專利名稱：用于檢測(cè)整合酶φc31功能的真核細(xì)胞系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)和基因治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，用于檢測(cè)整合酶ΦC31功能和活性的真核細(xì)胞系統(tǒng)及其制備方法。
背景技術(shù)：
噬菌體整合酶ΦC31可將外源核苷酸序列定點(diǎn)整合到哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的特異性位點(diǎn)上，近年來(lái)已成為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)特異性重組操作和基因治療的有用工具。
2000年Calos等人最先進(jìn)行應(yīng)用噬菌體整合酶ΦC31在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中介導(dǎo)定點(diǎn)整合的研究，隨后在小鼠的動(dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)了整合酶ΦC31介導(dǎo)凝血因子IX的基因治療，并在果蠅等動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)了高效率的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建工作，從而開(kāi)辟了基因治療領(lǐng)域的高效定點(diǎn)基因組整合研究的新方向。然而對(duì)于整合酶ΦC31在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)和功能的研究，在其使用pBCBP+質(zhì)粒的基礎(chǔ)上建立的檢測(cè)系統(tǒng)，只能定性的說(shuō)明整合酶ΦC31在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的活性，不能定量的表征不同的酶突變體和環(huán)境因素對(duì)整合酶ΦC31功能的影響。2001年，Kuhn等人建立了小鼠細(xì)胞的整合酶ΦC31的檢測(cè)系統(tǒng)，他們利用整合酶ΦC31介導(dǎo)分子內(nèi)重組的特性，用β-半乳糖苷酶(LacZ)作為標(biāo)記基因，通過(guò)顯微鏡下的計(jì)算顯色的細(xì)胞數(shù)目定量檢測(cè)整合酶ΦC31的活性。該方法可以定量的說(shuō)明整合酶ΦC31在小鼠細(xì)胞中的功能，但是操作步驟繁復(fù)和誤差比較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便的整合酶ΦC31功能和活性檢測(cè)系統(tǒng)及其制備方法。
本發(fā)明提出的整合酶ΦC31功能和活性檢測(cè)系統(tǒng)，是由ΦC31重組報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞系293，然后用新霉素G418篩選，挑選出單克隆細(xì)胞，發(fā)展而成的293-PB{[EGFP]}報(bào)告細(xì)胞系；其中，ΦC31重組報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]是利用pEGFP-N2載體，在增強(qiáng)型煙草花葉病毒啟動(dòng)子(CMVIE)之后，順序插入特異序列attP和attB，然后在其間加上一段牛生長(zhǎng)因子的多聚腺苷酸(BGH polyA)組成。其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1所示。其構(gòu)成元件的順序排列如下增強(qiáng)型煙草花葉病毒啟動(dòng)子(CMVIE)，attP序列(見(jiàn)SEQ.ID NO.1)，牛生長(zhǎng)因子的多聚腺苷酸序列(BGH polyA，見(jiàn)SEQ.ID NO.3)，attB序列(見(jiàn)SEQ.ID NO.2)，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白序列(EGFP)。在整合酶ΦC31活性作用下，半個(gè)attP和半個(gè)attB序列及其之間的牛生長(zhǎng)因子的多聚腺苷酸的序列被刪除，則牛生長(zhǎng)因子的多聚腺苷酸序列的阻斷作用消失，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白得以表達(dá)。
本發(fā)明提出的上述整合酶ΦC31功能和活性檢測(cè)系統(tǒng)的制備方法如下1.構(gòu)建重組報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]整合酶ΦC31可以識(shí)別的特異性的DNA序列(attP序列見(jiàn)SEQ.ID NO.1和attB序列見(jiàn)SEQ.ID NO.2)，當(dāng)attP和attB序列同時(shí)位于一個(gè)DNA分子中，并且排列的方向相同時(shí)，整合酶ΦC31可以介導(dǎo)分子內(nèi)的重組，刪除attP和attB序列之間的DNA片斷。根據(jù)上述原理，本發(fā)明構(gòu)建了包含有特異性序列attP和attB的報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]。使用常規(guī)方法(分子克隆指南，1998年第二版，薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社)，首先利用pEGFP-N2載體(Clontech公司產(chǎn)品)，在增強(qiáng)型煙草花葉病毒啟動(dòng)子CMVIE之后，順序插入attP和attB序列，然后在其間加上一段牛生長(zhǎng)因子的多聚腺苷酸BGH polyA，用來(lái)阻斷attB序列后的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)。當(dāng)存在活性的整合酶ΦC31時(shí)，經(jīng)過(guò)重組反應(yīng)，半個(gè)attP和半個(gè)attB序列以及他們之間的DNA片斷BGH polyA被刪除，而從其后的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白得到表達(dá)，表現(xiàn)綠色熒光(見(jiàn)圖1)。
2.建立穩(wěn)定的檢測(cè)整合酶ΦC31的真核細(xì)胞系293-PB{[EGFP]}利用上述構(gòu)建的ΦC31重組報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]使用常規(guī)方法(分子克隆指南，1998年第二版，薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社)，轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞系293，然后用新霉素G418篩選，挑選出單克隆細(xì)胞，發(fā)展成為293[PB-EGFP]報(bào)告細(xì)胞系。當(dāng)沒(méi)有ΦC31整合酶時(shí)，該細(xì)胞系沒(méi)有綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)；當(dāng)存在有活性的ΦC31整合酶時(shí)，該細(xì)胞系有綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，表現(xiàn)出綠色熒光，可以在熒光顯微鏡觀察(見(jiàn)圖2)和用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)量(圖3)，從而評(píng)估出轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)化等多種途徑表達(dá)的ΦC31整合酶，及其突變體等的活性和功能的定量比較。
本發(fā)明利用ΦC31整合酶介導(dǎo)分子內(nèi)重組的原理，制備了新型的人類胚胎腎細(xì)胞(293)的真核細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在活性的ΦC31整合酶存在時(shí)有綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，表現(xiàn)出綠色熒光。可以用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)量和強(qiáng)度，從而計(jì)算出不同途徑(轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)化等)表達(dá)的ΦC31整合酶，及其突變體等在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能的定量比較和定性說(shuō)明。該檢測(cè)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，步驟少，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，是ΦC31整合酶在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)用的重要評(píng)估定量系統(tǒng)。


圖1為重組報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]的構(gòu)成及其受整合酶ΦC31作用后的機(jī)理簡(jiǎn)圖。
圖2為熒光顯微鏡檢測(cè)整合酶ΦC31功能的真核細(xì)胞的結(jié)果檢測(cè)整合酶ΦC31的真核細(xì)胞在轉(zhuǎn)染整合酶ΦC31的cDNA后，48小時(shí)后熒光顯微鏡下的結(jié)果(見(jiàn)圖2-A)，60小時(shí)后熒光顯微鏡下的結(jié)果(見(jiàn)圖2-B)。淡灰色表示DAPI染色的細(xì)胞核，亮白色表示表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞。
圖3為流式細(xì)胞儀檢測(cè)整合酶ΦC31功能的真核細(xì)胞的結(jié)果檢測(cè)整合酶ΦC31的真核細(xì)胞在沒(méi)有整合酶ΦC31表達(dá)，有整合酶ΦC31的表達(dá)，48小時(shí)后流式細(xì)胞儀的結(jié)果(圖3-A，B)。陽(yáng)性對(duì)照樣品是只轉(zhuǎn)染帶綠色熒光蛋白表達(dá)的質(zhì)粒(見(jiàn)圖3-C)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例子，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例子僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如薩姆布魯克等人(分子克隆指南實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，1998年第二版，科學(xué)出版社)，又如斯佩克特等人(細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，1998年第二版，科學(xué)出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
1、構(gòu)建重組報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]通過(guò)常規(guī)的DNA重組技術(shù)，重組報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]的構(gòu)建按照以下的步驟首先將attB克隆到pEGFP-N2載體(Clontech公司產(chǎn)品)上，以EcoRI-5′-ACCGGAATTCGTCGACATGCCCGCC-3′和KpnI-5′-AATAACGGTACCGTCGACGATGTAGGTC-3′作為引物，pBCBP+(Calos等構(gòu)建)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增attB序列。用EcoRI和KpnI分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pEGFP-N2進(jìn)行雙酶切，分別回收DNA片段，并用T4連接酶(TAKARA公司產(chǎn)品)連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣法大腸桿細(xì)菌Top10，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過(guò)夜后，篩選陽(yáng)性克隆后用限制性內(nèi)切酶鑒定，并進(jìn)行DNA序列測(cè)定(Invitrogen公司)。DNA序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的attB的DNA序列與SEQ.ID NO.1所示的1-240bp完全相同。命名為attB-EGFP-N2質(zhì)粒。
其次，將attP克隆到attB-EGFP-N2質(zhì)粒上，以SpeI-5′-CTAGACTAGTTCGCGCTCGCG-3′和BamHI-5′-CGCGGATCCATCCCCAGAAGCGGTTTTCGGGAG-3′作為引物。pBCBP+(Calos等構(gòu)建)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增attP序列。用SpeI和BamHI分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒attB-EGFP-N2進(jìn)行雙酶切，分別回收DNA片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，篩選陽(yáng)性克隆后用限制性內(nèi)切酶鑒定，進(jìn)行DNA序列測(cè)定結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的attP的DNA序列與SEQ.ID NO.2所示的1-283bp完全相同。命名為attP-attB-EGFP-N2質(zhì)粒。
最后，將BGH polyA多核苷酸序列克隆到attP-attB-EGFP-N2質(zhì)粒上，以5′-CCGCTCGAGCATGCATCTAG-3′和5′-CCGGAATTCCAGCTGGTTCTTTCCGCCTC-3′為引物，pCDNA3.0(Invitrogen公司產(chǎn)品)為模板，PCR擴(kuò)增BGH polyA的序列。用XhoI和ECoRI分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒attP-attB-EGFP-N2進(jìn)行雙酶切，分別回收DNA片段，用TG連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，篩選陽(yáng)性克隆后用限制性內(nèi)切酶鑒定，進(jìn)行DNA序列測(cè)定分析結(jié)果表明BGH polyA的DNA序列與SEQ.ID NO.3所示的1-329bp完全相同。這樣就構(gòu)建出了CMVIE-attP-BGH polyA-attB-EGFP的重組報(bào)告載體，命名為PB[EGFP]質(zhì)粒。(見(jiàn)圖1)2.篩選檢測(cè)ΦC31重組酶功能的穩(wěn)定的單克隆真核細(xì)胞系293PB[EGFP]通過(guò)常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，檢測(cè)整合酶ΦC31功能的真核細(xì)胞的制備按照如下的方法人胚胎腎細(xì)胞293細(xì)胞系來(lái)源于美國(guó)細(xì)胞保存中心(ATCC，Rockville，MD)，在高糖的10％牛血清的DMEM(Gibcol產(chǎn)品)細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)3.5CM的細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞鋪板率在70％以上時(shí)，利用脂質(zhì)體(Invitrogen公司產(chǎn)品)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PB[EGFP]后，經(jīng)過(guò)0.5mg/ml新霉素(G418)篩選16天，挑選出若干個(gè)單克隆的細(xì)胞系。對(duì)那些單克隆報(bào)告細(xì)胞系293PB[EGFP]用表達(dá)整合酶ΦC31cDNA轉(zhuǎn)染表現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞作為驗(yàn)證方法，確定穩(wěn)定的單克隆報(bào)告細(xì)胞系293PB[EGFP]的建立。在沒(méi)有整合酶ΦC31存在時(shí)，報(bào)告細(xì)胞在熒光顯微鏡下顯示陰性的結(jié)果，在存在活性的整合酶ΦC31時(shí)，報(bào)告細(xì)胞在熒光顯微鏡下顯示陽(yáng)性的結(jié)果(見(jiàn)圖2-A和B)。
3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)整合酶ΦC31功能的真核細(xì)胞的結(jié)果檢測(cè)整合酶ΦC31功能的真核細(xì)胞細(xì)胞293PB[EGFP]，在高糖的DMEM(Gibcol產(chǎn)品)細(xì)胞培養(yǎng)液中，含氨芐青霉素50ug/ml，鏈霉素25ug/ml，小牛血清10％，0.5mg/ml新霉素(G418)，在5％CO2，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)3.5CM的細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞鋪板率達(dá)到90％時(shí)，利用脂質(zhì)體試劑(Invitrogen公司產(chǎn)品)混合4ug的pCMVint質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，4-6小時(shí)后換新的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48-60小時(shí)后，PBS清洗細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞后，離心收獲細(xì)胞。同時(shí)設(shè)立陰性和陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)對(duì)照，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，沒(méi)有整合酶ΦC31表達(dá)細(xì)胞顯示GFP陰性結(jié)果，有整合酶ΦC31表達(dá)細(xì)胞顯示GFP陰性結(jié)果，熒光細(xì)胞的數(shù)量與比率可以定量的表示整合酶ΦC31在真核細(xì)胞中的活性與功能(見(jiàn)圖3)。
1.SEQ.ID NO.1attB多核苷酸序列1 GTCGACATGC CCGCCGTGAC CGTCGAGAAC CCGCTGACGC TGCCCCGCGT ATCCGCACCC61 GCCGACGCCG TCGCACGTCC CGTGCTCACC GTGACCACCG CGCCCAGCGG TTTCGAGGGC121 GAGGGCTTCC CGGTGCGCCG CGCGTTCGCC GGGATCAACT ACCGCCACCT CGACCCGTTC181 ATCATGATGG ACCAGATGGG TGAGGTGGAG TACGCGCCCG GGGAGCCCAA GGGCACGCCC241 TGGCACCCGC ACCGCGGCTT CGAGACCGTG ACCTACATCG TCGAC2.SEQ.ID NO.2attP多核苷酸序列1 TACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACG61 GGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCA121 ACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCG181 TGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGTC3.SEQ.ID NO.3BGH polyA多核苷酸序列1 CTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGC61 TGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTG121 CCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATT181 GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGC241 AAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCT301 TCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGAATTC
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)整合酶ΦC31功能的真核細(xì)胞系統(tǒng)，其特征在于是由ΦC31重組報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞系293，然后用新霉素G418篩選，挑選出單克隆細(xì)胞，發(fā)展而成的293-PB{[EGFP]}報(bào)告細(xì)胞系；其中，ΦC31重組報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]是利用pEGFP-N2載體，在增強(qiáng)型煙草花葉病毒啟動(dòng)子CMVIE之后，順序插入特異序列attP和attB，然后在其間加上一段牛生長(zhǎng)因子的多聚腺苷酸BGH polyA組成。
2.一種如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)整合酶ΦC31功能的真核細(xì)胞系統(tǒng)的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)構(gòu)建重組報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]首先利用pEGFP-N2載體，在增強(qiáng)型煙草花葉病毒啟動(dòng)子CMVIE之后，順序插入attP和attB序列，然后在其間加上一段牛生長(zhǎng)因子的多聚腺苷酸BGH polyA；(2)建立穩(wěn)定的檢測(cè)整合酶ΦC31的真核細(xì)胞系293-PB{[EGFP]}利用上述構(gòu)建的ΦC31重組報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]，轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞系293，然后用新霉素G418篩選，挑選出單克隆細(xì)胞，發(fā)展成為293[PB-EGFP]報(bào)告細(xì)胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述構(gòu)建重組報(bào)告質(zhì)粒PB[EGFP]的步驟如下首先將attB克隆到pEGFP-N2載體上，以EcoRI-5′-ACCGGAATTCGTCGACATGCCCGCC-3′和KpnI-5′-AATAACGGTACCGTCGACGATGTAGGTC-3′作為引物，pBCBP+質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增attB序列；用EcoRI和KpnI分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pEGFP-N2進(jìn)行雙酶切，分別回收DNA片段，并用T4連接酶連接，命名為attB-EGFP-N2質(zhì)粒；其次，將attP克隆到attB-EGFP-N2質(zhì)粒上，以SpeI-5′-CTAGACTAGTTCGCGCTCGCG-3′和BamHI-5′-CGCGGATCCATCCCCAGAAGCGGTTTTCGGGAG-3′作為引物，pBCBP+質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增attP序列；用SpeI和BamHI分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒attB-EGFP-N2進(jìn)行雙酶切，分別回收DNA片段，并用T4連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，命名為attP-attB-EGFP-N2質(zhì)粒；最后，將BGH polyA多核苷酸序列克隆到attP-attB-EGFP-N2質(zhì)粒上，以5′-CCGCTCGAGCATGCATCTAG-3′和5′-CCGGAATTCCAGCTGGTTCTTTCCGCCTC-3′為引物，pCDNA3.0為模板，PCR擴(kuò)增BGH polyA的序列；用XhoI和ECoRI分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒attP-attB-EGFP-N2進(jìn)行雙酶切，分別回收DNA片段，用TG連接酶連接；命名為PB[EGFP]質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)和基因治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)整合酶ΦC31功能的真核細(xì)胞系統(tǒng)及其制備方法。該檢測(cè)系統(tǒng)由重組報(bào)告PB[EGFP]轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞系293后用G418篩選，挑選出單克隆細(xì)胞而獲得，其中，PB[EGFP]是利用pEGFP－N2載體，在增強(qiáng)型煙草花葉病毒啟動(dòng)子(CMVIE)之后，順序插入特異序列attP和attB，然后在其間加上一段牛生長(zhǎng)因子的多聚腺苷酸而構(gòu)成。該細(xì)胞系統(tǒng)可以評(píng)估出轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等多種途徑表達(dá)的ΦC31整合酶，及其突變體等的活性和功能。該檢測(cè)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，是整合酶ΦC31在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)用的重要定量評(píng)估系統(tǒng)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1827781SQ200510112200
公開(kāi)日2006年9月6日 申請(qǐng)日期2005年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者張茂祥, 朱煥章, 陳金中, 王韌誠(chéng), 賈韋國(guó), 薛京倫 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)