該培養(yǎng)基包括15mmhepes(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)和2.44g/l碳酸氫鈉。這些鹽的濃度可以變化。培養(yǎng)基用微量元素、重組人胰島素以及細(xì)胞保護(hù)劑lutrolf-68prill補(bǔ)充(可使用等價(jià)物)。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：

自1ml或者10ml存儲(chǔ)在液氮中的瓶庫(kù)，生長(zhǎng)轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)瓶、搖瓶或者攪拌釜生物反應(yīng)器中，將所選擇的冷凍小瓶融化到包含碳酸氫鈉的培養(yǎng)基中。每2-7天，傳代細(xì)胞。該培養(yǎng)物被稱為“seedtrain”。將來(lái)自seedtrain的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一次性袋中以在一次性袋中開(kāi)始細(xì)胞培養(yǎng)。

分析：

血?dú)夥治鰞x(nova400)被用于離線分析。使用這種離線分析儀，測(cè)量了細(xì)胞培養(yǎng)物ph值、溶解氧和co2的分壓、葡萄糖、乳酸和氨的濃度。細(xì)胞生活力和活細(xì)胞濃度(vcc)測(cè)量使用了beckman-coulter’svicell^tmas或者vicell^tmxr。除了細(xì)胞濃度的測(cè)量，通過(guò)記錄收集細(xì)胞體積百分比(％pcv)，也測(cè)量了生物質(zhì)的量。

實(shí)施例3：使用幾種cho細(xì)胞系的詳細(xì)分析

a.分批工藝：

在分批培養(yǎng)的過(guò)程中通過(guò)降低向cellbag^tm供應(yīng)的氣體中的co2濃度，我們應(yīng)該能夠降低起始的高ph值(>7.3)，并且使wavebioreactor^tm系統(tǒng)中隨后的ph值降低最小化。在使用幾種cho細(xì)胞系在wavebioreactor^tm分批培養(yǎng)中測(cè)試不同co2氣體重疊策略后，我們確定了對(duì)于接種和放大階段的“8-5-2”分步策略：在第一天期間，泵入到cellbag^tm中的空氣以8％(v/v)補(bǔ)充co2氣體，第二天以5％(v/v)，隨后以2％(v/v)補(bǔ)充。

基于由無(wú)細(xì)胞研究得到的結(jié)果，我們選擇了下面的搖擺速度、搖擺角度和氣體流速作為我們wavebioreactor^tm分批培養(yǎng)的工藝設(shè)定點(diǎn)：21rpm、10°搖擺角和0.2l/min用于接種；23rpm、10°搖擺角和0.2l/min用于放大階段。為了測(cè)試這些工藝設(shè)定值的可靠性，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種全因子實(shí)驗(yàn)(表1)。當(dāng)工藝條件偏離中心點(diǎn)時(shí)，對(duì)于被測(cè)試的兩種細(xì)胞系，我們觀察到微不足道的對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和pco2曲線的影響，并且培養(yǎng)ph值保持在6.8-7.2和do>50％(圖4)。

表1.在產(chǎn)生mabb和mabc的細(xì)胞系的wavebioreactor^tm分批培養(yǎng)中測(cè)試的條件(圖4)。圍繞3個(gè)工藝參數(shù)——搖擺速度、搖擺角度和進(jìn)入頂部空間的空氣流速，設(shè)計(jì)了全因子實(shí)驗(yàn)，用于分批培養(yǎng)中的接種和擴(kuò)大階段。

b.灌流培養(yǎng)

我們?cè)趙avebioreactor^tm中灌流培養(yǎng)的開(kāi)始嘗試中，在第6天灌流開(kāi)始后，培養(yǎng)ph值通常跌倒6.8以下，do常跌倒30％空氣飽和度以下(圖5)。因?yàn)闊o(wú)細(xì)胞氣體傳質(zhì)研究表明增加空氣流速增加了ph值(圖3)，在不增加灌流速率下為了使ph的下降最小化，我們研究了增加進(jìn)入cellbag^tm的氣體流速的可行性。為了克服do值下降，在灌流開(kāi)始后兩天，我們向進(jìn)入cellbag^tm的空氣流補(bǔ)充30％(v/v)o2。我們選擇這個(gè)時(shí)間是因?yàn)樗鸵郧坝^察到的do下降吻合(圖5)。

實(shí)施例4：分批-灌流工藝

該灌流工藝由兩個(gè)分批步驟和接著的灌流步驟組成。在接種步驟，以目標(biāo)細(xì)胞密度5-7.5x10⁵細(xì)胞/ml，在6l工作體積，接種50l一次性袋。接種后3天，添加新鮮的培養(yǎng)基以將一次性袋子的體積增加到20l用于放大階段。接種步驟和放大步驟構(gòu)成分批步驟。如在分批工藝中所描述的，使用co2步降策略用于這些分批步驟。在3天的放大步驟結(jié)束時(shí)，開(kāi)始灌流。向一次性袋連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基，并且廢培養(yǎng)基被連續(xù)地移出一次性袋子而留下細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)基以每天20公升(每天1體積)的速度灌流。灌流的培養(yǎng)基ph設(shè)定值是在7.2單位。灌流開(kāi)始時(shí)，進(jìn)入氣體中co2的濃度設(shè)定為0。增加頂部空間清除速率以促進(jìn)co2移除。如圖7中所示，頂部空間清除速率的增加要么按照單個(gè)步驟增加或者按照多個(gè)步驟增加。搖擺速度范圍是在19-25rpm之間。搖擺角度范圍是在8-12度之間。溫度維持在37℃。在灌流開(kāi)始后48小時(shí)補(bǔ)充氧氣以滿足細(xì)胞的氧氣需求。在灌流開(kāi)始后48小時(shí)，進(jìn)入氣體中氧氣的濃度設(shè)定在30％。

圖6顯示了分批-灌流工藝的細(xì)胞培養(yǎng)性能(分批步驟(第0-6天)以及灌流步驟(第6-14天)(圖6a)。圖6b顯示的是細(xì)胞存活力百分比。圖7a顯示的是用于三種不同實(shí)驗(yàn)的頂部空間清除速率設(shè)定值。對(duì)于灌流步驟的頂部空間清除速率設(shè)定值遵循不同的曲線(第6-14天)：(1)兩種恒定的空間清除速率：0.02hvm(-▲-)和0.1hvm(◆)；以及(2)逐步增加的頂部空間清除速率：0.007hvm至0.013hvm至0.02hvm(-■-)。單個(gè)步驟增加以及多個(gè)步驟增加均被研究。圖7b顯示的是離線溶解co2濃度。圖6d顯示的是以活細(xì)胞數(shù)(vcc)計(jì)的細(xì)胞生長(zhǎng)。用于圖6和7的圖例：◆,■,▲表示三種不同的運(yùn)作。如圖6c中所示，通過(guò)清除頂部空間調(diào)節(jié)co2，ph可以維持在期望的范圍內(nèi)。

實(shí)施例5：六種cho細(xì)胞系在“8-5-2”條件下的行為

為了測(cè)試該wavebioreactor^tm工藝在支持細(xì)胞生長(zhǎng)和維持ph以及do在期望范圍內(nèi)的可靠性，我們選擇了六種細(xì)胞系，覆蓋通常在我們的內(nèi)部cho細(xì)胞系中觀察到的細(xì)胞生長(zhǎng)以及代謝行為范圍。

以優(yōu)化的工藝條件，在整個(gè)分批和灌流培養(yǎng)階段，所有六種細(xì)胞系生長(zhǎng)，具有高生存力(圖8)。在所有情況下，ph值維持在期望的6.8-7.2范圍內(nèi)，do超過(guò)20％空氣飽和度。

實(shí)施例6：“8-5-2”wavebioreactor^tm法和常規(guī)的攪拌釜生物反應(yīng)器培養(yǎng)之間的比較

為了比較本發(fā)明wavebioreactor^tm工藝和具有ph和do控制的攪拌釜生物反應(yīng)器工藝之間的培養(yǎng)性能，我們?cè)趦蓚€(gè)系統(tǒng)中進(jìn)行了并行培養(yǎng)(圖9)。兩種生物反應(yīng)器系統(tǒng)之間的生長(zhǎng)和生活力曲線類似：在wavebioreactor^tm中和在攪拌釜生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)速度是相當(dāng)?shù)?，?.5天^-1。盡管在wavebioreactor^tm系統(tǒng)中缺乏ph和do在線反饋控制，在兩種生物反應(yīng)器培養(yǎng)中ph和do曲線沒(méi)有顯著差異。

本發(fā)明提供了一種工藝控制方法，用于在wavebioreactor^tm系統(tǒng)中——在分批和灌流模式下運(yùn)作——將培養(yǎng)ph維持在6.8-7.2范圍內(nèi)，do>20％空氣飽和度，而無(wú)需依靠ph和do反饋控制。在鑒定在沒(méi)有ph和do控制的wavebioreactor^tm系統(tǒng)中培養(yǎng)cho細(xì)胞的挑戰(zhàn)后，我們進(jìn)行了無(wú)細(xì)胞研究以確定搖擺速度、搖擺角度和氣體流速對(duì)o2以及co2在wavebioreactor^tm系統(tǒng)中傳質(zhì)的影響。通過(guò)調(diào)整這些工藝參數(shù)以及輸入氣體中co2和o2的濃度，對(duì)于六種重組cho細(xì)胞系的分批和灌流培養(yǎng)，我們維持了培養(yǎng)ph和do在我們的期望范圍內(nèi)。通過(guò)消除對(duì)ph和do探測(cè)器的需求，該方法提供了一種在wavebioreactor^tm體系中更簡(jiǎn)單、更有成本效率的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。還提供了一種在裝有這些探測(cè)器的wavebioreactor^tm中在ph或者do探測(cè)器失效時(shí)用于細(xì)胞培養(yǎng)的替代方法。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所描述的具體實(shí)例僅僅是舉例說(shuō)明性的而不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。本發(fā)明僅僅由后附權(quán)利要求來(lái)限定。

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