本發(fā)明涉及生物制藥領域，主要涉及一種水蛭素的分離方法。

背景技術：

血栓是導致心腦血管疾病發(fā)生的主要原因，而凝血酶是導致血栓形成的主要原因。水蛭素是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凝血酶特異性抑制劑，能與凝血酶特異性結合使之喪失凝血活力。目前，水蛭素主要以日本醫(yī)蛭、菲牛蛭、歐洲醫(yī)用水蛭、印度水蛭、亞馬遜巨型水蛭等為原料提取。臨床實驗表明，水蛭素既能使血栓融化從而消除或緩解病情，也能防止血栓形成，具有極好的預防和治療血栓性心血管疾病的效果。

目前，國內(nèi)外提取水蛭素的方法有多種。例如1970年markwardt采用的乙醇分級沉淀、陽離子交換、凝膠過濾以及陰離子交換等步驟獲得水蛭素。中國專利—醫(yī)用天然水蛭素的提取方法（申請?zhí)?2107076）是將水蛭搗碎成漿狀，加熱，用冰醋酸調(diào)ph值，冷卻至室溫，用na2co3溶液調(diào)節(jié)ph值，離心收集濾液，沉淀用生理鹽水浸提2~3次，離心收集濾液，合并濾液，透析，透析液用乙醇沉淀，收集沉淀，低溫干燥的水蛭素。這些工藝存在提取步驟繁瑣、水蛭利用率低、水蛭素的活性低等問題。

因此，現(xiàn)有技術還有待于改進和發(fā)展。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種水蛭素的分離方法，旨在解決現(xiàn)有水蛭素的提取方法存在的提取步驟繁瑣、水蛭利用率低、水蛭素的活性低等問題。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種水蛭素的分離方法，其中，包括以下步驟：

在水蛭的唾液或胃液中加入鹽水進行稀釋；

在37℃～100℃水浴加熱3～300min，使樣品的溫度加熱至36~38℃；

將樣品轉(zhuǎn)移至帶有濾膜的離心管中進行離心處理，濾膜的截留分子量為5000~10000kda；

將離心得到的濾液，靜置，取上清液；

對上清液進行冷凍干燥，得到水蛭素凍干粉。

所述的水蛭素的分離方法，其中，鹽水的添加量為唾液或胃液的總體積的0.4~20倍，鹽水的濃度為0.1~68%。

所述的水蛭素的分離方法，其中，所述鹽水采用生理鹽水。

所述的水蛭素的分離方法，其中，所述水浴加熱溫度設置為37~50℃。

所述的水蛭素的分離方法，其中，離心過程中，轉(zhuǎn)速1000~8000rpm，離心時間為1~100min。

所述的水蛭素的分離方法，其中，冷凍干燥過程，是在-40℃條件下，冷凍5h～100h。

有益效果：本發(fā)明的水蛭素的分離方法，步驟簡單，效率高，水蛭素的活性高，可以達到400u/g以上；只需采用水蛭的唾液或胃液即可完成水蛭素的分離，無需殺死水蛭，大大降低了分離成本，提高水蛭的利用率；完全不需要采用有毒的溶劑，只需采用生理鹽水即可完成分離，降低分離成本，同時保證藥物的純正，而且對環(huán)境無污染，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種水蛭素的分離方法，為使本發(fā)明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明所提供的水蛭素的分離方法，以水蛭的唾液或胃液為提取對象，水蛭可重復使用，大大提高水蛭的利用率并降低水蛭素的制作成本。而且，本發(fā)明所提供的分離方法，步驟簡單，水蛭素含量和活性高。

具體地，本發(fā)明所提供的水蛭素的分離方法，包括以下步驟：

稀釋：在水蛭的唾液或胃液中加入鹽水進行稀釋；

水浴加熱：在37℃～100℃水浴加熱3～300min，使樣品的溫度加熱至36~38℃；

濾膜離心：將樣品轉(zhuǎn)移至帶有濾膜的離心管中進行離心處理，濾膜的截留分子量為5000~10000kda；

靜置：將離心得到的濾液，靜置，取上清液；

冷凍干燥：對上清液進行冷凍干燥，得到水蛭素凍干粉。

其中，在稀釋步驟中，采用鹽水對水蛭的唾液或胃液進行稀釋，使水蛭素便于分離。鹽水的添加量為唾液或胃液的總體積的0.4~20倍，鹽水的濃度可以為0.1~68%，優(yōu)選地，所述鹽水采用生理鹽水。

在水浴加熱步驟中，是為了使樣品的溫度加熱至37.5℃左右，其加熱的作用也是為了使水蛭素便于分離。在水浴加熱的過程中，優(yōu)選為對樣品進行攪拌，使樣品受熱均勻，提高分離效率。水浴加熱的時間和溫度根據(jù)實際環(huán)境溫度進行控制，環(huán)境溫度低或水浴溫度低則加熱時間長，環(huán)境溫度高或水浴溫度高則加熱時間短。優(yōu)選地，為了保證樣品質(zhì)量，所述水浴加熱溫度設置為37~50℃。

在濾膜離心和靜置步驟中，水蛭素的大小為7000kda左右，因此先采用濾膜截留比水蛭素大的分子，可以截留懸浮雜質(zhì)、粘度大的物質(zhì)以及分子量在百萬級的大分子，過濾掉這些酶類物質(zhì)，酶類物質(zhì)均能破壞水蛭素的化學結構而致使其活性降低進而影響水蛭素的療效；由于水蛭素的浮力較大浮于上清液中，而剩余的小分子雜質(zhì)浮力較小會沉于底部，因此，離心完畢后取濾液靜置一段時間，即可得到溶解有水蛭素的上清液。在冷凍干燥前通過濾膜和靜置去除大分子雜質(zhì)和小分子雜質(zhì)，使得冷凍干燥步驟得到的水蛭素干粉純度高。在離心過程中，轉(zhuǎn)速可以為1000~8000rpm，優(yōu)選為轉(zhuǎn)速1000~2500rpm，離心時間為1~100min，離心時間可以根據(jù)樣品量和離心速度調(diào)節(jié)。同時，采用濾膜離心，也可以大大提高分離效率，減少分離所需時間。

在冷凍干燥中，是在-40℃條件下，冷凍5h～100h，得到含有水蛭素的凍干粉。

采用本發(fā)明所提供的水蛭素的分離方法，步驟簡單，效率高，水蛭素的活性高，可以達到100~800u/g；同時完全不需要采用有毒的溶劑，保證藥物的純正，而且對環(huán)境無污染，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

取水蛭唾液（或水蛭胃液）180ml，加入生理鹽水200ml，50℃水浴攪拌10min；將樣品轉(zhuǎn)移至帶有濾膜的離心管中進行離心處理，濾膜的截留分子量為5000kda，2000rpm～2500rpm離心10min；靜置20min，取上清液冷凍干燥（-40℃，35h），得水蛭素凍干粉10g。

實施例2

取水蛭唾液（或水蛭胃液）440ml，加入生理鹽水2000ml，37℃水浴攪拌10min；將樣品轉(zhuǎn)移至帶有濾膜的離心管中進行離心處理，濾膜的截留分子量為7000kda，2000rpm～2500rpm離心10min；靜置20min，取上清液冷凍干燥（-40℃，20h），得水蛭素凍干粉23g。

實施例3

取水蛭唾液（或水蛭胃液）500ml，加入生理鹽水250ml，40℃水浴攪拌10min；將樣品轉(zhuǎn)移至帶有濾膜的離心管中進行離心處理，濾膜的截留分子量為10000kda，2000rpm～2500rpm離心10min；靜置20min，取上清液冷凍干燥（-40℃，10h），得水蛭素凍干粉25g。

將實施例1~3制備得打偶的水蛭素凍干粉進行活性測試，測試方法參考《中華人民共和國藥典》（一部）.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015，p84。

精密稱量取水蛭素供試樣品1g，用0.9%nacl溶解稀釋成5ml。低溫條件下，5000r.min^-1，離心20min。精密量取提取液100μl，置試管(8mmx38mm)中，加入含0.5％(牛)纖維蛋白原(以凝固物計)的tris—hcl緩沖液200μl，搖勻，置水浴(37±0.5)℃中緩緩滴加凝血酶溶液至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按下式計算。

式中水蛭素含量單位為u/g；c1—凝血酶溶液的濃度，u/ml；c2—供試驗樣品的濃度，g/ml；v1—消耗凝血酶溶液的體積，μl；v2—供試樣溶液的加入量，μl。

其中，三羥甲基氨基甲烷鹽酸(tris-hcl)緩沖液的配制，取0.2mol/l三羥甲基氨基甲烷溶液25ml與0.1mol/l鹽酸溶液約40ml，加水至100ml，調(diào)節(jié)ph7.4。凝血酶溶液的配制為取凝血酶試劑適量，加生理鹽水配制成每1ml含凝血酶40個單位(臨用配制)。

從每個實施例的產(chǎn)品取4g，分別分為四組，每組1g進行測試，活性測試結果如下表1所示。實施例1~3所得的水蛭素活性均在400u/g以上。

表1實施例1~3的活性測試結果

應當理解的是，本發(fā)明的應用不限于上述的舉例，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。