本發(fā)明涉及一種梵凈山冷杉纖維素降解菌的篩選方法，屬于土壤改良技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

梵凈山冷杉(abiesfanjingshanensis)，國家一級(jí)保護(hù)植物，為中國貴州省特有種，亦為第四紀(jì)殘遺植物。僅殘存于梵凈山的局部地段，分布區(qū)極其狹窄，數(shù)量稀少，加上結(jié)實(shí)率低，自然更新不良，需加以保護(hù)才不致滅絕。被列入《中國植物紅皮書》并成為國家一級(jí)保護(hù)植物，全球重點(diǎn)保護(hù)的針葉樹種。

梵凈山冷杉屬陰性樹種，耐蔭性強(qiáng)，喜陰濕，常綠喬木，高22m，胸徑65cm，冬芽卵球形，葉在小枝下面呈梳狀，在上面密集，向外向上伸展，葉上有樹脂道2個(gè)，邊生或近邊生，球果圓柱狀長圓形，直立，成熟時(shí)深褐色，長5～6cm，直徑約4cm，種子長卵圓形，微扁，種翅倒楔形，褐色或灰褐色，適宜于夏涼冬冷，雨量充沛亞熱帶季風(fēng)山地氣候，土壤為山地黃棕壤，較濕潤肥沃，ph值4.5～6.5。耐蔭性強(qiáng)，喜冷濕，一般多為純林，也有混交林，通常5～6月開花，球果10～11月成熟。

梵凈山冷杉林在梵凈山東北坡的亞高山暗針葉林中，常為片狀集中分布，形成優(yōu)勢種群，由于冷杉具有較為稠密的林冠，針葉較為寬，樹梢通直，樹冠成塔形等特性。結(jié)實(shí)年齡在林緣約40～50年，結(jié)實(shí)周期4～5年，且球果出籽率少，采集的梵凈山冷杉球果中種子的胚極少發(fā)育，多為空癟的膜狀物。在梵凈山，由于林地覆蓋物較厚，嚴(yán)重影響幼苗、幼樹的生長與發(fā)育，林下雖有小苗，卻極少見到小樹，導(dǎo)致天然更新較差，幼苗長勢弱。

目前我國還未見梵凈山冷杉纖維素降解菌的篩選方法，梵凈山冷杉林地覆蓋物清理主要依賴于自然降解輔以人工清理，嚴(yán)重影響梵凈山冷杉的自然擴(kuò)繁與天然更新，使得梵凈山冷杉林處于瀕危滅絕的狀態(tài)。因此篩選高效的梵凈山冷杉纖維素降解菌，對改善梵凈山冷杉林地生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)梵凈山冷杉的自然擴(kuò)繁與天然更新具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有的纖維素降解菌污染率高、生長周期長、工藝復(fù)雜的問題，提供一種梵凈山冷杉纖維素降解菌篩選方法，使得制成的梵凈山冷杉纖維素降解菌工藝簡便、污染少、操作簡單、周期短，極大改善梵凈山冷杉林地生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)梵凈山冷杉的自然擴(kuò)繁與天然更新。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種梵凈山冷杉纖維素降解菌的篩選方法，包括以下步驟：

(1)初選培養(yǎng)基制備：按重量份數(shù)計(jì)算，將粉碎的梵凈山冷杉針葉50～80份、梵凈山冷杉枯枝60～80份、梵凈山冷杉樹皮70～90份、胰蛋白胨6～8份、維生素b60.000025～0.000035份、磷酸氫二鉀0.50～0.70份，氯化鈉0.55～0.65份、硫酸鎂0.50～0.60份、氯化鈣0.55～0.65份、牛肉浸膏0.55～0.70份以及氯霉素0.008～0.010份加水定容至1000份，控制ph值為5.0～6.0，在110～130℃下用壓力為0.1～0.15mpa的高壓蒸汽滅菌25～30min，然后置于24～28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，獲得無菌生長初選培養(yǎng)基留存?zhèn)溆茫?/p>

(2)分離培養(yǎng)基制備：按重量份數(shù)計(jì)算，將梵凈山冷杉針葉150～200份洗凈以及切成塊狀的去皮馬鈴薯150～200份加入1000份水中，煮沸30～40min，用紗布濾去梵凈山冷杉針葉和馬鈴薯殘?jiān)脼V液，在濾液中加入蔗糖15～25g和瓊脂15～20g，然后加水定容至1000份，控制ph值為5.0～6.0，在110～130℃下用壓力為0.1～0.15mpa的高壓蒸汽滅菌25～30min，然后置于24～28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，獲得無菌生長的分離培養(yǎng)基留存?zhèn)溆茫?/p>

(3)纖維素降解菌篩選：將初選培養(yǎng)基及接種工具入超凈工作臺(tái)中，采用紫外燈滅菌30min，然后取腐熟梵凈山冷杉林地覆蓋物20～30g放入初選培養(yǎng)基中；

(4)菌種培養(yǎng)：將接種好的初選培養(yǎng)基置于28℃、110～130r/min的菌種培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)6～8天；

(5)菌種純化：挑取形成黃色的粘稠發(fā)酵液，表面為球形，中間隆起，表面光滑濕潤的較大菌落，用接種環(huán)取一環(huán)劃線于分離平板培養(yǎng)基上25～30℃恒溫培養(yǎng)24～36h，直至形成單菌落，再將獲得單菌落的纖維素降解菌轉(zhuǎn)接在pda斜面培養(yǎng)基上，以便備用，每3月轉(zhuǎn)接一次，作為傳代菌種。

上述方法中，所述的初選培養(yǎng)基采用含水量為30％～40％的梵凈山冷杉針葉、枯枝以及樹皮作為碳源，粗硬類的枯枝、樹皮單獨(dú)挑出，粉碎至2～5毫米，細(xì)軟類的針葉粉碎至1～2厘米。因此，30％～40％的水份調(diào)控有利于樹枝分解，更有利于纖維素變成小分子有機(jī)物而被微生物吸收；同時(shí)，粉碎枯枝以及針葉有利于機(jī)物微生物和含糖有機(jī)物充分接觸，并產(chǎn)生更多空隙有利于微生物呼吸作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明中的初選培養(yǎng)基采用梵凈山冷杉針葉、枯枝以及樹皮作為碳源，制作的梵凈山冷杉纖維素降解菌克服現(xiàn)有的維素降解菌污染率高、生長周期長、工藝復(fù)雜的問題，使得工藝簡便、菌種純、污染少、操作簡單、周期短。本發(fā)明縮短了林地覆蓋物降解周期，提高梵凈山冷杉林土壤孔隙度10～12％，提高土壤團(tuán)聚體5～8％，增加土壤含水量5～7％，降低土壤容重8％，降低生產(chǎn)成本20％，促進(jìn)梵凈山冷杉的自然擴(kuò)繁與天然更新。本發(fā)明專利的方法可實(shí)現(xiàn)梵凈山冷杉纖維素降解菌的規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，為貴州省特有物種-梵凈山冷杉的保育與擴(kuò)繁提供一條新路。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

本發(fā)明的一種梵凈山冷杉纖維素降解菌的篩選方法，包括以下步驟：

(1)初選培養(yǎng)基制備：按重量份數(shù)計(jì)算，將粉碎的梵凈山冷杉針葉50份、梵凈山冷杉枯枝60份、梵凈山冷杉樹皮70份、胰蛋白胨6份、維生素b60.000025份、磷酸氫二鉀0.50份，氯化鈉0.55份、硫酸鎂0.50份、氯化鈣0.55份、牛肉浸膏0.55份以及氯霉素0.008份加水定容至1000份，控制ph值為5.0，在110℃下用壓力為0.1mpa的高壓蒸汽滅菌25min，然后置于24℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，獲得無菌生長初選培養(yǎng)基留存?zhèn)溆茫?/p>

(2)分離培養(yǎng)基制備：按重量份數(shù)計(jì)算，將梵凈山冷杉針葉150份洗凈以及切成塊狀的去皮馬鈴薯150份加入1000份水中，煮沸30min，用紗布濾去梵凈山冷杉針葉和馬鈴薯殘?jiān)脼V液，在濾液中加入蔗糖15g和瓊脂15g，然后加水定容至1000份，控制ph值為5.0，在110℃下用壓力為0.1mpa的高壓蒸汽滅菌25min，然后置于24℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，獲得無菌生長的分離培養(yǎng)基留存?zhèn)溆茫?/p>

(3)纖維素降解菌篩選：將初選培養(yǎng)基及接種工具入超凈工作臺(tái)中，采用紫外燈滅菌30min，然后取腐熟梵凈山冷杉林地覆蓋物20g放入初選培養(yǎng)基中；

(4)菌種培養(yǎng)：將接種好的初選培養(yǎng)基置于28℃、110r/min的菌種培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)6天；

(5)菌種純化：挑取形成黃色的粘稠發(fā)酵液，表面為球形，中間隆起，表面光滑濕潤的較大菌落，用接種環(huán)取一環(huán)劃線于分離平板培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)24h，直至形成單菌落，再將獲得單菌落的纖維素降解菌轉(zhuǎn)接在pda斜面培養(yǎng)基上，以便備用，每3月轉(zhuǎn)接一次，作為傳代菌種。

本發(fā)明縮短了林地覆蓋物降解周期，提高梵凈山冷杉林土壤孔隙度10％，提高土壤團(tuán)聚體5％，增加土壤含水量5％，降低土壤容重8％，降低生產(chǎn)成本20％，促進(jìn)梵凈山冷杉的自然擴(kuò)繁與天然更新。

實(shí)施例2

本發(fā)明的一種梵凈山冷杉纖維素降解菌的篩選方法，包括以下步驟：

(1)初選培養(yǎng)基制備：按重量份數(shù)計(jì)算，將粉碎的梵凈山冷杉針葉65份、梵凈山冷杉枯枝70份、梵凈山冷杉樹皮80份、胰蛋白胨7份、維生素b60.000030份、磷酸氫二鉀0.60份，氯化鈉0.60份、硫酸鎂0.55份、氯化鈣0.60份、牛肉浸膏0.65份以及氯霉素0.009份加水定容至1000份，控制ph值為5.5，在120℃下用壓力為0.12mpa的高壓蒸汽滅菌28min，然后置于26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，獲得無菌生長初選培養(yǎng)基留存?zhèn)溆茫?/p>

(2)分離培養(yǎng)基制備：按重量份數(shù)計(jì)算，將梵凈山冷杉針葉160份洗凈以及切成塊狀的去皮馬鈴薯180份加入1000份水中，煮沸35min，用紗布濾去梵凈山冷杉針葉和馬鈴薯殘?jiān)脼V液，在濾液中加入蔗糖20g和瓊脂18g，然后加水定容至1000份，控制ph值為5.5，在120℃下用壓力為0.12mpa的高壓蒸汽滅菌28min，然后置于26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，獲得無菌生長的分離培養(yǎng)基留存?zhèn)溆茫?/p>

(3)纖維素降解菌篩選：將初選培養(yǎng)基及接種工具入超凈工作臺(tái)中，采用紫外燈滅菌30min，然后取腐熟梵凈山冷杉林地覆蓋物20～30g放入初選培養(yǎng)基中；

(4)菌種培養(yǎng)：將接種好的初選培養(yǎng)基置于28℃、120r/min的菌種培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)7天；

(5)菌種純化：挑取形成黃色的粘稠發(fā)酵液，表面為球形，中間隆起，表面光滑濕潤的較大菌落，用接種環(huán)取一環(huán)劃線于分離平板培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)30h，直至形成單菌落，再將獲得單菌落的纖維素降解菌轉(zhuǎn)接在pda斜面培養(yǎng)基上，以便備用，每3月轉(zhuǎn)接一次，作為傳代菌種。

本發(fā)明縮短了林地覆蓋物降解周期，提高梵凈山冷杉林土壤孔隙度11％，提高土壤團(tuán)聚體7％，增加土壤含水量6％，降低土壤容重8％，降低生產(chǎn)成本20％，促進(jìn)梵凈山冷杉的自然擴(kuò)繁與天然更新。

實(shí)施例3

本發(fā)明的一種梵凈山冷杉纖維素降解菌的篩選方法，包括以下步驟：

(1)初選培養(yǎng)基制備：按重量份數(shù)計(jì)算，將粉碎的梵凈山冷杉針葉80份、梵凈山冷杉枯枝80份、梵凈山冷杉樹皮90份、胰蛋白胨8份、維生素b60.000035份、磷酸氫二鉀0.70份，氯化鈉0.65份、硫酸鎂0.60份、氯化鈣0.65份、牛肉浸膏0.70份以及氯霉素0.010份加水定容至1000份，控制ph值為6.0，在130℃下用壓力為0.15mpa的高壓蒸汽滅菌30min，然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，獲得無菌生長初選培養(yǎng)基留存?zhèn)溆茫?/p>

(2)分離培養(yǎng)基制備：按重量份數(shù)計(jì)算，將梵凈山冷杉針葉200份洗凈以及切成塊狀的去皮馬鈴薯200份加入1000份水中，煮沸40min，用紗布濾去梵凈山冷杉針葉和馬鈴薯殘?jiān)脼V液，在濾液中加入蔗糖25g和瓊脂20g，然后加水定容至1000份，控制ph值為6.0，在130℃下用壓力為0.15mpa的高壓蒸汽滅菌30min，然后置于24～28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，獲得無菌生長的分離培養(yǎng)基留存?zhèn)溆茫?/p>

(3)纖維素降解菌篩選：將初選培養(yǎng)基及接種工具入超凈工作臺(tái)中，采用紫外燈滅菌30min，然后取腐熟梵凈山冷杉林地覆蓋物30g放入初選培養(yǎng)基中；

(4)菌種培養(yǎng)：將接種好的初選培養(yǎng)基置于28℃、130r/min的菌種培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)8天；

(5)菌種純化：挑取形成黃色的粘稠發(fā)酵液，表面為球形，中間隆起，表面光滑濕潤的較大菌落，用接種環(huán)取一環(huán)劃線于分離平板培養(yǎng)基上30℃恒溫培養(yǎng)36h，直至形成單菌落，再將獲得單菌落的纖維素降解菌轉(zhuǎn)接在pda斜面培養(yǎng)基上，以便備用，每3月轉(zhuǎn)接一次，作為傳代菌種。

本發(fā)明縮短了林地覆蓋物降解周期，提高梵凈山冷杉林土壤孔隙度12％，提高土壤團(tuán)聚體8％，增加土壤含水量7％，降低土壤容重8％，降低生產(chǎn)成本20％，促進(jìn)梵凈山冷杉的自然擴(kuò)繁與天然更新。