專利名稱：一種以吸血水蛭為原料制備水蛭素的方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從動(dòng)物體中得到提取物的制備方法與應(yīng)用，特別是以吸血水蛭為原料制備水蛭素的方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水蛭，俗稱螞蟥，是蛭綱動(dòng)物的總稱。它是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有破血通經(jīng)、消積散瘀、消腫解毒等功能，臨床上用于治療跌打損傷、目赤腫痛和防治腦中風(fēng)、高血壓、高脂血癥、冠心病等心腦血管疾病。
世界上的水蛭有500多種，我國也有97種。
水蛭依其食性不同，可分為非吸血水蛭和吸血水蛭兩大類非吸血水蛭以螺類，如田螺、福壽螺等、河蚌等軟體動(dòng)物的汁液為食，主要分布于長江中下游沿岸的省區(qū)如湖北、江蘇、浙江、上海等。常見的品種是寬體金線蛭Whitman pigra，隸屬于無吻蛭目、黃蛭科、金線蛭屬，由于其成年個(gè)體較大，易采集，因此它一直是中藥材市場上的主流品種，目前在國內(nèi)生產(chǎn)的中成藥中，凡是含有水蛭成分的絕大多數(shù)都是以寬體金線蛭做為原料。
吸血水蛭以吸吮人和脊椎動(dòng)物，如牛、青蛙等的血液為生。常見的品種有①菲牛蛭Hirudinaria manillensis，俗稱金邊螞蟥，隸屬于無吻蛭目、醫(yī)蛭科、牛蛭屬，主要分布于華南的廣西、廣東和海南等省區(qū)；②日本醫(yī)蛭Hirudonipponia，隸屬于無吻蛭目、醫(yī)蛭科、醫(yī)蛭屬，它在我國分布較廣，常見于四川、湖南和江蘇等省區(qū)。吸血水蛭的個(gè)體較小，其成年個(gè)體重一般僅是寬體金線蛭的1/5～1/20。由于個(gè)體小、采集難、產(chǎn)量低的緣故，故到目前為止，中藥材市場上很少見有吸血類水蛭飲片銷售。國內(nèi)僅有1～2家藥廠以吸血水蛭為原料生產(chǎn)膠囊。
現(xiàn)代科學(xué)研究，如天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，8(2)54～56；中藥材，21(12)599～600；中醫(yī)藥學(xué)刊，23(4)705～706；等等表明，水蛭的藥理活性強(qiáng)弱取決于其體內(nèi)活性成分的抗凝酶活性強(qiáng)度，也就是說水蛭的抗凝酶活性強(qiáng)，其藥理活性就強(qiáng)，反之就弱。吸血水蛭的抗凝酶活性明顯強(qiáng)于非吸血水蛭，而吸血水蛭的抗凝血酶活性成分主要是天然水蛭素Hirudin，非吸血水蛭的抗凝酶活性成分不含天然水蛭素，到目前為止，其活性成分尚未清楚。
眾多研究，如水生生物學(xué)報(bào)，21(2)169～173；中國新藥雜志，6(3)186～188；等等報(bào)道，天然水蛭素是迄今為止世界上所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的天然抗凝血酶物質(zhì)，對(duì)人類心腦血管疾病尤其是腦血栓等血栓性疾病有特效，其防治效果是任何物質(zhì)所不能比擬的。同時(shí)相關(guān)研究還表明，如生物化學(xué)雜志，11(3)321～326；生物學(xué)通報(bào)，2003，38(3)3～5；等等，水蛭素是由65～66氨基酸組成的低分子酸性多肽，分子量僅為7000，極易溶于水和生理鹽水，異常穩(wěn)定，單純溫度升高到100℃，不影響其活性。
對(duì)于吸血水蛭提取物，即水蛭素的制備方法，國內(nèi)已有申請專利，如申請?zhí)枮?2116727.3的申請，它所采用的干燥方法是冷凍干燥，其設(shè)備昂貴，干燥成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以吸血水蛭為原料制備水蛭素的方法，它能解決上述水蛭素提取存在的實(shí)際問題，具有很強(qiáng)的針對(duì)性。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一種以吸血水蛭為原料制備水蛭素的方法，其特征在于該方法通過下述步驟制得1、取吸血水蛭活體或冷凍結(jié)冰保存的吸血水蛭尸體，按其重量計(jì)算，加入生理鹽水或飲用水1～10倍，在膠體磨里反復(fù)勻漿2～6次，制得到吸血水蛭漿液。
2、用60～150目篩網(wǎng)將吸血水蛭漿液進(jìn)行過濾，除去濾渣后得到吸血水蛭濾液。
3、在吸血水蛭濾液中加入輔料，其用量按重量份比為吸血水蛭濾液50～90份，淀粉，如木薯淀粉、玉米淀粉等10～50份，水溶性填充劑，如乳糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糊精等0～5份。
4、按上述配比，將淀粉和/或水溶性填充劑放入吸血水蛭濾液中，攪拌均勻后即得到懸濁液。
5、將上述吸血水蛭懸濁液置于噴霧干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行噴霧干燥，其條件是進(jìn)口溫度165～195℃，出口溫度68～85℃，制得干燥粉末。
6、上述制得的粉末，其主要活性成分是水蛭素，可采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測其天然水蛭素的含量，一般是每克干粉含天然水蛭素60～4000ATU。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有抗凝血酶活性的水蛭素的應(yīng)用。
所述的水蛭素，可通過常規(guī)的方法，單獨(dú)做成膠囊、軟膠囊、顆粒劑、片劑使用，或與其它動(dòng)、植物藥(或它們的提取物)配成復(fù)方制劑，均可用于防治腦中風(fēng)、高血壓、高脂血癥、冠心病等心腦血管疾病。
本發(fā)明水蛭素的制備方法，其優(yōu)點(diǎn)在于能最大限度地提取水蛭體內(nèi)的主要有效活性成分，工藝簡單、生產(chǎn)成本較低、產(chǎn)品保存期長、并可采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測其活性成分含量，從而使質(zhì)量穩(wěn)定，且攜帶和服用方便，可為制藥提供安全、優(yōu)質(zhì)的原料，在臨床應(yīng)用中，根據(jù)不同的需要，可以將本發(fā)明制成具有針對(duì)性的藥物。
水蛭素質(zhì)量控制技術(shù)吸血水蛭中主要活性成分是水蛭素，用Markwardt凝血酶直接滴定法可檢測其含量。其原理是水蛭素能與凝血酶特異性結(jié)合，使凝血酶失活，其結(jié)合比例為1∶1，水蛭素的計(jì)量單位為國際單位，以ATU表示，凝血酶活性的國際單位為NIH，即1個(gè)ATU等于中和1個(gè)NIH凝血酶的水蛭素量。
水蛭素含量檢測方法取本品粉末約1g，精密稱定，精密加入0.9％氯化鈉溶液5ml，充分?jǐn)嚢?，浸?0分鐘，并時(shí)時(shí)振搖，離心，精密量取上清夜100μl，置試管(10mm×100ml)中，加入0.5％(牛)纖維蛋白原(以凝固物計(jì))的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(取0.2m0l/L三羥甲基氨基甲烷溶液25ml與0.1m0l/L鹽酸溶液約40ml，加水至100ml，調(diào)節(jié)pH值至7.4)200μl，搖勻，置水浴(37℃±0.5℃)中緩緩滴加每1ml(中)含40U(單位)的凝血酶溶液(每分鐘5μl，邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按下式計(jì)算U＝C1V1/C2V2W式中U---每1g含凝血酶活性單位，即水蛭素含量，U/g；C1---凝血酶溶液的濃度，μ/ml；C2---供試品溶液的濃度，g/ml；V1---消耗凝血酶溶液的體積，μl；V2---供試品溶液的加入量，μl；W---取樣量。
上述水蛭素含量檢測方法亦適用于以吸血水蛭為主要原料所制成的各種制劑的質(zhì)量監(jiān)測。
具體實(shí)施例實(shí)施例一取菲牛蛭活體10千克，用干凈水沖洗干凈后，加入生理鹽水100千克，在膠體磨里反復(fù)勻漿3次后得到菲牛蛭漿液；用80目篩網(wǎng)將菲牛蛭漿液進(jìn)行過濾，除去濾渣后得到菲牛蛭濾液104.3千克，因菲牛蛭活體內(nèi)尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白質(zhì)；在上述濾液中分別加入普通木薯淀粉95千克、乳糖5千克，攪拌均勻后即得到懸濁液204.3千克；將上述懸濁液置于噴霧干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行噴霧干燥，其條件為進(jìn)口溫度175℃，出口溫度78℃，共得到干燥粉末101.5千克，因菲牛蛭活體內(nèi)尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白質(zhì)；經(jīng)采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測上述粉末中天然水蛭素的含量為61ATU/克。
實(shí)施例二取冷凍結(jié)冰保存的日本醫(yī)蛭尸體30千克，待其溶解后加入飲用水210千克，在膠體磨里反復(fù)勻漿4次后得到日本醫(yī)蛭漿液；用60目篩網(wǎng)將日本醫(yī)蛭漿液進(jìn)行過濾，除去濾渣后得到日本醫(yī)蛭濾液221.7千克，因日本醫(yī)蛭尸體內(nèi)尚有一些未消化的血液；在上述濾液中加入玉米淀粉50千克，攪拌均勻后即得到懸濁液271.7千克；將上述懸濁液置于噴霧干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行噴霧干燥，其條件為進(jìn)口溫度185℃，出口溫度81℃，共得到干燥粉末52.9千克，因日本醫(yī)蛭尸體內(nèi)尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白質(zhì)；經(jīng)采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測上述粉末中天然水蛭素的含量為436ATU/克。
實(shí)施例三取冷凍結(jié)冰保存的菲牛蛭尸體20千克，待其溶解后加入生理鹽水20千克，在膠體磨里反復(fù)勻漿5次后得到菲牛蛭漿液；用100目篩網(wǎng)將菲牛蛭漿液進(jìn)行過濾，除去濾渣后得到菲牛蛭濾液26.6千克，因菲牛蛭尸體內(nèi)尚有一些未消化的血液；在上述濾液中分別加入普通木薯淀粉3千克、甘露醇0.4千克，攪拌均勻后即得到懸濁液30千克；將上述懸濁液置于噴霧干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行噴霧干燥，其條件為進(jìn)口溫度168℃，出口溫度68℃，共得到干燥粉末4.2千克，因菲牛蛭尸體內(nèi)尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白質(zhì)；經(jīng)采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測干燥粉中天然水蛭素的含量為3809.5ATU/克。
實(shí)施例四取冷凍結(jié)冰保存的菲牛蛭尸體50千克，待其溶解后加入飲用水150千克，在膠體磨里反復(fù)勻漿3次后得到菲牛蛭漿液；用70目篩網(wǎng)將菲牛蛭漿液進(jìn)行過濾，除去濾渣后得到菲牛蛭濾液164.3千克，因菲牛蛭尸體內(nèi)尚有一些未消化的血液；在上述濾液中分別加入普通木薯淀粉40千克、麥芽糊精10千克，攪拌均勻后即得到懸濁液214.3千克；將上述懸濁液置于噴霧干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行噴霧干燥，其條件為進(jìn)口溫度178℃，出口溫度75℃，共得到干燥粉末54.2千克，因菲牛蛭尸體內(nèi)尚有一些未消化的血液及其本身的蛋白質(zhì)；經(jīng)采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測干燥粉中天然水蛭素的含量為599.6ATU/克。
實(shí)施例五取實(shí)施例一所得的粉末100克(其天然水蛭素含量為61ATU/克)，按常規(guī)方法制成膠囊，0.3克/粒(水蛭素含量為18.3ATU/粒)。日服2～3次，每次2～4粒，可防治高脂血癥、高血粘等疾病。
臨床試驗(yàn)結(jié)果治療高脂血癥108例，有效77例，顯效25例，無效6例，總有效率94.4％。
實(shí)施例六
取實(shí)施例三所得的粉末30克(其水蛭素含量為3809.5ATU/克)，藥用淀粉870克，兩者混合、拌勻，按常規(guī)直接壓片法制片，0.3克/片(水蛭素含量為38.1ATU/片)。日服2～3次，每次2～4片，對(duì)治療經(jīng)閉、腦中風(fēng)的后遺癥如半身不遂、肢體麻木等有顯著的效果。
臨床試驗(yàn)結(jié)果呂××，女，44歲，廣西經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院教師，2004年5月以來，經(jīng)期異常，時(shí)間長短不一，有時(shí)提前，有時(shí)推遲，月經(jīng)量減少，每月的月經(jīng)量僅是原來正常時(shí)的1/5～1/10，經(jīng)多次服用調(diào)經(jīng)膠囊和中藥單方，效果不佳。2005年12月15日開始服用實(shí)施例五的片劑，每天2次，每次4片，服用30天，其間的月經(jīng)量明顯增多，整個(gè)經(jīng)期的月經(jīng)量達(dá)到200毫升，比未服用前的50毫升增加了四倍，繼續(xù)服用60天后，整個(gè)經(jīng)期的月經(jīng)量達(dá)到了400毫升，已恢復(fù)到原來的正常水平。在這以后停止服用，到2006年5月31日經(jīng)期和月經(jīng)量都很正常。
權(quán)利要求
1.一種以吸血水蛭為原料制備水蛭素的方法，其特征在于該方法包括下述步驟①制漿步驟常在常溫下，將吸血水蛭活體或尸體加入生理鹽水或飲用水，粉碎制成吸血水蛭漿，經(jīng)過濾取吸血水蛭濾液；②配制懸濁液步驟在吸血水蛭濾液中加入輔料制成吸血水蛭懸濁液；③干燥步驟采用噴霧干燥法將吸血水蛭懸濁液進(jìn)行噴霧干燥，得到粉末成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以吸血水蛭為原料制備水蛭素的方法，其特征在于所用的生理鹽水或飲用水為吸血水蛭重量的1～10倍，并用膠體磨制成漿液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以吸血水蛭為原料制備水蛭素的方法，其特征在于用60～150目篩網(wǎng)對(duì)吸血水蛭漿液進(jìn)行過濾得到吸血水蛭濾液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種以吸血水蛭為原料制備水蛭素的方法，其特征在于在吸血水蛭濾液中加入的輔料為淀粉和水溶性填充劑，其用量按重量份比為吸血水蛭濾液50～90份，淀粉10～50份，水溶性填充劑0～5份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以吸血水蛭為原料制備水蛭素的方法，其特征在于采用噴霧干燥法將吸血水蛭懸濁液進(jìn)行噴霧干燥，其條件是進(jìn)口溫度165～195℃，出口溫度68～85℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所制得的水蛭素的應(yīng)用，其特征在于該水蛭素通過常規(guī)的方法可單獨(dú)做成膠囊、軟膠囊、顆粒劑、片劑，或與其它動(dòng)、植物藥或它們的提取物配成復(fù)方制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述水蛭素的應(yīng)用，其特征在于所述單獨(dú)或配成復(fù)方的制劑，均可用于防治腦中風(fēng)、高血壓、高脂血癥、冠心病及相關(guān)的心腦血管疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以吸血水蛭為原料制備水蛭素的方法與應(yīng)用，該制備方法的特征在于包括吸血水蛭制漿、配制懸濁液和干燥三個(gè)步驟，所得到的粉末，它保存了吸血水蛭最主要的有效活性成分——天然水蛭素。本發(fā)明具有工藝簡單、生產(chǎn)成本較低、產(chǎn)品保存期長、并可采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測天然水蛭素含量，從而使質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品療效有保證等特點(diǎn)。水蛭素應(yīng)用范圍廣泛，可通過常規(guī)的方法單獨(dú)做成膠囊、軟膠囊、顆粒劑、片劑使用，或與其它動(dòng)、植物藥制成復(fù)方制劑，用于防治腦中風(fēng)、高血壓、高脂血癥、冠心病等心腦血管疾病。
文檔編號(hào)A61P9/10GK1883510SQ20061001953
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者周維海, 周維官 申請人:周維海