專利名稱：一種吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從動物體中提取有效活性成分的生產(chǎn)方法，特別是以吸血水蛭為原料生產(chǎn)天然水蛭素的方法。
背景技術(shù)：
水蛭，俗稱螞蟥，是蛭綱動物的總稱。它是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有破血通經(jīng)、消積散瘀、消腫解毒等功能，臨床上用于治療跌打損傷、目赤腫痛、腦出血、肝硬化、高血壓、高脂血癥等癥，它是我國35種重要活血化瘀中藥材之一。水蛭依據(jù)其食性不同,可分為非吸血水蛭和吸血水蛭兩大類 非吸血水蛭，它主要以螺類(如田螺、福壽螺等)、河蛘等軟體動物的汁液為食，不吸血，主產(chǎn)于長江沿岸省份(如湖北、江蘇等)的河流、湖泊。常見的是寬體金線蛭(勝Pigra Whitman)，它是我國藥材市場上的主流品種，其體內(nèi)含有目前尚未清楚的某些活血化瘀成分，但不含水蛭素。吸血水蛭，主要分布在我國華南的廣東、廣西等省區(qū)，生活在稻田、水溝、江河、池塘和湖泊中，以吸食人和脊椎動物血液為生，其中較為常見的是菲牛蛭iPoecilobdellaManillensis Lesson,俗稱金邊螞蟥，它已被廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局收錄入 廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) >> 第二卷(2011年版))。科學(xué)研究表明，由吸血水蛭的唾液腺及其所分泌的唾液中含有豐富的水蛭素hirudin、透明質(zhì)酸酶Orgelase以及血管擴(kuò)張劑Vasolilator和麻醉劑Anaesthetic等多種生物活性物質(zhì),其中水蛭素是這些活性物質(zhì)中數(shù)量最多、活性最顯著并且研究得最多、最深入、最有藥用價值和最具發(fā)展?jié)摿Φ囊环N活性物質(zhì)。天然水蛭素于1904年被發(fā)現(xiàn)后，經(jīng)化學(xué)分析測定，它是由65個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，其分子量較低，為7000D。一直來，世界很多國家的許多科學(xué)家都研究證實，水蛭素是迄今為止世界上所發(fā)現(xiàn)的已知物質(zhì)中最強(qiáng)的天然抗凝血酶物質(zhì)，對人類心腦血管疾病尤其是腦血栓等血栓性疾病有較高的療效，其防治效果是任何物質(zhì)(包括目前臨床上常規(guī)使用的阿司匹林和肝素)所難以比擬的，這是因為一方面，天然水蛭素的抗栓功能不需要其它因子的參與，加上其分子量遠(yuǎn)比肝素要小，滲透性強(qiáng)，容易到達(dá)血栓內(nèi)部，并將其溶解；另一方面，天然水蛭素不會像肝素等抗凝劑那樣易引起出血等難以克服的副作用，從而使天然水蛭素成為世界公認(rèn)的防治心腦血管疾病最好的天然藥物。目前，能夠從水蛭體內(nèi)提取天然水蛭素的吸血水蛭僅分布于華南的廣東、廣西和海南等少數(shù)的幾個省區(qū)，其分布范圍較窄，且品種和數(shù)量均有限，加上天然水蛭素都是存在于吸血水蛭唾液腺及其所分泌的唾液中，在這以前，國內(nèi)外大多都是采用傳統(tǒng)的提取工藝和技術(shù)，即選用吸血水蛭的頭部或整體進(jìn)行勻漿或粉碎后，再利用水一丙酮混合劑或生理鹽水萃取，然后經(jīng)過乙醇分級沉淀、普通層析和等電聚焦等步驟提取這些生物活性物質(zhì)。如默克專利股份有限公司在專利申請?zhí)枮镃N00808873. X《來源于馬尼拉水蛭的透明質(zhì)酸酶，分離、純化和重組生產(chǎn)方法》中公開的的是用酸性緩沖液勻漿馬尼拉水蛭中的水蛭的頭離心后，用離子交換層析等方法分離純化透明質(zhì)酸酶；如胡維民在專利申請?zhí)朇N92107076《醫(yī)用天然水蛭素的提取方法》中公開了用整條水蛭勻漿后提取水蛭素；又如胡遠(yuǎn)華在專利申請?zhí)朇N95105650《動物血水蛭水解法及其水蛭水解血》中公開的是使食血水蛭充分吸取動物血數(shù)分鐘或數(shù)小時后用物理或化學(xué)方法使血液從水蛭體內(nèi)流出，收集流出的橙紅色血液，本法能有效降解動物血并使之含有醫(yī)用價值的水蛭素等水蛭分泌物。對現(xiàn)有技術(shù)中天然水蛭素的生產(chǎn)方法檢索如下
I、中國專利號ZL03113566.8，發(fā)明名稱從菲牛蛭活體中提取天然水蛭素的方法。該發(fā)明是將清洗干凈的菲牛蛭用誘導(dǎo)物質(zhì)充分喂飽菲牛蛭，然后對菲牛蛭進(jìn)行擠壓使其分泌出唾液(水蛭素粗品)，所采用的誘導(dǎo)物質(zhì)包括無機(jī)鹽、有機(jī)酸和濃度較低的無機(jī)酸，選用乙酸、鹽酸、磷酸、檸檬酸、精氨酸、賴氨酸、抗壞血酸、胱氨酸、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、磷酸鈉或磷酸二氫鉀的一種或兩種、兩種以上的混合物，其重量百分濃度為O. 1_3%，水溶液的PH在4. 5-6. 8之間。具體方法是先配置好純凈的混合水溶液，讓菲牛蛭充分吃飽，然后對其進(jìn)行擠壓，使其分泌出唾液，每隔一周或10天提取一次，每條鮮活菲牛蛭可以反復(fù)提取6-7 次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫升左右。該法的缺點是對充分吃飽的菲牛蛭經(jīng)人工擠壓使其分泌出唾液后，菲牛蛭的口腔損傷嚴(yán)重，致使其很容易感染疾病或因體質(zhì)虛弱很難恢復(fù)而造成大批死亡，同時，兩次間提取的時間間隔太短，菲牛蛭在得不到營養(yǎng)的補(bǔ)充，機(jī)體尚未得到充分恢復(fù)后就進(jìn)入下一次的提取，這樣，一方面提取出來的水蛭素粗品數(shù)量少，水蛭素含量低，更重要的是另一方面會造成菲牛蛭的死亡明顯升高，從而直接導(dǎo)致生產(chǎn)成本過聞。2、中國專利申請?zhí)?01010526681. 7 發(fā)明名稱一種從天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素的方法。該發(fā)明是將氯化鈉、一水乙酰半胱氨酸鹽酸鹽、賴氨酸、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的兩種或多種物質(zhì)進(jìn)行組合，溶解于去離子水中配制成刺激液，刺激液中各物質(zhì)的重量百分濃度為O. 01 5%,其中酶濃度在100U 300U/ml。將活體水蛭稱重后置于容器中，按水蛭重量比刺激液體積為I : I 5倍加入所述刺激液，刺激3小時使水蛭分泌分泌液，分泌液經(jīng)過16000 20000r/min離心分離得水蛭素粗品，經(jīng)O. 2微米不銹鋼膜微濾，再經(jīng)10000 3000道爾頓分子量的有機(jī)膜超濾，再進(jìn)行反滲透納濾濃縮，然后按固體比液體的重量體積比為I :6 10加入藥用淀粉調(diào)配，經(jīng)噴霧干燥，得水蛭素成品。最終水蛭素提取得率在30%以上，產(chǎn)品活性單位穩(wěn)定在600AT-U/g至1000AT-U/g。該法的缺點是刺激液中含有中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，這些酶類物質(zhì)均能破壞水蛭素的化學(xué)結(jié)構(gòu)而致使其活性降低進(jìn)而影響水蛭素的療效。3、《黑龍江醫(yī)藥科學(xué)》2010年第33卷第04期87頁中“水蛭素的提取及含量測定”分別介紹了用一種不同濃度的氯化鈉或其與L-精氨酸組成的誘導(dǎo)溶液對活體水蛭進(jìn)行誘導(dǎo)，收集水蛭唾液腺分泌物，測定水蛭素含量的報道。該法的缺點是采用化學(xué)物質(zhì)作為誘導(dǎo)溶液。4、中國專利申請?zhí)?01110237495. 6，發(fā)明名稱一種天然水蛭素的生產(chǎn)方法。該發(fā)明經(jīng)含天然水蛭素液體的提取、酸沉、加熱、脫水和干燥等步驟，所得到的天然水蛭素粉末。該法主要是用水蛭素液體即水蛭素粗品進(jìn)行分離化的過程。5、中國專利申請?zhí)?00710026461. 6，發(fā)明名稱一種以菲牛蛭唾液為原料的水蛭素生產(chǎn)工藝。該發(fā)明將菲牛蛭唾液冷凍，然后再解凍，用生理鹽水提取，提取液煮沸、過濾、取濾液。固形物用生理鹽水提取，過濾。濾液煮沸后迅速冷卻，冷藏過夜。離心，取上清液減壓濃縮后再冷凍干燥成凍干粉。該法是用水蛭素唾液即水蛭素粗品進(jìn)行分離化的過程，其步驟繁多。6、中國專利申請?zhí)?01010604457. 5，發(fā)明名稱用電刺激活體水蛭提取水蛭素的方法。該發(fā)明采用電流對生物體腺體得刺激作用，直接使用直流弱電刺激活體水蛭批量提取高純度水蛭素的方式。該發(fā)明在刺激提取水蛭素的過程中，加入了保護(hù)劑，而后提取的水蛭素經(jīng)過納濾除水，減壓噴霧干燥，制備成粉狀水蛭素。該法的缺點是直接使用直流弱電刺激活體水蛭時，水蛭就會立即收縮成堅硬的一團(tuán)(因水蛭為無脊椎動物)，難以提取水蛭素。7、中國專利200710066096. I，發(fā)明名稱一種天然水蛭素有效成分的提取方
法。該發(fā)明公開了一種天然水蛭素有效成分的提取方法，是用水清洗吸血水蛭干凈后加入含量15 25%的乙醇水溶液浸泡30-50小時后，過濾，得濾液和藥渣；將菲牛蛭藥渣絞碎， 再加含量15 25%的丙酮水溶液浸泡，濾過，得濾液，分別將兩次濾液真空回收乙醇和丙 酮后，合并濾液，常規(guī)真空冷凍干燥，得到產(chǎn)品。該發(fā)明工藝簡單、成本低廉，收率較高、產(chǎn)品質(zhì)量好、保存期長，但在天然水蛭素提取過程中，要使用到乙醇、丙酮，而丙酮屬于有機(jī)物，有一定毒性。從上述專利可以看出，都是使用了化學(xué)物質(zhì)作為誘導(dǎo)液對活體吸血水蛭進(jìn)行誘導(dǎo)，其安全性受到質(zhì)疑。同時如采用人工擠壓的方法取出水蛭唾液腺分泌物即天然水蛭素粗品，其缺點是在誘導(dǎo)液中沒有防治感染的藥物，從而造成擠壓后損傷了水蛭的口腔，直接導(dǎo)致水蛭很容易感染疾病或體弱、體質(zhì)下降而致使其死亡率升高,使生產(chǎn)成本明顯增加,經(jīng)濟(jì)效益不明顯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法，即以常見的天然動物蚯蚓的提取液作為特異發(fā)性誘導(dǎo)液，并在其中加入抑菌消炎和增強(qiáng)機(jī)體體質(zhì)的物質(zhì)，同時，每次提取天然水蛭素粗品的時間間隔為11飛0天，這樣就能克服現(xiàn)有專利中的缺點，從而明顯提高吸血水蛭多次提取其唾液即天然水蛭素粗品后的成活率，并且提高天然水蛭素粗品中的水蛭素含量，使其生產(chǎn)成本明顯下降，經(jīng)濟(jì)效益顯著。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法，它包括先從吸血水蛭活體中提取天然水蛭素粗品，然后經(jīng)過分離純化得到天然水蛭素粉。所述天然水蛭素粗品的提取是先制備特異性誘導(dǎo)液，并將其灌入腸管中得到含特異性誘導(dǎo)液腸管；再將含特異性誘導(dǎo)液腸管投喂給吸血水蛭，然后提取吸血水蛭的唾液或?qū)⑽文{，制得漿液，即得到天然水蛭素粗品O所述特異性誘導(dǎo)液的制備為在每IOOOml特異性誘導(dǎo)液中含有蚯蚓提取液10 300ml，殼聚糖5 50g，黃芪多糖I 20g，葡萄糖粉I 30g ;先用適量水溶解上述粉狀物質(zhì)后，加入蚯蚓提取液，再用水加至IOOOml，即得到特異性誘導(dǎo)液，備用。所述蚯蚓提取液，是指將蚯蚓活體或其新鮮冰凍尸體加水，磨漿、過濾得到的濾液。其具體的制備方法是在清洗干凈的蚯蚓活體或其新鮮冰凍尸體中加入I 3倍的干凈水，用膠體磨勻漿2 3次、再用10(Γ300目篩網(wǎng)過濾后所得到的濾液即為蚯蚓提取液。本發(fā)明中的蚯蚓提取液具有刺激活體吸血水蛭攝食即誘食等作用。蚯蚓中藥名為地龍，又有土龍、蛐蟮、寒蚓等多個名稱，是指環(huán)節(jié)動物門寡毛綱的動物，主要是指后孔寡毛目的陸棲動物，如參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓、紅色愛勝蚓等。蚯蚓內(nèi)含多種微量元素和多種具有活性作用的酶類物質(zhì)。本發(fā)明中的殼聚糖具有良好的營養(yǎng)價值和抑菌消炎防腐等作用，既可有效保護(hù)蚯蚓提取液而防止其變質(zhì)，同時能夠有效防治在提取天然水蛭素粗品過程中因擠壓損傷吸血水蛭口腔而引起的條件性感染性疾病。所述黃芪多糖具有(1)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能黃芪多糖富含或特異性的排除侵入機(jī)體的異物，對特異性免疫和非特異性免疫均有促進(jìn)作用，提高機(jī)體的抗病能力。(2)促生長作用黃芪多糖富含多種氨基酸、維生素和多種微量元素，可增加營養(yǎng)，改善食欲，促進(jìn)生長。(3)抗細(xì)菌作用黃芪多糖對細(xì)菌及其病毒性產(chǎn)物有直接抑殺和解毒作用。更主要的 是能過調(diào)動機(jī)體免疫防御功能而發(fā)揮扶正祛邪抑菌，殺菌作用。(4)抗病毒作用黃芪多糖對于干擾素系統(tǒng)有明顯的刺激作用，使動物機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素，抑制病毒的復(fù)制，從而達(dá)到抗病毒的目的。黃芪多糖的加入對吸血水蛭身體機(jī)能的提高具有促進(jìn)作用。所述葡萄糖是生物體內(nèi)新陳代謝不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，它的氧化反應(yīng)放出的熱量是動物所需能量的重要來源。這樣可及時為吸血水蛭快速補(bǔ)充能量，以恢復(fù)體質(zhì)及能量。所述含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備是將制備好的特異性誘導(dǎo)液灌入新鮮的動物大小腸、動物小腸腸衣或人工腸衣內(nèi)，灌滿后用線扎緊腸管兩端使其膨脹，每段腸管長為10 IOOcm0所述吸血水蛭的投喂是將饑餓15天以上的吸血水蛭分散放在容器中，然后投放含特異性誘導(dǎo)液腸管，讓吸血水蛭自由吸吮，在10 60分種內(nèi)吃飽，吸飽后的吸血水蛭其體重增加I 10倍。所述吸血水蛭唾液的提取是將吃飽特異性誘導(dǎo)液后的吸血水蛭靜置30 120分鐘，然后采用物理擠壓的方法提取并收集其體內(nèi)的唾液即天然水蛭素粗品，待唾液提取完成之后繼續(xù)按常規(guī)的方法對吸血水蛭進(jìn)行養(yǎng)殖管理(在提取天然水蛭素粗品期間不投料)，以備供下一次提取天然水蛭素粗品用。所述吸血水蛭唾液提取的時間間隔為11 60天進(jìn)行一次，每條水蛭可反復(fù)提取天然水蛭素粗品3 5次，每次可得天然水蛭素粗品8 12ml ο所述吸血水蛭磨漿制得漿液是指將經(jīng)過3 5次水蛭素粗品提取之后的吸血水蛭在吸飽特異性誘導(dǎo)液后再進(jìn)行整體磨漿，然后用20 300目的篩網(wǎng)過濾，取其濾液即為制得的漿液即為天然水蛭素粗品。這一步的主要目的是為了充分利用原料，將原料的價值發(fā)揮到最大化。因為經(jīng)過多次唾液收集之后的吸血水蛭分泌唾液量減少，同時天然水蛭素的含量也在逐步降低，因此在提取一定次數(shù)之后將吸血水蛭進(jìn)行勻漿進(jìn)行最后一次水蛭素提取，同時發(fā)揮它身體的重要的藥用價值。本發(fā)明提取的天然水蛭素粗品中的抗凝血酶活性即水蛭素含量為5 50 AT-U(國際單位)/ml。所述天然水蛭素粗品分離純化是指天然水蛭素粗品裝入容器內(nèi)，置于40 49°C的恒溫水浴中加熱30 90分鐘，取出冷卻至常溫，然后用160 300目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，然后在3000r/min 15000r/min的離心機(jī)離心5 30分鐘,取其濾液,再用膜分離、透析法、電泳法或?qū)游龇ǖ瘸Ｒ?guī)的生化分離方法對其進(jìn)行分離純化得到濃縮液，再加入輔料如藥用淀粉、甘露醇等后進(jìn)行冷凍干燥后即得到天然水蛭素粉末。本發(fā)明制備的特異性誘導(dǎo)液能誘導(dǎo)環(huán)節(jié)動物門蛭綱所有吸血水蛭，其中包括醫(yī)蛭科和山蛭科的水蛭如菲牛蛭(俗稱金邊螞蟥)、日本醫(yī)蛭、棒紋牛蛭、湖北牛蛭、海南山蛭
坐寸ο天然水蛭素，它是迄今為止世界上所發(fā)現(xiàn)的已知物質(zhì)中最強(qiáng)的天然抗凝血酶物質(zhì)，其作用優(yōu)于肝素，對防治人類心腦血管疾病尤其是腦血栓等血栓性疾病具有較高的療效，此外，還可廣泛應(yīng)用化妝品和保健食品、藥品等領(lǐng)域。
本發(fā)明產(chǎn)品可利用Markwardt的凝血酶直接滴定法測定抗凝血酶活性即天然水蛭素的含量來監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量。本發(fā)明的優(yōu)點是
I、本發(fā)明的特異性誘導(dǎo)液是一種純天然的特異性誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)液中的成分無毒、無害、無腐蝕性，這樣有利于天然水蛭素的提取和分離純化；誘導(dǎo)液中含蚯蚓提取液，其含有多種微量元素及活性酶類物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)吸血水蛭吮吸。2、本發(fā)明中的殼聚糖具有良好的營養(yǎng)價值和抑菌消炎防腐等作用，可有效提高在提取天然水蛭素粗品過程中吸血水蛭成活率。3、本發(fā)明提高了吸血水蛭的免疫力，在特異性誘導(dǎo)液中添加了黃芪多糖和葡萄糖，這樣可為吸血水蛭及時補(bǔ)充其所需的營養(yǎng)和能量，這為反復(fù)進(jìn)行活體水蛭提取天然水蛭素粗品打下了堅實的基礎(chǔ)，同時，黃芪多糖為免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑，可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，改善機(jī)體腸道內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)有益群菌乳酸桿菌的生長，以維持腸道微生態(tài)區(qū)系的平衡和穩(wěn)定，從而有利于防治各種病毒感染、細(xì)菌性疾病。黃芪多糖的加入可有效防治在提取天然水蛭素粗品過程中因擠壓損傷水蛭口腔而引起的條件性感染性疾病，從而提高了吸血水蛭提取其唾液即天然水蛭素粗品后的成活率，減少了死亡率，降低生產(chǎn)成本。4、本發(fā)明工藝簡單，天然水蛭素的提取率穩(wěn)定，提取總量較高。因為采用本發(fā)明的方法(1) 一條活體水蛭最多可提取天然水蛭素粗品5次，每次提取天然水蛭素粗品12ml，總共可提取天然水蛭素粗品75ml，比現(xiàn)有的專利每條水蛭可反復(fù)提取天然水蛭素粗品6 7次，每次可得天然水蛭素粗品6 7ml，總共可提取天然水蛭素粗品49ml的提高22. 4% ; (2)水蛭素提取時間合理，每隔11 60天進(jìn)行提取天然水蛭素粗品一次，這樣其水蛭素含量較高；因為水蛭素的分泌是有一個時間恢復(fù)過程的。(3)在最后一次吸血水蛭吸飽特異性誘導(dǎo)液后即對其整條進(jìn)行磨漿、過濾得到濾液即天然水蛭素粗品，這樣就充分利用了水蛭尸體提取其內(nèi)所含的天然水蛭素，從而達(dá)到了原料綜合利用的目的。
具體實施例下面結(jié)合具體實例來對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限實施例表示的范圍。實施例I
本發(fā)明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分離純化。
I、天然水蛭素粗品提取按如下步驟進(jìn)行
(I)特異性誘導(dǎo)液的制備
A、制備蚯蚓提取液取用水清洗干凈的赤子愛勝蚓活體200g，加入200ml的干凈水、經(jīng)用膠體磨勻漿2次、用100目篩網(wǎng)過濾后所得到的濾液即為蚯蚓提取液，備用。B、先量取上述的蚯蚓提取液120ml，稱取殼聚糖60g、黃芪多糖12g、葡萄糖粉12g ；先用適量干凈水溶解上述粉狀物質(zhì)后，然后加入蚯蚓提取液，再用干凈水加至10000 ml即成特異性誘導(dǎo)液，備用。(2)含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備將上述制備好的特異性誘導(dǎo)液12000 ml灌入充分去除內(nèi)容物后的豬小腸內(nèi)，按每隔50cm為一段，灌滿后用線扎緊腸管兩端使其充分膨脹，備用。(3)含特異性誘導(dǎo)液腸管的投喂選取未經(jīng)提取過天然水蛭素粗品、總重量為 IOOOg,已饑餓45天的菲牛蛭活體分散放在容器里，然后將上述制備好的含特異性誘導(dǎo)液腸管平鋪在其內(nèi)，讓菲牛蛭自由吸吮小腸內(nèi)的誘導(dǎo)液；在25分鐘后菲牛蛭吸飽了誘導(dǎo)液，其總體重增加到8250g，凈增重7250g，是其體重的7. 25倍。(4)菲牛蛭唾液的收集將吃飽誘導(dǎo)液后的菲牛蛭讓其靜置45分鐘后再采用人工擠壓法擠出菲牛蛭唾液，每條水蛭能夠提取天然水蛭素粗品flOml，即得到天然水蛭素粗品5090ml。經(jīng)測定，這些粗品含天然水蛭素34 AT-U / ml。2、天然水蛭素粗品的分離純化
將上述得到的天然水蛭素粗品用200目篩網(wǎng)過濾，取其濾液放入容器內(nèi)，置于45°C的恒溫水浴中隔水加熱60分鐘，取出冷卻至常溫，接著用160目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，用15000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)進(jìn)行離心15分鐘，取其濾液，用分子量為7000D的超濾膜進(jìn)行超濾，得濃縮液2011 ml(含天然水蛭素64 AT-U / ml )，加入藥用淀粉80g，經(jīng)冷凍干燥后得到天然水蛭素粉末79g (含天然水蛭素1629AT-U / g)。提取率為74.3%。實施例2
本發(fā)明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分離純化。I、天然水蛭素粗品提取按如下步驟進(jìn)行
A、制備蚯蚓提取液取新鮮冰凍的紅色愛勝蚓6千克，解凍后加入18L的干凈水、經(jīng)用膠體磨勻漿3次、用200目篩網(wǎng)過濾后所得到的濾液即為蚯蚓提取液，備用。
B、量取上述的蚯蚓提取液15L，稱取殼聚糖2500g、黃芪多糖lOOOg、葡萄糖粉1500g ;先用適量干凈水溶解上述粉狀物質(zhì)后，接著加入蚯蚓提取液，再用干凈水加至50L即成特異性誘導(dǎo)液，備用。(2)含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備將上述制備好的特異性誘導(dǎo)液50L灌入充分去除內(nèi)容物后的豬大腸內(nèi)，按每隔IOcm為一段，灌滿后用線扎緊腸管兩端使其充分膨脹，備用。(3)含特異性誘導(dǎo)液腸管的投喂選取已經(jīng)提取過天然水蛭素粗品三次(每隔1Γ60天提取一次)、總重量為12500g，已饑餓15天的湖北牛蛭活體分散放在容器里，然后將上述制備好的特異性誘導(dǎo)液腸管平鋪在其內(nèi)，讓湖北牛蛭自由吸吮腸衣內(nèi)的誘導(dǎo)液；在40分鐘后日本醫(yī)蛭蛭吸飽了誘導(dǎo)液，其總體重增加到25252g，凈增重12752g，是其體重的I. 02 倍。
(4)日本醫(yī)蛭唾液的收集將吃飽誘導(dǎo)液后的湖北牛蛭讓其靜置60分鐘后再采用人工擠壓法擠出日本醫(yī)蛭唾液，每條水蛭能夠提取天然水蛭素粗品8 9ml，即得到天然水蛭素粗品10236 ml。經(jīng)測定，這些粗品含天然水蛭素50AT-U / ml。2、天然水蛭素粗品的分離純化
將上述得到的天然水蛭素粗品用200目篩網(wǎng)過濾，取其濾液放入容器內(nèi)，置于47°C的恒溫水浴中隔水加熱45分鐘，取出冷卻至常溫，接著用200目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，再用10000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)進(jìn)行離心25分鐘，取其濾液，經(jīng)凝膠層析后得濃縮液3176 ml (含天然水蛭素113AT-U / ml)，加入甘露醇500g，經(jīng)冷凍干燥后得到天然水蛭素粉末494g(含天然水蛭素727AT-U / g)，提取率為70.1%。實施例3 本發(fā)明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分離純化。I、天然水蛭素粗品提取按如下步驟進(jìn)行
(I)特異性誘導(dǎo)液的制備
A、制備蚯蚓提取液取用水洗干凈的通俗環(huán)毛蚓活體300克，加入600ml的干凈水、經(jīng)用膠體磨勻漿3次、用300目篩網(wǎng)過濾后所得到的濾液即為蚯蚓提取液，備用。
B、量取上述的蚯蚓提取液450 ml，稱取殼聚糖68g、黃芪多糖45g、葡萄糖粉780g ;先用適量干凈水溶解上述粉狀物質(zhì)后，加入蚯蚓提取液，再用干凈水加至3L即成特異性誘導(dǎo)液，備用。(2)含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備將上述制備好的特異性誘導(dǎo)液3L灌入豬小腸腸衣內(nèi)，按每隔75cm為一段，灌滿后用線扎緊腸管兩端使其充分膨脹，備用。(3)含特異性誘導(dǎo)液腸管的投喂選取已經(jīng)提取過天然水蛭素粗品五次(每隔11飛0天提取一次)、總重量為750克，已饑餓21天的菲牛蛭活體分散放在容器里，然后將上述制備好的含特異性誘導(dǎo)液腸管平鋪在其內(nèi)，讓菲牛蛭自由吸吮腸衣內(nèi)的誘導(dǎo)液；在50分鐘后菲牛蛭吸飽了誘導(dǎo)液，其總體重增加到2927g，凈增重2177g，是其體重的2. 9倍。(4)吸血水蛭磨漿，制得漿液將喂養(yǎng)吸飽特異性誘導(dǎo)液后的吸血水蛭整條進(jìn)行磨漿，先經(jīng)30目篩過濾，后經(jīng)過300目篩網(wǎng)過濾，去渣得濾液，制得漿液即天然水蛭素粗品2643ml (含天然水蛭素22AT-U /ml)。2、天然水蛭素粗品的分離純化
將上述得到的天然水蛭素粗品用300目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，置于49°C的恒溫水浴中加熱30分鐘，取出冷卻至常溫，再用300目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，再用3000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)進(jìn)行離心30分鐘，取其濾液，經(jīng)電泳后得濃縮液511ml (含天然水蛭素83AT-U / ml)，加入甘露醇100g，經(jīng)冷凍干燥后得到天然水蛭素粉末93g(含天然水蛭素456AT-U / g)，提取率為72.9%。實施例4
本發(fā)明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分離純化。I、天然水蛭素粗品提取按如下步驟進(jìn)行
(I)特異性誘導(dǎo)液的制備
A、制備蚯蚓提取液取干凈的通俗環(huán)毛蚓活體3. 5千克，加入9L的干凈水、經(jīng)用膠體磨勻漿2次用、100目篩網(wǎng)過濾后所得到的濾液即為蚯蚓提取液，備用。B、量取上述的蚯蚓提取液8 L，稱取殼聚糖3000g、黃芪多糖600g、葡萄糖粉1500g ;先用適量干凈水溶解上述粉狀物質(zhì)后，接著加入蚯蚓提取液，再用干凈水加至85 L即成特異性誘導(dǎo)液，備用。(2)含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備將上述制備好的特異性誘導(dǎo)液85 L灌入充分去除內(nèi)容物后的羊小腸內(nèi)，按每隔20cm為一段，灌滿后用線扎緊腸管兩端使其充分膨脹，備用。(3)含特異性誘導(dǎo)液腸管的投喂選取未經(jīng)提取過天然水蛭素粗品、總重量為7060g、已饑餓60天的棒紋牛蛭活體分散放在容器里，然后將上述制備好的含特異性誘導(dǎo)液腸管平鋪在其內(nèi)，讓棒紋牛蛭自由吸吮腸內(nèi)的誘導(dǎo)液；在32分鐘后棒紋牛蛭吸飽了誘導(dǎo)液，其總體重增加到75542g，凈增重68482g，是其體重9. 7倍。
(4)棒紋牛蛭唾液的收集將吃飽誘導(dǎo)液后的棒紋牛蛭讓其靜置120分鐘后再采用人工擠壓法擠出棒紋牛蛭唾液，每條水蛭能夠提取天然水蛭素粗品l(Tl2ml，即得到天然水蛭素粗品42740 ml (含天然水蛭素5 AT-U / ml)。2、天然水蛭素粗品的分離純化
將上述得到的天然水蛭素粗品用300目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，置于49°C的恒溫水浴中加熱30分鐘，取出冷卻至常溫，再用300目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，再用3000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)進(jìn)行離心30分鐘，取其濾液，經(jīng)電泳后得濃縮液1895ml (含天然水蛭素77AT-U / ml),加入甘露醇700g，經(jīng)冷凍干燥后得到天然水蛭素粉末695g (含天然水蛭素210AT-U / g)，提取率為68.4%。實施例5
本發(fā)明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分離純化。I、天然水蛭素粗品提取按如下步驟進(jìn)行
(I)特異性誘導(dǎo)液的制備
A、制備蚯蚓提取液取新鮮冰凍的赤子愛勝蚓900g，解凍后加入1500ml的干凈水、經(jīng)用膠體磨勻漿2次、用100目篩網(wǎng)過濾后所得到的濾液即為蚯蚓提取液，備用。
B、量取上述的蚯蚓提取液1300ml，稱取殼聚糖125g、黃芪多糖75g、葡萄糖粉185g ;先用適量干凈水溶解上述粉狀物質(zhì)后，加入蚯蚓提取液，再用干凈水加至7000 ml即成特異性誘導(dǎo)液，備用。(2)含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備將上述制備好的特異性誘導(dǎo)液7000 ml灌入人工腸衣內(nèi)，按每隔IOOcm為一段，兩端用線扎緊使腸管膨脹，備用。(3)含特異性誘導(dǎo)液腸管的投喂選取未經(jīng)提取過天然水蛭素粗品、總重量為1350g、已饑餓55天的海南山蛭活體分散放在容器里，然后將上述制備好的含特異性誘導(dǎo)液腸管平鋪在其內(nèi)，讓海南山蛭自由吸吮腸衣內(nèi)的誘導(dǎo)液；在27分鐘后海南山蛭吸飽了誘導(dǎo)液，其總體重增加到5469g，凈增重4119g，是其體重的3. 05倍。(4)海南山蛭唾液的收集將吃飽誘導(dǎo)液后的海南山蛭讓其靜置90分鐘后再采用人工擠壓法擠出海南山蛭唾液即得到天然水蛭素粗品2843ml。經(jīng)測定，這些粗品含天然水蛭素 29AT-U / ml。2、天然水蛭素粗品的分離純化
將上述得到的天然水蛭素粗品用250目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，置于40°C的恒溫水浴中加熱90分鐘，取出冷卻至常溫，接著用200目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，用8000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)進(jìn)行離心20分鐘，取其濾液，經(jīng)透析后得濃縮液2246ml (含天然水蛭素52AT-U / ml),加入藥用淀粉1500g，經(jīng)冷凍干燥后得到天然水蛭素粉末1494g (含天然水蛭素79AT-U /g)。提取率為78.9%。實施例6
本發(fā)明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分離純化。I、天然水蛭素粗品提取按如下步驟進(jìn)行
(I)特異性誘導(dǎo)液的制備
A、制備Φ丘蚓提取液取用水清洗干凈的紅色愛勝蚓活體350g,加入600ml的干凈水、經(jīng)用膠體磨勻漿3次、用100目篩網(wǎng)過濾后所得到的濾液即為蚯蚓提取液，備用。 B、量取上述的蚯蚓提取液440ml，稱取殼聚糖95g、黃芪多糖45g、葡萄糖粉105g ；先用適量干凈水溶解上述粉狀物質(zhì)后，加入蚯蚓提取液，再用干凈水加至5500 ml即成特異性誘導(dǎo)液，備用。(2)含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備將上述制備好的特異性誘導(dǎo)液5500 ml灌入充分去除內(nèi)容物后的豬小腸內(nèi)，按每隔35cm為一段，兩端用線扎緊使腸管膨脹，備用。(3)含特異性誘導(dǎo)液腸管的投喂選取已經(jīng)提取過天然水蛭素粗品三次、重量為為850g、已饑餓49天的菲牛蛭活體分散放在容器里，然后將上述制備好的含特異性誘導(dǎo)液腸管平鋪在其內(nèi)，讓菲牛蛭自由吸吮小腸內(nèi)的誘導(dǎo)液；在34分鐘后菲牛蛭吸飽了誘導(dǎo)液，其總體重增加到3521g，凈增重2671g，是其體重的3. 07倍。(4)菲牛蛭唾液的收集將吃飽誘導(dǎo)液后的菲牛蛭讓其靜置30分鐘后再采用人工擠壓法擠出菲牛蛭唾液即得到天然水蛭素粗品1837 ml。經(jīng)測定，這些粗品含天然水蛭素17 AT-U / ml ο2、天然水蛭素粗品的分離純化
將上述得到的天然水蛭素粗品用250目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，置于47°C的恒溫水浴中加熱80分鐘，取出冷卻至常溫，接著用200目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，用3000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)進(jìn)行離心18分鐘，取其濾液，用層析法對其進(jìn)行分離純化，得濃縮液399 ml (含天然水蛭素56AT-U / ml)，加入食用玉米淀粉150g，經(jīng)冷凍干燥后得到天然水蛭素粉末148g (含天然水蛭素151AT-U / g)。提取率為71.3%。實施例7
本發(fā)明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分離純化。I、天然水蛭素粗品提取按如下步驟進(jìn)行
(I)特異性誘導(dǎo)液的制備
A、制備蚯蚓提取液取新鮮冰凍的通俗環(huán)毛蚓I.5千克，解凍后加入4L的干凈水、經(jīng)用膠體磨勻漿3次、用100目篩網(wǎng)過濾后所得到的濾液即為蚯蚓提取液，備用。
B、量取上述的蚯蚓提取液3.3L，稱取殼聚糖400g、黃芪多糖250g、葡萄糖粉50g ;先用適量干凈水溶解上述粉狀物質(zhì)后，接著加入蚯蚓提取液，再用干凈水加至18L即成特異性誘導(dǎo)液，備用。(2)含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備將制備好的含特異性誘導(dǎo)液腸管灌入充分去除內(nèi)容物后的牛小腸內(nèi)，按每隔15cm為一段，兩端用線扎緊使腸管膨脹，備用。
(3)含特異性誘導(dǎo)液腸管的投喂選取已經(jīng)提取過天然水蛭素粗品三次、重量為3555g、已饑餓15天的菲牛蛭活體分散放在容器里，然后將上述制備好的腸管平鋪在其內(nèi)，讓菲牛蛭自由吸吮小腸內(nèi)的誘導(dǎo)液；在41分鐘后菲牛蛭吸飽了誘導(dǎo)液，其總體重增加到8177g，凈增重11732g，是其體重的2. 3倍。(4)菲牛蛭唾液的收集將吃飽誘導(dǎo)液后的菲牛蛭讓其靜置50分鐘后再采用人工擠壓法擠出菲牛蛭唾液即得到天然水蛭素粗品9943 ml (含天然水蛭素28 AT-U / ml)。2、天然水蛭素粗品的分離純化
將上述得到的天然水蛭素粗品用300目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，置于47°C的恒溫水浴中加熱40分鐘，取出冷卻至常溫，接著用200目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，用5000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)進(jìn)行離心10分鐘，取其濾液，用層析法對其進(jìn)行分離純化，得濃縮液2234 ml (含天然水蛭素93AT-U / ml)，加入食用木薯淀粉650g，經(jīng)冷凍干燥后得到天然水蛭素粉末641g (含 天然水蛭素324AT-U / g)。提取率為74.6%。實施例8
本發(fā)明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分離純化。I、天然水蛭素粗品提取按如下步驟進(jìn)行
(I)特異性誘導(dǎo)液的制備
A、制備蚯蚓提取液取干凈的參環(huán)毛蚓活體2.5千克，加入3L的干凈水、經(jīng)用膠體磨勻漿2次、用100目篩網(wǎng)過濾后所得到的濾液即為蚯蚓提取液，備用。
B、量取上述的蚯蚓提取液2.5L，稱取殼聚糖310g、黃芪多糖125g、葡萄糖粉600g ;先用適量干凈水溶解上述粉狀物質(zhì)后，接著加入蚯蚓提取液，再用干凈水加至23L即成特異性誘導(dǎo)液，備用。(2)含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備將上述制備好的特異性誘導(dǎo)液23L灌入充分去除內(nèi)容物后的豬小腸內(nèi)，按每隔40cm為一段，兩端用線扎緊使腸管膨脹，備用。(3)含特異性誘導(dǎo)液腸管的投喂選取未經(jīng)提取過天然水蛭素粗品、重量為2000g、體重在2g以上、已饑餓83天的棒紋牛蛭活體分散放在容器里，然后將上述制備好的含特異性誘導(dǎo)液腸管平鋪在其內(nèi)，讓棒紋牛蛭自由吸吮小腸內(nèi)的誘導(dǎo)液；在32分鐘后棒紋牛蛭吸飽了誘導(dǎo)液，其總體重增加到13616g，凈增重11616g，是其體重5. 8倍。(4)棒紋牛蛭唾液的收集將吃飽誘導(dǎo)液后的棒紋牛蛭讓其靜置95分鐘后再采用人工擠壓法擠出棒紋牛蛭唾液即得到天然水蛭素粗品8827 ml (含天然水蛭素37 AT-U /ml)。2、天然水蛭素粗品的分離純化
將上述得到的天然水蛭素粗品用250目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，置于45°C的恒溫水浴中加熱60分鐘，取出冷卻至常溫，接著用250目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，用8000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)進(jìn)行離心5分鐘，取其濾液，用層析法對其進(jìn)行分離純化，得濃縮液3493 ml (含天然水蛭素69AT-U / ml)，加入食用玉米淀粉2000g，經(jīng)冷凍干燥后得到天然水蛭素粉末1991g (含天然水蛭素121AT-U / g)。提取率為73.3%。實施例9
本發(fā)明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分離純化。I、天然水蛭素粗品提取按如下步驟進(jìn)行(I)特異性誘導(dǎo)液的制備
A、制備蚯蚓提取液取新鮮冰凍的參環(huán)毛蚓I. 5千克，解凍后加入2L的干凈水、經(jīng)用膠體磨勻漿3次、用100目篩網(wǎng)過濾后所得到的濾液即為蚯蚓提取液，備用。
B、量取上述的蚯蚓提取液I. 8L，稱取殼聚糖150g、黃芪多糖55g、葡萄糖粉285g ;先用適量干凈水溶解上述粉狀物質(zhì)后，接著加入蚯蚓提取液，再用干凈水加至16L即成特異性誘導(dǎo)液，備用。(2)含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備將上述制備好的特異性誘導(dǎo)液16L灌入人工腸衣內(nèi)，按每隔55cm為一段，兩端用線扎緊使其膨脹，備用。(3)含特異性誘導(dǎo)液腸管的投喂選取已經(jīng)提取過天然水蛭素粗品一次、重量為1550g,已饑餓105天的日本醫(yī)蛭活體分散放在容器里，然后將上述步驟(2)制備好的含特異性誘導(dǎo)液腸管平鋪在其內(nèi)，讓日本醫(yī)蛭自由吸吮腸衣內(nèi)的誘導(dǎo)液；在25分鐘后日本醫(yī)蛭 吸飽了誘導(dǎo)液,其總體重增加到8064g，凈增重6514g，是其體重的4. 2倍。(4)日本醫(yī)蛭唾液的收集將吃飽誘導(dǎo)液后的日本醫(yī)蛭讓其靜置100分鐘后再采用人工擠壓法擠出日本醫(yī)蛭唾液即得到天然水蛭素粗品4886 ml。經(jīng)測定，這些粗品含天然水蛭素 28AT-U / ml。2、天然水蛭素粗品的分離純化
將上述得到的天然水蛭素粗品用300目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，置于43°C的恒溫水浴中加熱85分鐘，取出冷卻至常溫，接著用250目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，用7000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)進(jìn)行離心18分鐘，取其濾液，經(jīng)膜分離后得濃縮液1207ml (含天然水蛭素77 AT-U /ml),加入食用木薯淀粉350g，經(jīng)冷凍干燥后得到天然水蛭素粉末346g (含天然水蛭素269AT-U / g)，提取率為 67.6%。實施例10
本發(fā)明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分離純化。I、天然水蛭素粗品提取按如下步驟進(jìn)行
I、特異性誘導(dǎo)液的制備
A、制備蚯蚓提取液取干凈的紅色愛勝蚓活體500g，加入800ml的干凈水、經(jīng)用膠體磨勻漿2次、用100目篩網(wǎng)過濾后所得到的濾液即為蚯蚓提取液，備用。
B、量取上述的蚯蚓提取液550ml，稱取殼聚糖40g、黃芪多糖35g、葡萄糖粉75g ;先用適量干凈水溶解上述粉狀物質(zhì)后，接著加入蚯蚓提取液，再用干凈水加至3000 ml即成特異性誘導(dǎo)液，備用。(2)含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備將上述制備好的特異性誘導(dǎo)液3000 ml灌入豬小腸腸衣內(nèi)，按每隔45cm為一段，兩端用線扎緊使其膨脹，備用。(3)含特異性誘導(dǎo)液腸管的投喂選取已經(jīng)提取過天然水蛭素粗品四次、重量為500g、已饑餓55天的湖北牛蛭活體分散放在容器里，然后將上述制備好的含特異性誘導(dǎo)液腸管平鋪在其內(nèi)，讓湖北牛蛭自由吸吮腸衣內(nèi)的誘導(dǎo)液；在45分鐘后湖北牛蛭吸飽了誘導(dǎo)液，其總體重增加到1912g，凈增重1412g，是其體重的2. 82倍。接著對這些水蛭整條進(jìn)行磨漿，制得漿液，先后經(jīng)50目、200目篩網(wǎng)過濾，去渣得濾液即天然水蛭素粗品1703ml (含天然水蛭素41AT-U / ml)。2、天然水蛭素粗品的分離純化將上述得到的天然水蛭素粗品，置于46°C的恒溫水浴中加熱85分鐘，取出冷卻至常溫，接著用300目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，用12000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)進(jìn)行離心12分鐘，取其濾液，經(jīng)用分子量為7000D的超濾膜進(jìn)行超濾后得濃縮液811ml (含天然水蛭素65 AT-U /ml)，加入甘露醇50g，，經(jīng)冷凍干燥后得到天然水蛭素粉末45g (含天然水蛭素1172AT-U /g)，提取率為75.4%。實施例11
本發(fā)明的方法包括天然水蛭素粗品的提取和天然水蛭素粗品的分離純化。I、天然水蛭素粗品提取按如下步驟進(jìn)行
(I)特異性誘導(dǎo)液的制備
A、制備蚯蚓提取液取新鮮冰凍的紅色愛勝蚓50g，解凍后加入50ml的干凈水、經(jīng)用 膠體磨勻漿3次、用150目篩網(wǎng)過濾后所得到的濾液即為蚯蚓提取液，備用。
B、先量取上述的蚯蚓提取液10ml，稱取殼聚糖5g、黃芪多糖lg、葡萄糖粉Ig ;先用適量干凈水溶解上述粉狀物質(zhì)后，接著加入蚯蚓提取液，再用干凈水加至IOOOml即成特異性誘導(dǎo)液，備用。(2)含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備將上述制備好的特異性誘導(dǎo)液IOOOml灌入充分去除內(nèi)容物后的豬大腸內(nèi)，按每隔15cm為一段，兩端用線扎緊使其膨脹，備用。(3)含特異性誘導(dǎo)液腸管的投喂選取已經(jīng)提取過天然水蛭素粗品一次、重量為IOOg,已饑餓20天的菲牛蛭活體分散放在容器里，然后將上述制備好的含特異性誘導(dǎo)液腸管平鋪在其內(nèi)，讓菲牛蛭自由吸吮小腸內(nèi)的誘導(dǎo)液；在10分鐘后菲牛蛭蛭吸飽了誘導(dǎo)液，其總體重增加到373g，凈增重273g，是其體重的2. 7倍。(4)菲牛蛭唾液的收集將吃飽誘導(dǎo)液后的菲牛蛭讓其靜置35分鐘后再采用人工擠壓法擠出菲牛蛭唾液即得到天然水蛭素粗品202 ml。經(jīng)測定，這些粗品含天然水蛭素44AT-U / ml ο2、天然水蛭素粗品的分離純化
將上述得到的天然水蛭素粗品用100目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，置于43°C的恒溫水浴中加熱50分鐘，取出冷卻至常溫，接著用100目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，用7000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)進(jìn)行離心20分鐘，取其濾液，經(jīng)膜分離后得濃縮液96ml (含天然水蛭素68 AT-U / ml),加入藥用淀粉25g，經(jīng)冷凍干燥后得到天然水蛭素粉末23g (含天然水蛭素284AT-U / g)，提取率為72.8%。
權(quán)利要求
1.一種吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法，它包括先從吸血水蛭活體中提取天然水蛭素粗品，然后經(jīng)過分離純化得到天然水蛭素粉，其特征在于所述天然水蛭素粗品的提取是先制備特異性誘導(dǎo)液，并將其灌入腸管中得到含特異性誘導(dǎo)液腸管；再將含特異性誘導(dǎo)液腸管投喂給吸血水蛭，然后提取吸血水蛭的唾液或?qū)⑽文{，制成漿液，即得到天然水蛭素粗品；所述特異性誘導(dǎo)液的制備為在每IOOOml特異性誘導(dǎo)液中含有蚯蚓提取液10 300ml，殼聚糖5 50g，黃芪多糖I 20g，葡萄糖粉I 30g ;先用適量水溶解上述粉狀物質(zhì)后，加入蚯蚓提取液，再用水加至1000ml，即得到特異性誘導(dǎo)液，備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法，其特征在于所述吸血水蛭唾液的提取將吸飽特異性誘導(dǎo)液后的吸血水蛭靜置30 120分鐘，然后采用物理擠壓的方法提取其體內(nèi)的唾液即天然水蛭素粗品，待唾液提取完成之后繼續(xù)按常規(guī)的方法對吸血水蛭進(jìn)行養(yǎng)殖管理，以備供下一次提取天然水蛭素粗品用。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法，其特征在于 所述吸血水蛭唾液提取的時間間隔為11 60天進(jìn)行一次，每條水蛭可反復(fù)提取天然水蛭素粗品3 5次，每次可得到天然水蛭素粗品8 12ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法，其特征在于所述吸血水蛭磨漿制成漿液是指將經(jīng)過3 5次提取水蛭素粗品之后的吸血水蛭在吸飽特異性誘導(dǎo)液后再進(jìn)行整體磨漿制漿，并用20 300目的篩網(wǎng)過濾，取其濾液即為水蛭素粗品。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法，其特征在于所述含特異性誘導(dǎo)液腸管的制備是將特異性誘導(dǎo)液灌入新鮮的動物大小腸、動物小腸腸衣或人工腸衣內(nèi)，灌滿后用線扎緊腸管兩端使其膨脹，每段腸管長為10 100cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或5所述的吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法，其特征在于所述吸血水蛭的投喂是將饑餓15天以上的吸血水蛭分散放在容器中，然后投放含特異性誘導(dǎo)液腸管，讓吸血水蛭吸吮，在10 60分種內(nèi)吸飽，吸飽后的吸血水蛭其體重增加I 10倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法，其特征在于所述天然水蛭素粗品中的抗凝血酶活性即水蛭素含量為5 50 AT-U (國際單位)/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法，其特征在于所述蚯蚓提取液，是指將蚯蚓活體或其新鮮冰凍尸體加水，磨漿、過濾得到的濾液。
9.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法，其特征在于所述天然水蛭素粗品分離純化是指將天然水蛭素粗品裝入容器內(nèi)，置于40 49°C的恒溫水浴中隔水加熱30 90分鐘，取出冷卻至常溫，然后用160 300目篩網(wǎng)過濾，取其濾液，接著用3000r/min 15000r/min的離心機(jī)離心5 30分鐘,取其濾液,再用膜分離、透析法、電泳法或?qū)游龇ǔＲ?guī)的生化分離方法對其進(jìn)行分離純化得到濃縮液，再加入輔料后進(jìn)行冷凍干燥后即得到天然水蛭素粉末。
全文摘要
本發(fā)明提供一種吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法，它包括先從吸血水蛭活體中提取天然水蛭素粗品，然后經(jīng)過分離純化得到天然水蛭素粉，所述天然水蛭素粗品的提取是先制備特異性誘導(dǎo)液，并將其灌入腸管中得到含特異性誘導(dǎo)液腸管；再將含特異性誘導(dǎo)液腸管投喂給吸血水蛭，然后提取吸血水蛭的唾液或?qū)⑽文{，制得漿液，即得到天然水蛭素粗品；接著采用常規(guī)的生化分離方法進(jìn)行分離純化制得天然水蛭素粉。本發(fā)明工藝簡單、提取率高，且明顯降低吸血水蛭提取天然水蛭素粗品后的死亡率，并可有效提高生物資源利用率，從而顯著降低生產(chǎn)成本，為提取水蛭體內(nèi)主要有效活性物質(zhì)如天然水蛭素提供了一條便捷的途徑。
文檔編號C07K14/815GK102964446SQ201210493449
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者周維官, 劉晶, 吳玉琴 申請人:周維官, 劉晶, 吳玉琴