本發(fā)明涉及蛋白多肽領(lǐng)域，具體涉及一類促紅細胞生成素肽(epo肽)及其衍生物和聚合物、制備方法和應(yīng)用，進一步來說涉及這類促紅細胞生成素肽用于治療和預(yù)防貧血等相關(guān)疾病的用途。

背景技術(shù)：

促紅細胞生成素(epo)是一種調(diào)節(jié)紅系造血的糖蛋白激素，epo只有結(jié)合到紅系祖細胞表面有活性的促紅細胞生成素受體(epor)才能發(fā)揮生物效應(yīng)。epo是一種唾液酸糖蛋白，其分子含196個氨基酸殘基，等電點為4.5，ph穩(wěn)定范圍寬(ph3-9)，耐熱(80℃5-15分鐘仍有活性)。成熟的epo分子含166個氨基酸殘基。紅細胞的發(fā)育要經(jīng)過干細胞、祖細胞、前體細胞、網(wǎng)織細胞等過程，其間必須要有相應(yīng)的細胞因子作用細胞才能增殖、分化。促紅細胞生成素是紅細胞最重要的必不可少的細胞因子。它不僅可以刺激骨髓紅系祖細胞的增殖、轉(zhuǎn)化、成熟，使骨髓中網(wǎng)織紅細胞生成并釋放入血，而且可刺激血紅蛋白的合成最終導(dǎo)致外周血紅細胞數(shù)量的增加。epo通過以下方式發(fā)揮作用：(1)作為分裂原，刺激有絲分裂，促進祖細胞增殖。(2)延遲dna裂解，減少細胞凋亡，維持細胞由g0/g1期向s期轉(zhuǎn)變。(3)激活紅系特異基因(如珠蛋白基因等)，誘導(dǎo)細胞分化。人epo在血漿中的濃度通常較低(10-26u/l)，當(dāng)腎臟及肝動脈血氧濃度降低時，epo的合成可反應(yīng)性的增加。

epo的敏感性與epor有密切關(guān)系。epo必須與其受體結(jié)合后使其二聚化引起信號下傳才能發(fā)揮其生物作用。紅系祖細胞對epo的敏感性與epor的數(shù)量有關(guān)。epor主要表達于cfu-e階段，隨紅細胞的成熟而衰減，網(wǎng)織紅細胞和成熟紅細胞表面無epor。很多研究顯示，缺氧時cfu-e的epor數(shù)量可增高而提高epo的敏感性。1989年成功地克隆了鼠eporcdna。1991年人的eporcdna也成功克隆。人與鼠的epo受體都由507個氨基酸組成。epo受體可分為3個區(qū)域，即胞外配基結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿信號傳導(dǎo)區(qū)。在組成epor的氨基酸中，24個氨基酸形成單一肽鏈，223個氨基酸形成胞漿外部分，24個氨基酸形成跨膜部分，236個氨基酸形成胞漿部分。其胞外區(qū)有5氨基結(jié)構(gòu)wsxws，缺和插入研究表明其是epo結(jié)合位點的必須組份，該位點改變，可改變epo的敏感性。另研究發(fā)現(xiàn)，epor羧基端第40-90位氨基酸有將信號下調(diào)的作用。研究表明，epo的反應(yīng)性并不依賴于epor的一級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)對epo受體功能更為重要。二級結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)改變時，可以影響epo的敏感性。另外p85和p100也與epo相偶聯(lián)，epor可被epo等激活，形成同源二聚體，導(dǎo)致epo受體自身磷酸化，參與信號傳導(dǎo)，將信息傳導(dǎo)到細胞核。在epo受體的胞質(zhì)區(qū)有二個同源盒，是增殖信息的傳遞部位。它的改變可引起信息傳導(dǎo)改變，故對epo敏感性有重要影響。epo受體分為高親和力與低親和力兩種，其比例改變可以直接影響epo的敏感性。

自1906年法國科學(xué)家carnot和deflandre發(fā)現(xiàn)epo來，人們在這一個多世紀中對epo的認識不斷深入并取得了許多巨大的成果。1989年6月，amgen公司利用基因工程技術(shù)成功研制并上市了全球首個重組人促紅細胞生成素(rhepo)產(chǎn)品——epogen(阿法依泊汀)，主要在治療腎性貧血、惡性腫瘤放化療導(dǎo)致的貧血等癥狀療效顯著。2001年9月，amgen公司的一種“高糖基化”的長效重組促紅素產(chǎn)品——arnesp(阿法達貝泊汀)獲得fda批準(zhǔn)，并于2002年正式上市。2007年11月，roche公司上市了另外一種長效重組促紅素產(chǎn)品——mircera(聚乙二醇化的倍他依泊汀)。而在多肽領(lǐng)域，截止到目前仍未有針對epo受體的激動劑類藥物上市，存在巨大的研發(fā)空間及市場潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的現(xiàn)有技術(shù)的問題是：現(xiàn)有的epo多肽，其生物活性較低，生物利用度不高，半衰期短導(dǎo)致臨床依從性不好，此類蛋白分子的穩(wěn)定性差、易分解，不易保存、運輸和使用。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種促紅細胞生成素肽及其相關(guān)的衍生物，可以顯著提高epor的活性及效力，較之于epo，半衰期長，臨床依從性好，穩(wěn)定性高于epo，運輸保存和使用都優(yōu)于epo。

具體而言，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種促紅細胞生成素肽，其序列為seqidno.1：r1yr2cr3r4gpr5twvcr6r7r8，

其中，r1、r2、r5、r6、r7和r8分別獨立地為l型或d型氨基酸；

r3為lys、glu、asp、gln、asn、met、ser、tyr、pro或ile，所述r3為l型或d型氨基酸；

r4為met、phe或ile，所述r4為l型氨基酸。

優(yōu)選的，r1為leu；r2為ala；r3為lys、met、ser、tyr或ile；r4為met或phe；r5為ile；r6為pro；r7為leu；r8為arg。

優(yōu)選的，所述的促紅細胞生成素肽中的氨基酸分別獨立地為經(jīng)保護基團修飾的氨基酸；所述的保護基團優(yōu)選為叔丁氧羰基、氧叔丁基、三苯甲基、2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；蛳┍械囊环N或幾種。

第二方面，本發(fā)明提供了一種促紅細胞生成素肽衍生物，在以上任一所述的促細胞生成素肽的c端、n端或者側(cè)鏈的任一位置采用聚乙二醇進行修飾。

第三方面，本發(fā)明還提供了一種促細胞生成素肽衍生物，所述的促紅細胞生成素肽衍生物的通式為式(i)所示，

r9-r10-(ch2)n1-r11-(ch2)n2-r12-r13(i)

其中r9、r13選自權(quán)利要求1或2所述的促紅細胞生成素肽；n1、n2分別獨立地選自0～10的整數(shù)；r10、r12分別獨立地選自co或ch2基；r11選自n(ch2)n3nhr14、nco(ch2)n3nhr14、choconh(ch2)n3nhr14、chscon(ch2)n3nhr14或chnhcon(ch2)n3nhr14中的一種，其中n3選自2～10的整數(shù)，r14為甲氧基聚乙二醇。

優(yōu)選的，所述甲氧基聚乙二醇的分子量為5,000～100,000道爾頓，優(yōu)選為5000～50000道爾頓，更優(yōu)選為5000～30000道爾頓。

第四方面，本發(fā)明同時提供了一種促細胞生成素肽聚合物，所述的促細胞生成素肽聚合物采用以上任一項所述的促紅細胞生成素肽或者采用以上任一項所述的促紅細胞生成素肽衍生物作為重復(fù)結(jié)構(gòu)單元。

優(yōu)選的，所述的促紅細胞生成素肽為促紅細胞生成素肽或促細胞生成素肽衍生物的二聚體或2～10個重復(fù)結(jié)構(gòu)單元的多聚體。

優(yōu)選的，所述的促紅細胞生成素肽聚合物，其聚合方式選自s-s、c-n、c-o、c＝n、c-c、c＝c、c-s、co-s、co-nh鍵中的一種。

更優(yōu)選的，所述的促紅細胞生成素肽聚合物的聚合方式為co-nh、co-s或s-s鍵。

第五方面，本發(fā)明還提供了一種促紅細胞生成素肽的制備方法，包括如下步驟：

(1)采用固相合成法，依照促紅細胞生成素肽的連接次序在偶聯(lián)劑和反應(yīng)溶劑的作用下，依次進行氨基酸的偶聯(lián)，合成具有全保護的促紅細胞生成素肽；

(2)裂解得到促紅細胞生成素肽。

優(yōu)選的，所述偶聯(lián)劑選自以下幾種組合中的一種：(1)n，n′-二異丙基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑，

(2)六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯并三唑和n，n′-二異丙基乙胺，

(3)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和n，n′-二異丙基乙胺，

(4)六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯并三唑和n-甲基嗎啡啉，

(5)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和n-甲基嗎啡啉；

所述反應(yīng)溶劑選自n，n′-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、n-甲基吡咯烷酮、二甲基亞砜中的一種或幾種以上。

第六方面，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的游離形式或可藥用鹽形式的以上任一項所定義的促紅細胞生成素肽或者以上任一項所述的促紅細胞生成素肽衍生物或者以上任一項所述的促紅細胞生成素肽聚合物作為活性成分：一種或多種藥用載體物質(zhì)和/或稀釋劑。

第七方面，本發(fā)明還提供了以上任一項所述的促紅細胞生成素肽或以上任一項所述的促紅細胞生成素肽衍生物或以上任一項所述的促紅細胞生成素肽聚合物在用于治療紅細胞生成素不足或者低或者有缺陷的血紅細胞群體的疾病的藥物中的用途。

第八方面，本發(fā)明也提供了以上任一項所述的促紅細胞生成素肽或以上任一項所述的促紅細胞生成素肽衍生物或以上任一項所述的促紅細胞生成素肽聚合物在治療紅細胞生成素不足或者低或者有缺陷的血紅細胞群體的疾病中的用途。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的促紅細胞生成素肽及衍生物和聚合物可用于治療貧血癥或由貧血引起的相關(guān)疾病，具體地說，促紅細胞生成素肽及衍生物和聚合物對于制備療效更顯著副作用更低的治療貧血癥或由貧血引起的相關(guān)疾病的藥物將是有用的。

附圖說明

圖1為125i-epo競爭性結(jié)合實驗檢測rhepo與重組epo受體的結(jié)合活性圖。

圖2為不同編號的epo肽與重組epo受體的結(jié)合活性圖。

圖3為rhepo與無rhepo的fdcp-1/rhepor增殖曲線圖。

圖4為編號為1331的epo肽的fdcp-1/rhepor增殖曲線圖。

圖5為編號為1331的epo肽與epo的磷酸化檢測圖。

具體實施方式

如上所述，本發(fā)明的目的在于：提供一種促紅細胞生成素肽、聚合物和衍生物及其制備方法和用途。

其中，本發(fā)明的促紅細胞生成素肽可以作為促紅細胞生成素受體的激動劑，本發(fā)明中所定義的激動劑是指對作用受體有較強的親和力，也有較強的內(nèi)在活性，能通過受體興奮發(fā)揮作用的物質(zhì)，即能與該作用受體結(jié)合并能促進該受體活性的物質(zhì)；其中本發(fā)明中所述的促紅細胞生成素肽特指對epor有較強的親和力，從而使epor表現(xiàn)出活性的多肽。

本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)促紅細胞生成素肽在一定程度上可與epor相互作用，具體作用表現(xiàn)為此類肽結(jié)合epor并且刺激epo-依賴性細胞的增殖。此類epor生成素肽可以作為epo的替代物，因此在治療相關(guān)疾病上存在巨大的潛力。

所述的促紅細胞生成素肽為包括長度為16個氨基酸的單體肽激動劑。

其中，在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述的促紅細胞生成素肽的序列為seqidno.2：h-leu-tyr-ala-cys-lys-met-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh；

在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式中，所述的促紅細胞生成素肽的序列為：seqidno.3：h-leu-tyr-ala-cys-tyr-met-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh；

在本發(fā)明的又一種優(yōu)選實施方式中，所述的促紅細胞生成素肽的序列為：其序列為seqidno.4：h-leu-tyr-ala-cys-ile-met-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh；

在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式中，所述的促紅細胞生成素肽的序列為seqidno.5：h-leu-tyr-ala-cys-ser-met-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh；

在本發(fā)明的又一種優(yōu)選實施方式中，所述的促紅細胞生成素肽的序列為seqidno.6：h-leu-tyr-ala-cys-met-met-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh；

在本發(fā)明的再一種優(yōu)選實施方式中，所述的促紅細胞生成素肽的序列為seqidno.7：h-leu-tyr-ala-cys-lys((peg)10)-ch2ch2-phe-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh。

同時本發(fā)明提供了一種促紅細胞生成素肽衍生物，其中所述促紅細胞生成素肽衍生物是指單體肽氨基酸的n端、c端或氨基酸側(cè)鏈的任一位置采用聚乙二醇進行修飾。

同時，本發(fā)明提供了一種促紅細胞生成素肽聚合物，其中聚合物為二聚物或者多聚物，聚合物將促紅細胞生成素肽作為重復(fù)結(jié)構(gòu)單元，其重復(fù)結(jié)構(gòu)單元的重復(fù)個數(shù)優(yōu)選為2～10個，單體肽與單體肽之間采用s-s、c-n、c-o、c＝n、c-c、c＝c、c-s、co-nh鍵等方式進行連接，優(yōu)選采用s-s或co-nh鍵進行縮聚。而且通過二聚或多聚的方式，此類多肽化合物也可以顯示出顯著的效力和活性。

而且，本發(fā)明提供了一種促紅細胞生成素肽衍生物，其通式為式(i)所示，

r9-r10-(ch2)n1-r11-(ch2)n2-r12-r13(i)

其中r9、r13選自權(quán)利要求1或2所述的促紅細胞生成素肽；n1、n2分別獨立地選自0～10的整數(shù)；r10、r12分別獨立地選自co或ch2基；r11選自n(ch2)n3nhr14、nco(ch2)n3nhr14、choconh(ch2)n3nhr14、chscon(ch2)n3nhr14或chnhcon(ch2)n3nhr14中的一種，其中n3選自2～10的整數(shù)，r14為甲氧基聚乙二醇。甲氧基聚乙二醇的分子量為5,000～100,000道爾頓，優(yōu)選為(5000～50000道爾頓)，更優(yōu)選為(5000～30000道爾頓)。

本發(fā)明還提供了促紅細胞生成素肽的制備方法，但不局限于下列方法：

本發(fā)明的路線以如下序列為例進行描述：h-leu-tyr-ala-cys-lys-met-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh

采用固相合成法，以ctc樹脂/王樹脂為起始樹脂，按照所述的促紅細胞生成素肽主鏈肽序依次偶聯(lián)具有n端fmoc保護且側(cè)鏈保護的氨基酸；最后肽樹脂裂解，純化，凍干后得到目標(biāo)化合物。

為此本發(fā)明提供了促紅細胞生成素肽的合成方法，其步驟如下：

步驟1，在活化劑系統(tǒng)的存在下，由樹脂固相載體和fmoc-arg(pbf)-oh偶聯(lián)得到fmoc-arg(pbf)-樹脂；

步驟2，通過固相合成法，按照促紅細胞生成素肽主鏈肽序依次偶聯(lián)具有n端fmoc保護且側(cè)鏈保護的氨基酸；

步驟3，裂解，純化，凍干，得到促紅細胞生成素肽及其類似物。

其中，步驟1所述樹脂固體載體采用2-ctc樹脂，所述活化劑系統(tǒng)選自diea、tmp或nmm，所述fmoc-arg(pbf)-樹脂為0.10～0.80mmol/g取代度的fmoc-arg(pbf)-ctc樹脂可以自己合成，也可以直接通過購買得到。

其中，步驟1所述樹脂固體載體采用王樹脂，所述活化劑系統(tǒng)由dic、hobt和dmap組成，所述fmoc-arg(pbf)-樹脂為0.10～0.80mmol/g取代度的fmoc-arg(pbf)-王樹脂可以自己合成，也可以直接通過購買得到。

其中，步驟2所述的固相合成方法，包括如下步驟：

1)采用由體積比為1:4的哌啶和dmf組成的去保護液脫除fmoc-arg(pbf)-樹脂上的fmoc保護基，得到h-arg(pbf)-樹脂；

2)在偶聯(lián)劑和反應(yīng)溶劑的作用下，h-arg(pbf)-樹脂和fmoc保護且側(cè)鏈保護的亮氨酸偶聯(lián)得到fmoc-leu-arg(pbf)-樹脂；

3)重復(fù)步驟1)、2)，按照促紅細胞生成素肽主鏈肽序依次進行氨基酸的偶聯(lián)，偶聯(lián)氨基酸順序為：

fmoc-pro-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-val-oh、

fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-met-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-leu-oh；

所述偶聯(lián)劑選自以下幾種組合中的一種：(1)n，n′-二異丙基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑，

(2)六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯并三唑和n，n′-二異丙基乙胺，

(3)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和n，n′-二異丙基乙胺，

(4)六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯并三唑和n-甲基嗎啡啉，

(5)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和n-甲基嗎啡啉；

所述反應(yīng)溶劑選自n，n′-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、n-甲基吡咯烷酮、二甲基亞砜中的一種或幾種以上。

下面結(jié)合附圖和具體的實施例對本發(fā)明作進一步的詳細的說明。但是，這些實施例僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明范圍的限制。

其中，實施例中所用的試劑和儀器的廠商型號如下：

fmoc-arg(pbf)-王樹脂，購自吉爾生化(上海)有限公司；

氨基酸，購自吉爾生化(上海)有限公司；

二甲基甲酰胺，購自浙江江山化工股份有限公司；

哌啶，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；

dcm(二氯甲烷)，購自浙江衢化氟化學(xué)有限公司；

meoh(甲醇)，購自(臨海市浙東特種試劑廠)

苯甲醚，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；

tfa(三氟醋酸)，購自浙江化工院科技有限公司；

dic(n，n’-二異丙基碳二亞胺)，購自淄博天堂山化工有限公司；

hobt(1-羥基苯并三唑)，購自蘇州昊帆生物科技有限公司；

diea(n,n’-二異丙基乙胺)，購自蘇州吳帆生物科技有限公司；

c18柱，c8柱，購自daisogel；

質(zhì)譜儀，型號maldi-tof4700，廠商absciex；

制備型高效液相色譜儀，型號lc3000，廠商北京創(chuàng)新通恒科技有限公司。

其中，本發(fā)明中所用的細胞：中國倉鼠卵巢細胞(chinesehamsterovary，cho)和小鼠骨髓細胞(fdcp-1)，均購自于：atcc公司。

rpmi培養(yǎng)基，購自：thermofisherscientific；

本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義；

fmoc：芴甲氧羰基

fmoc-aa：芴甲氧羰基保護的氨基酸

dic：n，n′-二異丙基碳化二亞胺

dcc：n，n′-二環(huán)己基碳二亞胺

pybop：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷

hatu：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯

hobt：1-羥基苯并三唑

tbu：叔丁基

otbu：叔丁氧基

trt：三苯甲基

boc：叔丁氧羰基

pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?/p>

cys：半胱氨酸

pro：脯氨酸

leu：亮氨酸

gly：甘氨酸

arg：精氨酸

ala：丙氨酸

lys：賴氨酸

tyr：酪氨酸

met：蛋氨酸

ile：異亮氨酸

thr：蘇氨酸

trp：色氨酸

val：纈氨酸

dmf：n，n′-二甲基甲酰胺

meoh：甲醇

dcm：二氯甲烷

nmp：n-甲基吡咯烷酮

dmso：二甲基亞砜

tfa：三氟醋酸

piperidine：六氫吡啶

dmap：4-二甲氨基吡啶

diea：n，n′-二異丙基乙胺

tmp：2,4,6-三甲基吡啶。

實施例中提到的真空干燥和冷凍干燥用到的凍干設(shè)備型號及生產(chǎn)廠家說明如下：

凍干設(shè)備：凍干機fd-3(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；

凍干條件：將凍干盤放入冰箱冷凍室(-20℃)中，預(yù)凍6h。開啟凍干機，打開制冷，預(yù)冷30min以上，設(shè)置凍干曲線如下：

第一段：在-27℃運行16h；第二段：在-5℃運行4h；第三段：在5℃運行2h；第四段：在30℃運行16h。

(一)促紅細胞生成素肽(epo肽)的制備

實施例一

促紅細胞生成素肽的合成，其序列為seqidno.2：h-leu-tyr-ala-cys-lys-met-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh的合成

(1)稱取0.1mmol取代度為0.52mmol/g的fmoc-arg(pbf)-王樹脂，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌1次，用dmf溶脹fmoc-arg(pbf)-王樹脂30分鐘后，用dmf：吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去fmoc保護，然后用dmf洗滌6次，稱取fmoc-leu-oh0.5mmol、hobt0.5mmol加入體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，冰水浴下加入80μldic(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點。

(2)重復(fù)上述脫除fmoc保護和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成fmoc-pro-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-met-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-leu-oh的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用dmf洗滌3次，dcm洗滌3次，meoh洗滌3次，dcm洗滌3次，meoh洗滌3次，抽干得到0.751g粗肽樹脂。

(3)裂解：稱取0.751g全保護的肽樹脂，加入到25ml的三口圓底燒瓶中，按tfa：苯甲醚＝95：5的體積比配置裂解液10ml，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時，過濾，用少量tfa洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽186.2mg。

(4)純化，凍干：將上述粗肽用50ml水溶解后，然后通過c18柱進行兩次純化，脫鹽，旋蒸濃縮，凍干后得到目標(biāo)產(chǎn)物(18.7mg，10.11％)。其中純化條件為，流動相為：a相：0.1％tfa；b相：乙腈；梯度程序為：15％b，60分鐘內(nèi)至60％b；檢測波長220nm；收集目的峰餾分。脫鹽的條件為流動相：a相：20mmol/l乙酸銨的水溶液:乙腈＝95:5；b相：水:乙腈＝95:5；c相：0.03％醋酸的水溶液:乙腈＝95:5；d相：0.03％醋酸的水溶液:乙腈＝50:50；梯度程序為：以流動相a等梯度洗脫15分鐘，轉(zhuǎn)換成流動相b等梯度洗脫10分鐘,轉(zhuǎn)換成流動相c等梯度洗脫10分鐘,轉(zhuǎn)換成流動相d等梯度洗脫25分鐘；檢測波長220nm；收集目的峰餾分。同時用maldi-tof分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為1850.3627(理論量為1849)。

實施例二

促紅細胞生成素肽的合成，其序列為seqidno.3：h-leu-tyr-ala-cys-tyr-met-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh的合成

(1)稱取0.1mmol取代度為0.52mmol/g的fmoc-arg(pbf)-王樹脂，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌1次，用dmf溶脹fmoc-arg(pbf)-王樹脂30分鐘后，用dmf：吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去fmoc保護，然后用dmf洗滌6次，稱取fmoc-leu-oh0.5mmol、hobt0.5mmol加入體積比為1：1的dcm和dmf混合溶液，冰水浴下加入80μldic(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點。

(2)重復(fù)上述脫除fmoc保護和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成fmoc-pro-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-met-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-leu-oh的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用dmf洗滌3次，dcm洗滌3次，meoh洗滌3次，dcm洗滌3次，meoh洗滌3次，抽干得到0.726g粗肽樹脂。

(3)裂解：稱取0.726g全保護的肽樹脂，加入到25ml的三口圓底燒瓶中，按tfa：苯甲醚＝95：5的體積比配置裂解液10ml，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時，過濾，用少量tfa洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽167.9mg。

(4)純化，凍干：將粗肽用50ml水溶解后，而后通過c8柱2次純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物(17.5mg，9.26％)，用maldi-tof分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為1885.8624(理論量為1885)。

實施例三

促紅細胞生成素肽的合成，其序列為seqidno.4：h-leu-tyr-ala-cys-ile-met-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh的合成

(1)稱取0.1mmol取代度為0.52mmol/g的fmoc-arg(pbf)-王樹脂，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌1次，用dmf溶脹fmoc-arg(pbf)-王樹脂30分鐘后，用dmf：吡啶體積比為4：1的混合溶液脫去fmoc保護，然后用dmf洗滌6次，稱取fmoc-leu-oh0.5mmol、hobt0.5mmol加入體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，冰水浴下加入80μldic(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點。

(2)重復(fù)上述脫除fmoc保護和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成fmoc-pro-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-met-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-leu-oh的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用dmf洗滌3次，dcm洗滌3次，meoh洗滌3次，dcm洗滌3次，meoh洗滌3次，抽干得到0.689g粗肽樹脂。

(3)稱取0.689g全保護的肽樹脂，加入到25ml的三口圓底燒瓶中，按tfa：苯甲醚＝95：5的體積比配置裂解液10ml，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時，過濾，用少量tfa洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽163.7mg。

(4)純化，凍干：將粗肽用50ml水溶解后，而后通過c18柱2次純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物(17.3mg，9.40％)，用maldi-tof分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為1835.8972(理論量為1835)。

實施例四：

促紅細胞生成素肽的合成，其序列為seqidno.5：h-leu-tyr-ala-cys-ser-met-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh的合成

(1)稱取0.1mmol取代度為0.52mmol/g的fmoc-arg(pbf)-王樹脂，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌1次，用dmf溶脹fmoc-arg(pbf)-王樹脂30分鐘后，用dmf：吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去fmoc保護，然后用dmf洗滌6次，稱取fmoc-leu-oh0.5mmol、hobt0.5mmol加入體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，冰水浴下加入80μldic(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點。

(2)重復(fù)上述脫除fmoc保護和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成fmoc-pro-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-met-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-leu-oh的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用dmf洗滌3次，dcm洗滌3次，meoh洗滌3次，dcm洗滌3次，meoh洗滌3次，抽干得到0.689g粗肽樹脂。

(3)裂解：稱取0.689g全保護的肽樹脂，加入到25ml的三口圓底燒瓶中，按tfa：苯甲醚＝95：5的體積比配置裂解液10ml，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時，過濾，用少量tfa洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽175.4mg。

(4)純化，凍干：將粗肽用50ml水溶解后，而后通過c18柱2次純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物(19.8mg，10.94％)，用maldi-tof分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為1809.9533(理論量為1809)。

實施例五

促紅細胞生成素肽的合成，其序列為seqidno.6：h-leu-tyr-ala-cys-met-met-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh的合成

(1)稱取0.1mmol取代度為0.52mmol/g的fmoc-arg(pbf)-王樹脂，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌1次，用dmf溶脹fmoc-arg(pbf)-王樹脂30分鐘后，用dmf：吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去fmoc保護，然后用dmf洗滌6次，稱取fmoc-leu-oh0.5mmol、hobt0.5mmol加入體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，冰水浴下加入80μldic(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點。

(2)重復(fù)上述脫除fmoc保護和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成fmoc-pro-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-met-oh、fmoc-met-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-leu-oh的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用dmf洗滌3次，dcm洗滌3次，meoh洗滌3次，dcm洗滌3次，meoh洗滌3次，抽干得到0.730g粗肽樹脂。

(3)裂解：稱取0.730g全保護的肽樹脂，加入到25ml的三口圓底燒瓶中，按tfa：苯甲醚＝95：5的體積比配置裂解液10ml，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時，過濾，用少量tfa洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽165.7mg。

(4)純化，凍干：將粗肽用50ml水溶解后，而后通過c18柱2次純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物(17.1mg，9.24％)，用maldi-tof分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為1853.8677(理論量為1853)。

實施例六

促紅細胞生成素肽的合成，其序列為seqidno.7：h-leu-tyr-ala-cys-lys((peg)10)-ch2ch2-phe-gly-pro-ile-thr-trp-val-cys-pro-leu-arg-oh的合成

(1)稱取0.1mmol取代度為0.52mmol/g的fmoc-arg(pbf)-王樹脂，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌1次，用dmf溶脹fmoc-arg(pbf)-王樹脂30分鐘后，用dmf：吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去fmoc保護，然后用dmf洗滌6次，稱取0.177gfmoc-leu-oh(0.5mmol)、0.068ghobt(0.5mmol)加入體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，冰水浴下加入80μldic(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點。

(2)重復(fù)上述脫除fmoc保護和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成fmoc-pro-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-lys(dde)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、boc-leu-oh的偶聯(lián)，將3％水合肼dmf溶液加入樹脂反應(yīng)30min后，偶聯(lián)fmoc-nh-peg10-ch2ch2cooh。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用dmf洗滌3次，dcm洗滌3次，meoh洗滌3次，dcm洗滌3次，meoh洗滌3次，抽干得到0.825g粗肽樹脂。

(3)裂解：稱取0.825g全保護的肽樹脂，加入到25ml的三口圓底燒瓶中，按tfa：苯甲醚＝95：5的體積比配置裂解液10ml，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時，過濾，用少量tfa洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽193.7mg。

(4)純化，凍干：將粗肽用50ml水溶解后，而后通過c18或c8柱2次純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物(19.4mg，8.16％)，用maldi-tof分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為2377.7428(理論量為2377)。

(二)促紅細胞生成素肽(epor肽)的活性測定

實驗方法與結(jié)果

1、epo肽的制備

epo肽：將實施例一到實施例五得到的目標(biāo)多肽分別編號為1329，1330，1331，1332，1333，備用。

2、epo受體的表達純化及其固定

我們在epor胞外段(epoecd)羧基端接上hpap(人胎盤堿性磷酸酶)的羧基端信號序列，并在兩序列前加入凝血酶酶切位點，將其融合表達于cho細胞中。聚乙烯板上固定有hpap抗體，可以用來識別hpap部分，從而將epo-r固定在檢測孔中。

細胞培養(yǎng)所需的rpmi培養(yǎng)液中均包含1％bsa。hpap信號序列可以通過磷脂酰聚糖將融合蛋白錨定在細胞表面。重組epor用磷脂酶c處理后，用抗hpap區(qū)域抗體(mab179)將融合蛋白固定在聚苯乙烯孔中。

3、125i-epo競爭性結(jié)合實驗檢測rhepo與重組epo受體的結(jié)合活性

按照上述步驟重組表達epor(rhepor)，并將rhepor固定于聚苯乙烯微孔中，然后加入放射性標(biāo)記的125i-rhepo(600ci/mmol)，其中一孔僅加入1umrhepo作為非特異性檢測對照孔。4℃孵育2h后洗滌微孔，allfit方法分析數(shù)據(jù)。其結(jié)果如圖1所示，125i-rhepo與rhepo競爭性結(jié)合rhepor，加入了rhepo的溶液，其放射活性下降，而且隨著加入的rhepo的濃度升高(從10^-12m，10^-11m，10^-10m，10^-9m，10^-8m，10^-7m，10^-6m)，溶液的放射活性結(jié)合率值越低。通過圖1曲線由alldfit分析方法計算得到rhepo與重組epor的解離系數(shù)大約為200pm，與天然受體的解離值接近。

其中，放射活性結(jié)合率是指，放射性標(biāo)記125i-epo與epo肽或rhepo競爭性結(jié)合epor時，結(jié)合的放射性標(biāo)記125i-epo與總濃度125i-epo之比，即[125i-epo]結(jié)合濃度/[125i-epo]總濃度*100％；其中，解離系數(shù)是指50％受體被配體結(jié)合時配體的濃度，用來反映反應(yīng)的親和力。

4、epo肽的結(jié)合活性測定

epo肽(肽編號1329，1330，1331，1332，1333)分別溶解于100％的dmso中，使終濃度分別為50mm，作為epo肽儲備液。將epo肽儲備液分別用結(jié)合液(磷酸鹽溶液，na2co31.59g，nahco32.94g，加蒸餾水定容至1000ml)稀釋至使用濃度(10^-10m，10^-9m，10^-8m，10^-7m，10^-6m，10^-5m，10^-4m，10^-3m)，后加入固定有epor的聚苯乙烯微孔中，再加入放射性標(biāo)記125i-rhepo與epo肽競爭性結(jié)合epor受體，其中一孔僅加入1umrhepo作為非特異性檢測對照孔。4℃孵育2h后洗滌微孔，allfit方法分析數(shù)據(jù)。其結(jié)果如圖2所示，加入放射性標(biāo)記的125i-rhepo，125i-rhepo與epo短肽競爭性結(jié)合epor受體，從圖2可以看出，含有五種多肽的溶液的放射活性均呈現(xiàn)了不同程度的下降，而且短肽的濃度越高，放射活性結(jié)合率越低；其中，編號為1331的肽溶液的放射活性下降速度最快，而且當(dāng)肽1331的濃度為10^-6m時，放射活性下降到20％以下，當(dāng)肽1331的濃度為10^-4m時，幾乎檢測不到放射活性。圖2的實驗結(jié)果表明肽1331的活性最佳。

5、epo肽的體外活性測定

為了測定epo肽能否作用于epor真核細胞。我們用全長人源epor轉(zhuǎn)染fdcp-1細胞，制備得到fdcp-1/hepor細胞。其中，fdcp-1細胞為小鼠骨髓的一種造血祖細胞。

epo的fdcp-1/rhepor增殖曲線：fdcp-1/hepor細胞于含10％fcs、1nmrheporpmi中培養(yǎng)至密度為10⁶/ml后，用pbs洗滌去除rhepo，并用不含rhepo的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)過夜。將細胞按每孔10⁵個細胞鋪板，并按指示量加入rhepo(10^-12m，10^-11m，10^-10m，10^-9m)，48小時后利用mtt實驗，在570nm波長處比色測定細胞增殖，其結(jié)果如圖3所示。圖3中的曲線代表的含義分別為：利用rhepo刺激fdcp-1/rhepor細胞后的細胞增殖曲線以及無rhepo刺激的細胞增殖曲線。圖3的結(jié)果表明相比較無rhepo的培養(yǎng)液，利用含rhepo的培養(yǎng)液培養(yǎng)，可以促進fdcp-1/rhepor細胞的增殖，而且隨著rhepo的濃度增加，fdcp-1/rhepor細胞的增殖越快。圖3的結(jié)果表明rhepo可以刺激重組fdcp-1/rhepor細胞的增殖。

編號為1331的epo短肽的fdcp-1/rhepor增殖曲線：將epo短肽1331溶解于100％的dmso中，終濃度為50mm。并用無血清rpmi稀釋至使用濃度(10^-7m，10^-6m，10^-5m，10^-4m)。fdcp-1/hepor細胞于含10％fcs、1nmrheporpmi中培養(yǎng)至密度為10⁶/ml后，用pbs洗滌去除rhepo，并用不含rhepo的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)過夜。將細胞按每孔10⁵個細胞鋪板，并按指示量加入epo短肽1331，48小時后利用mtt實驗，在570nm波長處比色測定細胞增殖，其結(jié)果如圖4所示。從圖4的結(jié)果顯示，epo刺激細胞株增殖，ec50值為10^-20pm。圖4的結(jié)果表明，肽1331作為epor激動劑，能刺激細胞增殖。增殖作用的發(fā)生均依賴于epo的存在。

圖3和圖4的實驗結(jié)果表明，細胞增殖活性的發(fā)生依賴于epo短肽，而非epo的污染。同時我們在epo短肽的fdcp-1/hepor增殖實驗中添加1％兔多克隆血清。多克隆血清可完全抑制epo活性，結(jié)果顯示多克隆血清的加入并未對epo短肽的增殖活性有影響。

6、絡(luò)氨酸酶磷酸化分析

epo與epor結(jié)合后，epor形成二聚體，然后通過信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)紅系細胞的增生和分化，其中涉及多種信號通路途徑。在此過程中，epo可以激活多種蛋白受體，導(dǎo)致如jak2、vav、epor、shc的磷酸化激活。2×10⁶/mlfdcp-1/rhepor細胞用含10％fcs，2nmrhepo培養(yǎng)，收集后重懸于無rhepo培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h。而后細胞計數(shù)并按照每孔0.5×10⁶/ml鋪板。細胞分別用rhepo(10^-5m)和編號為1331的epo肽(10^-5m)刺激10min，采用無菌水作為對照組。采用免疫印跡(immunobloting)方式檢測磷酸化類別。抗體采用抗絡(luò)氨酸磷酸化單克隆抗體作為檢測抗體。

其結(jié)果如圖5所示，其中c為marker的蛋白分子質(zhì)量，marker購自于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

結(jié)果顯示rhepo誘導(dǎo)的磷酸化蛋白分子量大約為140，95，70，55kd。這些蛋白可對應(yīng)于jak2，vav，epor，shc。肽1331與epo產(chǎn)生相同的磷酸化類別，因此肽1331在人體中與epo信號傳導(dǎo)的調(diào)控過程一致。

最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。

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