專利名稱：無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型促紅細(xì)胞生成素及其用途，更具體地說(shuō)是提供一種具有神經(jīng) 保護(hù)作用，但無(wú)促紅細(xì)胞生成的副作用的新型促紅細(xì)胞生成素及其在制藥中的用途，屬 于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素(EPO)是由腎臟合成和分泌的一種生長(zhǎng)因子，能促使紅細(xì)胞生 產(chǎn)和成熟(紅細(xì)胞生成)。最初認(rèn)為EPO僅僅與紅細(xì)胞的生產(chǎn)和成熟有關(guān)，但最近的研 究發(fā)現(xiàn)EPO除了具有促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用之外，還有很強(qiáng)的促進(jìn)神經(jīng)元生存(神經(jīng) 保護(hù))的作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，EPO可以減輕或抑制由缺糖缺氧NMDA毒性，自由基 等多種因素引起的神經(jīng)元損傷。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，EPO注射可以減少缺血梗死面積， 同時(shí)可以改善神經(jīng)功能恢復(fù)。最近的一個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞在中風(fēng)5小時(shí)給予 大劑量EPO注射(33000U/次)，可以明顯減少由大腦中動(dòng)脈阻塞所致的腦梗死體積， 同時(shí)可以明顯提高病人的祌經(jīng)功能和臨床結(jié)果。這一進(jìn)展意義重大，其一，目前中風(fēng) 唯一有效的藥物是t-PA，其治療窗口為中風(fēng)后3小時(shí)內(nèi)，而EPO擴(kuò)大了治療窗口，從 而使更多中風(fēng)患者得到治療；其二， EPO作為新型腦保護(hù)治療試劑可以用于中風(fēng)后神 經(jīng)功能康復(fù)治療。然而，由于腦保護(hù)屏障的作用，只有不到1%EP0可穿過(guò)血腦屏障 而進(jìn)入大腦。因此，需要大劑量注射才內(nèi)能在大腦內(nèi)達(dá)到一定治療濃度，其劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn) 高于治療貧血所使用的劑量。同時(shí)，EPO的祌經(jīng)保護(hù)作用是通過(guò)激活一系列信號(hào)通道 而實(shí)現(xiàn)的，比如PI3/Akt系統(tǒng)，而EPO誘導(dǎo)的PI3/Akt信號(hào)通常僅能維持48小時(shí)，因 此需要多次注射來(lái)維持生存信號(hào)的激活。大劑量，多次注射EPO會(huì)產(chǎn)生一連串高風(fēng)險(xiǎn) 的副作用，比如紅細(xì)胞壓積升高而使血液變得粘稠，同時(shí)EPO可刺激血小板的生成。 這些高危因素可導(dǎo)致紅色血栓形成從而增加腦卒中患者發(fā)生再次中風(fēng)的可能。因此， 若能選擇性的降低或去除EPO的促紅細(xì)胞生成作用，而維持其神經(jīng)保護(hù)作用，將帶來(lái) 腦中風(fēng)治療的變革。本發(fā)明即是提供一種新型的無(wú)促紅細(xì)胞生成作用，但有神經(jīng)保護(hù) 作用的新型EPO。
EPO與EPO受體結(jié)合后，激活一系列信號(hào)通路而促進(jìn)細(xì)胞的生成和成熟。在EPO 分子中，有三個(gè)區(qū)域與EPO受體結(jié)合有關(guān)，這三個(gè)區(qū)域分別是第11至15號(hào)氨基酸(詳見(jiàn)SEQ ID No.4)，第44至51號(hào)氨基酸(SEQ ID No.5)以及第100至108號(hào)氨基酸 (SEQIDNo.6)。研究發(fā)現(xiàn)，若在上述三個(gè)區(qū)域中發(fā)生點(diǎn)突變，EPO分子將失去與EPO 受體結(jié)合的能力，從而失去刺激紅細(xì)胞生成的功能。EPO具有神經(jīng)保護(hù)作用，目前的 研究認(rèn)為EPO通過(guò)與神經(jīng)元上的EPO受體結(jié)合，激活與促紅細(xì)胞生成相同的信號(hào)通
路而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。因此，從理論上來(lái)講，破壞EPO受體結(jié)合位點(diǎn)后，EPO將不
再具有祌經(jīng)保護(hù)作用。
因此現(xiàn)階段制備具有神經(jīng)保護(hù)作用無(wú)促紅細(xì)胞作用的EPO是本領(lǐng)域技術(shù)人員研 究的重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有神經(jīng)保護(hù)作用，但無(wú)促紅細(xì)胞生成特性 的新型促紅細(xì)胞生成素。
本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供這種具有神經(jīng)保護(hù)作用，但無(wú)促紅細(xì)胞 生成特性的新型促紅細(xì)胞生成素在制藥領(lǐng)域的用途。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一種無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素，為野生型人促 紅細(xì)胞生成素在下述三個(gè)區(qū)域中至少一個(gè)區(qū)域進(jìn)行突變而產(chǎn)生的變構(gòu)體
(1) VLQRY:人促紅細(xì)胞生成素的第11-15號(hào)氨基酸；
(2) TKVNFYAW:人促紅細(xì)胞生成素的第44-51號(hào)氨基酸；
(3) SGLRSLTTL:人促紅細(xì)胞生成素的第100-108號(hào)氨基酸。
所述突變?yōu)閱吸c(diǎn)或多點(diǎn)突變、單個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、以及突變加缺失復(fù)合突變。
所述無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素為序列表SEQ ID No.7至SEQ ID No.68中的任一氨基酸序列。
所述的無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素，特別是第14號(hào) 精氨基突變?yōu)楸被?序列#14)，谷氨酰胺(序列H15)以及谷氨酸(序列#16);第45 號(hào)賴氨酸突變?yōu)楸被?序列#21)以及谷氨酸(序列#22);第100號(hào)絲氨酸突變?yōu)楸?氨基(序列以及谷氨酸(序列tt34);第103號(hào)精氨基突變?yōu)楸被?序列tt39)以 及谷氨酸(序列#40);第104號(hào)絲氨酸突變?yōu)楸被?序列#44)，異亮氨酸(序列#45) 以及谷氨酸(序列M6)。
所述的無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素，除上述所述三 個(gè)區(qū)域外，在人促紅細(xì)胞生成素的第6， 7， 10， 20， 21， 29, 33， 38， 42， 52， 59， 63，
467， 70， 83， 96， 97， 126， 142， 149， 150， 151， 152， 153， 155， 156， 161號(hào)氨基酸
位置至少發(fā)生一個(gè)突變而產(chǎn)生的變構(gòu)體。
所述的無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素在制備、保持、
增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用，或用于神經(jīng)功能康復(fù)治療的藥物的應(yīng)用。
所述的無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素在制備用于中樞 神經(jīng)系統(tǒng)以外的臟器，如心臟、腎臟等臟器的缺血性損傷的治療藥物中的應(yīng)用。
人類EP0 cDNA(序列W)編碼193個(gè)氨基酸(序列tt2) ， EPO初級(jí)蛋白合成后， 其氨基端含27個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽經(jīng)切割后變?yōu)槌墒霦P0(序列tt3)。因此成熟的 人類EPO為166個(gè)氨基酸。下面所列出的突變型人類促紅細(xì)胞生成素的氨基酸序列均 為成熟后的氨基酸序列。
人類EPO cDNA用PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得了 62個(gè)新突變型EPO cDNA。 這些突變主要集中在以下三個(gè)與EPO受體結(jié)合有關(guān)區(qū)域內(nèi)VLQRY(人促紅細(xì)胞生成 素的第11-15號(hào)氨基酸，序列SEQ ID No.4)，TKVNFYAW (人促紅細(xì)胞生成素的第44-51 號(hào)氨基酸，序列SEQ ID No.5)和SGLRSLTTL (人促紅細(xì)胞生成素的第100-108號(hào)氨 基酸，序列SEQIDNo.6)。將這些突變后的EPOcDNA裝入真核表達(dá)載體并在人胚腎 293細(xì)胞系中進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)篩選穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株,我們成功制備了 62個(gè)含有單個(gè)突 變氨基酸的新型突變型EPO(mEPO)融合蛋白，這些mEPO融合蛋白的具體突變位點(diǎn) 如下(其中第一和第三個(gè)字母分別為正常和突變后的氨基酸，兩字母之間的數(shù)字為成 熟促紅細(xì)胞生成素的氨基酸序號(hào)，具體氨基酸序列詳見(jiàn)序列表)
16A-EP0(序列tt7),C7A-EPO(序列#8)，C7S-EP0(序列晚
R10I-EP0(序列,),VI1S EP0(序列ftll)，L12A-EP0(序列#12),
E13A-EP0(序列共13)，R14A-EP0(序列#14),R14Q-EP0(序列#15),
R14E-EP0(序列#16)，Y15A-EP0(序列ftl7),Y15P-EP0(序列#18),
Y15I-EP0(序列譜)，T44I-EP0(序列1120)，K45A-EP0(序列#21),
K45E-EP0(序列ft22)，V46A-EP0(序列#23)，N47A-EPO(序列#24)，
F48A-EP0(序列#25),F48I-EP0(序列共26),Y49A-EP0(序列#27),
Y49S-EP0(序列tt28),W51E-EP0(序列H29),W51F-EPO(序列#30)'
K52A-EP0(序列#31)，K97A-EP0(序列S100A-EPO(序列#33)，
S100E-EP0(序列#34),S100T-EP0(序列tt35)，G101A-EPO(序列#36),
G101I-EP0(序列tt37),L102A-EP0(序列tt38)，R103A-EPO(序列#39),R103E--EPO(序列#40),R103H--EP0(序列#41),R103N-EP0(序列#42),
R103Q--EPO(序列M3)'S104A--EPO(序列闊，S104I-EP0(序列#45),
S104E--EP0(序列糾6)，L105A--EPO(序列#47)，T106A-EP0(序列糊)，
T106I--EPO(序列#49),T107A--EPO(序列#50),T107I-EP0(序列
L108A--EPO(序列#52),L108E--EPO(序列tt53),L108K-EPO(序列#54),
L108S--EPO(序列#55)，S146A--EPO(序列#56)，N147A-EP0(序列#57)，
F148A--EPO(序列tt58)，F(xiàn)148Y--EPO(序列#59),L149A-EP0(序列■),
R150A--EPO(序列R150E--EPO(序列恥2)，R150I-EP0(序列#63)，
G151A--EPO(序列#64)，K152A--EP0(序列#65)，K152W-EP0(序列tt66),
C161A-EP0(序列#67)， R162A-EP0(序列貼8)
我們用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)這些mEP0是否具有促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用進(jìn)行了研 究，發(fā)現(xiàn)mEP0喪失了維持紅細(xì)胞生成素依賴性細(xì)胞株(32D-EP0R)生存的特性；體內(nèi)實(shí) 驗(yàn)進(jìn)一步證明大劑量、多次注射mEPO不增加小鼠的紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白值。這些實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)表明mEP0喪失了促進(jìn)紅細(xì)胞生成的能力。令人興奮的是這些突變體和野生型 EP0 —樣，無(wú)論在體內(nèi)還是體外都具有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用，不僅能夠抑制缺氧和缺 葡萄糖或麗DA毒性有道德祌經(jīng)細(xì)胞死亡的作用，而且體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)mEP0能夠顯著減 少小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型腦梗死體積。此研究結(jié)果令人意外因?yàn)槟壳暗难芯空J(rèn)為 EPO具有神經(jīng)保護(hù)作用，而神經(jīng)保護(hù)作用是通過(guò)EPO與神經(jīng)元上的EPO受體結(jié)合， 激活與促紅細(xì)胞生成相同的信號(hào)通路而發(fā)揮作用。因此，從理論上來(lái)講，破壞EPO受 體結(jié)合位點(diǎn)后，EPO將不再具有神經(jīng)保護(hù)作用。令人意想不到的是，點(diǎn)突變破壞了 EPO 受體結(jié)合位點(diǎn)后，EPO仍具有神經(jīng)保護(hù)作用，使這種突變型促紅細(xì)胞生成素成為一種 無(wú)促紅細(xì)胞生成作用，但有神經(jīng)保護(hù)作用的新型神經(jīng)保護(hù)藥物。
到目前為止所有治療中風(fēng)的試劑，若在中風(fēng)48小時(shí)后給藥，均無(wú)治療效果。令人 興奮地是新型腦保護(hù)藥物在48小時(shí)后給藥(遲發(fā)性)，仍具有明顯的改善神經(jīng)功能的 作用。此結(jié)果意義重大，目前中風(fēng)唯一有效的藥物是t-PA，其治療窗口非常短，為中 風(fēng)后3小時(shí)內(nèi)，因此只有不到10%的中風(fēng)患者適合t-PA治療。而EPO擴(kuò)大了治療窗口 ， 從而使更多中風(fēng)患者得到治療。此外，新型腦保護(hù)藥物可以長(zhǎng)期注射而對(duì)血液系統(tǒng)沒(méi) 有刺激作用，特別適用于用于腦中風(fēng)的康復(fù)治療。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效益(1)新型腦保護(hù)藥物具有神經(jīng)保護(hù)作用，但無(wú)促紅細(xì)胞生 成作用，從而避免了常規(guī)促紅細(xì)胞生成素有可能導(dǎo)致的繼發(fā)性血栓形成，增加了臨床
6應(yīng)用的安全性；(2)新型腦保護(hù)藥物擴(kuò)大了治療群體，使血液粘稠度較高而不能用常規(guī) 促紅細(xì)胞生成素進(jìn)行治療的腦卒中患者得到治療；(3)到目前為止，所有治療中風(fēng)的試 劑，若在中風(fēng)48小時(shí)后給藥，均無(wú)治療效果，而新型腦保護(hù)藥物48小時(shí)后給藥，仍 具有明顯的改善神經(jīng)功能的作用。這將使絕大多數(shù)腦卒中患者得到治療；(4)新型促紅 細(xì)胞生成素可以長(zhǎng)期注射而對(duì)血液系統(tǒng)沒(méi)有刺激作用，特別適用于用于腦卒中的康復(fù) 治療。因此這種新型促紅細(xì)胞生成素在腦卒中的治療方面具有良好的臨床應(yīng)用前景-突變型促紅細(xì)胞生成素?cái)U(kuò)大了腦卒中患者治療群體，使更多腦卒中患者得到治療；突 變型促紅細(xì)胞生成素可以長(zhǎng)期注射而對(duì)血液系統(tǒng)沒(méi)有刺激作用，特別適用于腦卒中的 康復(fù)治療。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，依照本領(lǐng) 域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本公開(kāi)內(nèi)容所作出的 本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1-1為mEP0全基因序列示意圖。
圖1-2為部分突變型EP0的DNA測(cè)序結(jié)果。
圖2為表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-mEP0-his6的物理圖。
圖3為表達(dá)突變型EPO融合蛋白穩(wěn)定細(xì)胞株的建立及其mEPO融合蛋白的制備 及純化pcDNA-EP0-His6轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，用G418篩選高表達(dá)細(xì)胞株。取2ul培養(yǎng)基 上清液用Western blot分析rnEP0的表達(dá)。我們成功地分離純化了 62個(gè)含有單個(gè)突變 氨基酸的新型突變型EPO融合蛋白。圖3所示為S1041-EP0 (序列tt45)，其分子量約 34-40 kD(泳道2)，與野生型EP0的分子量相似(泳道1)。
圖4為體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，證明niEP0無(wú)促紅細(xì)胞生成特性(A)應(yīng)用32D-EpoR 細(xì)胞系進(jìn)行體外紅細(xì)胞生成活力檢測(cè)。細(xì)胞(2xl05)在含有1 Li/ml野生型EP0或含 有l(wèi)和100 U/ml mEPO的培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育培養(yǎng)，72h后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)用平均 值土標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n40)。圖中所示為S1041-EP0 (序列tt45)，其它序列結(jié)果與此相似。 (B)小鼠活體內(nèi)紅細(xì)胞生成活力檢測(cè)。mEPO或野生型EPO以5000 U/kg總量進(jìn)行 腹腔注射，每周2次，連續(xù)4周注射。每2周進(jìn)行一次血中血紅蛋白濃度檢測(cè)。數(shù)據(jù) 以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n=8。與野生型EPO注射組相比較*p<0.05， **p<0.01。圖中 突變體S104I-EP0(序列#45)，其它序列結(jié)果與此相似。圖5為體外實(shí)驗(yàn)，提示mEPO具有抗OGD和NMDA的腦保護(hù)作用(A)為暴露于 薩DA24小時(shí)后顯微鏡下(a-d)和煙酸己可堿染色后形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(e-h)。對(duì)照組神經(jīng) 元見(jiàn)圖a和e。 NMDA導(dǎo)致凋亡樣(f圖內(nèi)紅箭頭)和壞死樣細(xì)胞死亡(f圖內(nèi)黃色 箭頭)。EP0(c， g)或mEP0(d， h)預(yù)處理24小時(shí)可減少神經(jīng)元死亡。(B)為,DA 神經(jīng)毒性導(dǎo)致的細(xì)胞死亡計(jì)數(shù)。EP0或mEP0預(yù)處理后暴露于NMDA可明顯減少高 密度細(xì)胞核形態(tài)細(xì)胞數(shù)量。(C)為單獨(dú)醒DA處理后LDH釋放量作為對(duì)照EP0和niEP0 處理的神經(jīng)元釋放LDH的相對(duì)含量。(**〈0. 01 ，數(shù)據(jù)用均值+SEM來(lái)表示，n=12)。
圖6為小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證明mEPO能有效減少小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型腦梗死 體積成年C57/B6雄性小鼠，大腦中動(dòng)脈栓塞60分鐘再灌注72小時(shí)。再灌注即刻 腹腔注射mEP0或EP0(5000U/kg)，分別在缺血24和48小時(shí)后再次給藥。MCA0 72h 后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分和TTC染色。(A)圖為MCAO小鼠腦的冠狀切面TTC染色照片。(B) 圖為梗死體積定量計(jì)算。(C)圖為神經(jīng)功能評(píng)分。數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組N =10。 林p〈0.01與空白對(duì)照組比較，*p<0.05與空白對(duì)照組比較。
圖7為新生鼠缺氧缺血模型，提示mEP0具有促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的功能出生 后7天的Sprague-Dawley新生鼠給予缺氧缺血130分鐘，然后給予腹腔注射mEPO (5000U/kg),用"腳踩空實(shí)驗(yàn)"檢測(cè)祌經(jīng)功能。圖7A為mEP0注射，祌經(jīng)功能檢測(cè) 及測(cè)定腦梗死體積時(shí)間表；盡管遲發(fā)性mEPO注射不能減少缺氧缺血所致的腦組織(圖 7B和7C)，但能顯著提高神經(jīng)功能(圖7D，7E和7F)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1: EP0 cDNA定點(diǎn)突變
從人類腎臟cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增人類EP0cDNA，用PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得了 62個(gè)新突變型EP0 cDNA，并將這些突變后的EPO cDNA裝入真核表達(dá)載體，詳細(xì)步驟為 一、人類EPO cDNA的擴(kuò)增
人類EPOcDNA編碼193個(gè)氨基酸，EPO初級(jí)蛋白合成后，其氨基端含27個(gè)氨 基酸殘基的信號(hào)肽經(jīng)切割后變?yōu)槌墒霦PO。因此成熟的人類EPO為166個(gè)氨基酸。 基于上述研究結(jié)果，將用于分離純化的組氨酸標(biāo)簽(His-6)加于EP0cDNA的3'端。 含有His-6標(biāo)簽的人類EPO cDNA用PCR方法從人類腎臟Marathon-ready cDNA文 庫(kù)(Clontech , Mountain View,美國(guó))中擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)依照己發(fā)表的人類EPO cDNA序列(基因序列號(hào)畫(huà)000799)。其中上游序列含有BamHI及K0ZAK序列(劃 線部分)5' -ACGGATCCGCCACCATGGGGGT GCACGAATGTCTTGC-3，。下游引物序列為5' -/Jg水AATTClr①口rG馬蕩67Y ACCgtcccctgccctgcaggcctcccctg-3'， 從3'至5，次含有EPO下游序列(小寫(xiě)部分)，六個(gè)組氨酸組成的組氨酸標(biāo)簽(斜 體部分)以及EcoRI克隆位點(diǎn)(方框部分)。在組氨酸標(biāo)簽及EPO之間加入甘氨酸殘 基(黑體部分)，便于肽段的自由旋轉(zhuǎn)。PCR反應(yīng)條件為上述兩引物各lOpmol， Marathon cDNA 2m!，Accuprime1M Taq DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, 美國(guó))1W。 94'C預(yù)變性2分鐘后，94'C變性30秒，62'C退火30秒，68'C延伸50 秒，28個(gè)循環(huán)后用瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物?？寺∪階T克隆載體pGEM-T easy (Promega， Madison,美國(guó))。質(zhì)粒擴(kuò)增及酶切鑒定后進(jìn)一步進(jìn)行DNA測(cè)序。mEPO 全基因序列示意圖見(jiàn)圖l-l。 二、 EPO cDNA定點(diǎn)突變
用此質(zhì)粒為模板，用PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)突變。突變使用快速突變?cè)噭┖?產(chǎn)品編 號(hào)200523, Stratagene, La Jolla,美國(guó))按廠家說(shuō)明進(jìn)行操作。簡(jiǎn)言之，取上述質(zhì) 粒O. lug為模板，加入上游及下游突變引物各lOpmol， PfuUltra 高保真Taq酶2U 及dNTP 200幽。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性2分鐘后，94。C變性30秒，62。C退火 30秒，68'C延伸5分鐘。12個(gè)循環(huán)后加入20U DNaseI 37°C消化30分鐘。瓊脂糖 凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物后，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌。提取質(zhì)粒后進(jìn)一步進(jìn)行DNA測(cè)序。 所用突變引物序列如下(黑體為突變堿基，下劃線堿基編碼突變氨基酸)。 16A-EPO(序歹iJ #7)上游5,-ACCACGCCTCgccTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAG-3，
下游5'-GCTGTCACAggcGAGGCGTGGTGGGGCGCCCAGGACTG-3， C7A-EPO(序歹iJ #8)上游5'-CACGCCTCATCg￡lGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTAC-3，
下游5，-CTCGGCTGTC^g￡GATGAGGCGTGGTGGGGCGCCCAG-3' C7S-EPO(序歹U #9)上游5，-CACGCCTCATCi￡lGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTAC-3，
下游5，-CTCGGCTGTCagaGATGAGGCGTGGTGGGGCGCCCAG-3， R101-EPO(序歹U #10)上游5，-CTGTGACAGCataGTCCTGGAGAGGTACCTCTTGGAG-3，
下游5，陽(yáng)CTCTCCAGGACJMGCTGTCACAGATGAGGCGTGGTGG-3' V11S-EP0(序列#11)上游5'-GTGACAGCCGAtcCCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCC-3，
下游5，-CCTCTCCAGG2aTCGGCTG丁CACAGATGAGGCGTGG-3' L12A-EPO(序列#12)上游5，-CAGCCGAGTCg￡gGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAG-3，
下游5，-GAGGTACCTCTCcgcGACTCGGCTGTCACAGATGAGGCG-3' E13A-EPO(序歹iJ #13)上游5，-CCGAGTCCTGGcGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAG-3，下游5，-AGAGGTACCTCsCCAGGACTCGGCTGTCACAGATGAG-3' R14A-EPO(序歹U #14)上游5，-GAGTCCTGGAGgcGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCC-3'下游5,-CCAAGAGGTACgcCTCCAGGACTCGGCTGTCACAGATG-3， R14Q-EPO(序歹U #15)上游5'-GAGTCCTGGAGcaGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCC-3，下游5，-CCAAGAGGTACtgCTCCAGGACTCGGCTGTCACAGATG-3， R14E-EPO(序列#16)上游5'-GAGTCCTGGAGgAGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCC-3'下游5，-CCAAGAGGTACTcCTCCAGGACTCGGCTGTCACAGATG-3' Y15A-EPO(序列#17)上游5'-TCCTGGAGAGGgcCCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAG-3'下游5 ，-CCTCCAAGAGGgcCCTCTCCAGGACTCGGCTGTCACAG-3' Y15P-EPO(序歹U #18)上游5'-TCCTGGAGAGGccCCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAG-3，下游5'-CCTCCAAGAG^ggCCTCTCCAGGACTCGGCTGTCACAG-3' Y15I-EPO(序歹U #19)上游5，-TCCTGGAGAGGatCCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAG-3，下游5,-CCTCCAAGAGGatCCTCTCCAGGACTCGGCTGTCACAG-3' T441-EPO(序列#20) 上游5，-CTGTCCCAGACatCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAG-3，下游5，-GAAATTAACTTTGatGTCTGGGACAGTGATATTCTCATTC陽(yáng)3， K45A-EPO(序列#21)上游5，陽(yáng)TCCCAGACACCgcAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGG-3，下游5,-TAGAAATTAACJg￡GGTGTCTGGGAAGTGATATTCTC-3' K45E-EPO(序歹U #22)上游5'-TCCCAGACACCgAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGG-3，下游5 ，-TAGAAATTAACTTcGGTGTCTGGGAAGTGATATTCTC-3' V46A-EPO(序歹U #23)上游5，-CAGACACCAAAGcTAATTTCTATGCCTGGAAGAGG-3'下游5，-GCATAGAAATTAsCTTTGGTGTCTGGGACAGTGATATTC-3， N47A-EPO(序歹U #24)上游5，-GACACCAAAGTTgcTTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGG-3，下游5，- CAGGCATAGAAAgcAACTTTGGTGTCTGGGACAGTGATA-3， F48A-EPO(序歹lJ #25)上游5，-CCAAAGTTAATgcCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTC-3，下游5，陽(yáng)TCCAGGCATAGgcATTAACTTTGGTGTCTGGGACAGTG-3' F48I-EPO(序歹U #26)上游5'-CCAAAGTTAATatCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTC-3,下游5 ，-TCCAGGCATAGatATTAACTTTGGTGTCTGGGACAGTG-3' Y49A-EPO(序列#27)上游5，-AAGTTAATTTCg￡lGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGG-3，下游5,-CTCTTCCAGGCA2cGAAATTAACTTTGGTGTCTGGGAC-3， Y49S-EPO(序歹iJ #28)上游5'-AAGTTAATTTCTcTGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGG-3'下游5，-CTCTTCCAGGCA2AGAAATTAACTTTGGTGTCTGGGAC-3， W51E-EPO(序列#29)上游5,-ATTTCTATGCCgaGAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAG-3，下游5 ，-CCATCCTCTTCtcGGCATAGAAATTAACTTTGGTGTC-3' W51F-EPO(序列#30)上游5'-ATTTCTATGCC也AAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAG隱3，下游5 '-CCATCCTCTTg^GGCATAGAAATTAACTTTGGTGTC-3' K52A陽(yáng)EPO(序歹iJ #31)上游5，-TCTATGCCTGGgcGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCC-3，下游5，-CCTCCATCCT￡g￡CCAGGCATAGAAATTAACTTTGGTG-3' K97A-EPO(序列#32)上游5，陽(yáng)GCATGTGGATgcAGCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTC-3'下游5'-CACTGACGGCTgcATCCACATGCAGCTGCAGGGGCTC-3， S100A-EPO(序歹iJ #33)上游5，-GATAAAGCCGTCgcTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTG-3，下游5'-CTGCGAAGGCCAscGACGGCTTTATCCACATGCAGCTG-3' S100E-EPO(序列#34)上游5，-GATAAAGCCGTCgaaGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTG-3，下游5' -CTGCGAAGGCC也GACGGCTTTATCCACATGCAGCTG-3' S100T-EPO(序歹U #35)上游5'-GATAAAGCCGTCacTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTG-3，下游5，-CTGCGAAGGCC4glGACGGCTTTATCCACATGCAGCTG-3' G101A-EPO(序歹U #36)上游5，-AGCCGTCAGTGcCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTC-3，下游5'-GGCTGCGAAG2g￡ACTGACGGCTTTATCCACATGCAG-3' G101卜EPO(序列#37)上游5，-AGCCGTCAGTatCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTC-3，下游5，-GGCTGCGAAGGtaACTGACGGCTTTATCCACATGCAG-3' L102A-EPO(序列#38)上游5，-CGTCAGTGGCg￡jCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGG-3'下游5，-GTGAGGCTGCG4g￡GCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3' R103A-EPO(序列#39)上游5，-TCAGTGGCCTTgcCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3'下游:5，-TGGTGAGGCTOg^AAGGCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3' R103E-EPO(序列#40)上游5，-TCAGTGGCCTT2aaAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3，下游5 ，-TGGTGAGGCT^AAGGCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3' 詣3H-EPO(序歹iJ #41)上游5'-TCAGTGGCCTTcaCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3,下游'-TGGTGAGGCTGtgAAGGCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3， R103N-EPO(序列#42)上游5，-TCAGTGGCCTTaaCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3，下游5，-TGGTGAGGCTG"AAGGCCACTGACGGCTT丁ATCCACATG-3， R103Q-EPO(序列#43)上游5,-TCAGTGGCCTTcagAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3，11下游5'-TGGTGAGGCT幽AAGGCCACTGACGGCTTTATCCACAT-3' S104A-EPO(序歹iJ #44)上游5'-GTGGCCTTCGC2cCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTG-3，下游5，-GAGTGGTGAGGgcGCGAAGGCCACTGACGGCTTTATC-3， S104NEPO(序歹iJ #45)上游5，-GTGGCCTTCGCatCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTG-3'下游5，-GAGTGGTGAGGatGCGAAGGCCACTGACGGCTTTATC-3' S104E-EPO(序歹U #46)上游5，陽(yáng)GTGGCCTTCGCga2CTCACCACTCTGCTTCGGGCTC丁G-3，下游5'-GAGTGGTGAG虛cGCGAAGGCCACTGACGGCTTTATC-3' L105A-EPO(序歹iJ #47)上游5'- GCCTTCGCAGCgcCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAG-3'下游5，- GCAGAGTGGTGgcGCTGCGAAGGCCACTGACGGCTTTA-3， T106A-EPO(序歹lJ #48)上游5，-TCGCAGCCTCgCCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCC-3，下游5，-GAAGCAGAGTGGcGAGGCTGCGAAGGCCACTGACGGC-3， T106I-EPO(序列#49)上游5'-TCGCAGCCTCatQACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCC-3，下游5'-GAAGCAGAGTGatGAGGCTGCGAAGGCCACTGACGGC-3' T107A-EPO(序列#50)上游5，-CAGCCTCACCeCTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAG-3，下游5，-CCGAAGCAGAGcGGTGAGGCTGCGAAGGCCACTGAC-3' T107I陽(yáng)EPO(序歹iJ #51)上游5，陽(yáng)CAGCCTCACCatTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAG-3'下游5'-CCGAAGCAGAatGGTGAGGCTGCGAAGGCCACTGAC-3， L108A-EPO(序歹U #52)上游5,-CCTCACCACTg^CTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAG-3'下游5 ，-GAGCCCGAAGCgcAGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCACT-3' L108E-EPO(序列#53)上游5，-CCTCACCACTgaGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAG-3，下游5，-GAGCCCGAAGCtcAGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCACT-3， L108K-EPO(序歹'J #54)上游5，-CCTCACCACTaaGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAG-3，下游5'-GAGCCCGAAGCttAGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCACT-3， L108S-EPO(序列#55)上游5，-CCTCACCACTtcGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAG-3，下游5，-GAGCCCGAAGCgaAGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCACT-3' S146A-EPO(序列#56)上游5，-CCGAGTCTACgCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAG-3，下游5,-GGAGGAAATTGGcGTAGACTCGGAAGAGTTTGCGGAA-3' N147A-EPO(序歹U #57)上游5' -G AGTCTACTCCgcTTTCCTCCGGGG A A AGCTG A AGCTG-3'下游5，-CCCGGAGGAAAgcGGAGTAGACTCGGAAGAGTTTGCGG-3， F148A-EPO(序列#58)上游5，-CTACTCCAATgcCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTAC-3,下游5，-TTCCCCGGAGGgcATTGGAGTAGACTCGGAAGAGTTTG-3' F148Y-EPO(序歹iJ #59)上游5'-CTACTCCAATtaCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTAC-3，下游5'-TTCCCCGGAGGtaATTGGAGTAGACTCGGAAGAGTTTG-3' L149A-EPO(序歹U #60)上游5，-CTCCAATTTCgcCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAG陽(yáng)3，下游5'-GCTTTCCCCGGgcGAAATTGGAGTAGACTCGGAAGAG-3， R150A-EPO(序列#61)上游5，-CCAATTTCCTCgcGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGG-3'下游5 ，-TCAGCTTTCCCgcGAGGAAATTGGAGTAGACTCGGAAG-3' R150E-EPO序列#62)上游5，-CCAATTTCCTCgaGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGG-3，下游5'-TCAGCTTTCCCtcGAGGAAATTGGAGTAGACTCGGAAG-3' R150-EPO(序列#63)上游5'-CCAATTTCCTC祖GGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGG-3'下游5'-TCAGCTTTCCgatGAGGAAATTGGAGTAGACTCGGAAG-3， G151A-EPO(序列#64)上游5，-TTTCCTCCGGgcAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAG-3，下游5，-GCTTCAGCTTTgcCCGGAGGAAATTGGAGTAGACTCGGAA-3， K152A-EPO(序列#65)上游5，-TCCTCCGGGGAgcGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCC-3，下游5 ，-TACAGCTTCAGCgcTCCCCGGAGGAAATTGGAGTAGAC-3' K152W-EPO(序列#66)上游5'-TCCTCCGGGGAtgGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCC-3'下游5，-TACAGCTTCAGCcaTCCCCGGAGGAAATTGGAGTAGAC-3' C16IA-EPO(序歹lJ #67)上游5'-CAGGGGAGGCCgcCAGGACAGGGGACAGAGGCGGCCGC-3'下游5，-CCCTGTCCTGscGGCCTCCCCTGTGTACAGCTTCAG-3， R162A-EPO(序列#68)上游5，-GGAGGCCTGCgcGACAGGGGACAGAGGCGGCCGCTAC-3，下游5，-GTCCCCTGTCgcGCAGGCCTCCCCTGTGTACAGCTT-3'三、 DNA測(cè)序?qū)⑼蛔兒蟮馁|(zhì)粒送至美國(guó)匹茲堡大學(xué)(University of Pittsburgh)基因組及蛋白 組學(xué)中心進(jìn)行DNA測(cè)序。所用測(cè)序引物為:上游引物為(M13F) : 5' -ACGTTGTAAAACGA CGGCCAGTG-3，；下游引物為(M13R) :5' -GGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3'。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖l-2。四、 mEP0表達(dá)載體的構(gòu)建將上述測(cè)序后的突變型EP0 cDNA全基因用BamHI及EcoRI雙酶切后，亞克隆至 pcDNA3. 1(+)表達(dá)載體中(clontech，美國(guó))，命名為pcDNAiEP0-his6。13實(shí)施例2: mEPO融合蛋白制備及純化
用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美國(guó))將載體pcDNA-mEP0-his6 導(dǎo)入293細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染24h后，1: 12傳代，加入G418 lmg/ml (Invitrogen,美國(guó)) 培養(yǎng)2周后挑選單個(gè)克隆轉(zhuǎn)入6孔板繼續(xù)培養(yǎng)。取10W培養(yǎng)基用Western blot或 稀釋1000倍后用ELISA鑒定mEP0高表達(dá)細(xì)胞株。上清用Western blot和ELISA鑒定 EP0的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖2。 mEP0高表達(dá)細(xì)胞株大量擴(kuò)增后，收集培養(yǎng)基用Ni-NTA瓊脂 糖層析柱(QIAGEN， Valencia,美國(guó))回收純化mEP0融合蛋白。簡(jiǎn)言之，培養(yǎng)基用NaOH 將其pH值調(diào)至8. 0，加入5M NaCl至終濃度為300mM。
將5ml Ni-NTA瓊脂糖加入層 析柱中，用PBS洗柱兩遍后，將Ni-NTA瓊脂糖加入培養(yǎng)基中。4'C振搖結(jié)合2小時(shí)后， 將Ni-NTA瓊脂糖培養(yǎng)基加入層析柱中，用磷酸鹽緩沖液(50mM NaH2P04， 300mM NaCl, 20mM咪唑，pH8.0)洗柱6遍，然后加入洗脫液(50mM NaH2P04, 300mM NaCl， 250mM 咪唑，PH8.0) 10ml洗脫mEP0融合蛋白。將洗脫的mEPO融合蛋白加入Slide-A-Lyzer 透析盒中(PIERCE, Rockford，美國(guó))，置于1000ml PBS中進(jìn)行透析，每8小時(shí)更換 一次PBS，透析6次后收集蛋白。純化的蛋白經(jīng)0.2陶濾器過(guò)濾后分裝，凍存于-80。C 或冷凍真空抽干備用。SDS-PAGE電泳后，用考馬斯亮蘭染色鑒定蛋白純度。用ELISA 試劑盒(R&D System, Minneapolis,美國(guó))進(jìn)行定量分析。
理論上講未糖基化的mEPO分子量為23kD。 Western blot法確定純化的mEPO融合 蛋白分子量為36至40kD (圖3)，表明我們生產(chǎn)的mEPO為糖基化的。用此法提純的 mEP0純度可達(dá)90。/。，濃度高達(dá)50 U/W。
實(shí)施例3:檢測(cè)mEPO是否具有促紅細(xì)胞生成特性
我們用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)這些niEPO是否具有促進(jìn)紅細(xì)胞生成的特性進(jìn)行了研究。
一、mEPO促紅細(xì)胞生成生物特性的體外分析 32D-EPOR細(xì)胞為小鼠骨髓來(lái)源的淋巴母細(xì)系32D細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EPO受體后形成 的細(xì)胞系，其生存和增殖完全依賴于EPO的存在，被廣泛用于EPO生物學(xué)活特性的體 外分析。用IDEM培養(yǎng)基(Invitrogen)將32D-EPOR細(xì)胞接種于六孔板中，每孔約 2xl()5個(gè)細(xì)胞。饑餓(無(wú)EPO存在)6小時(shí)后分別加入野生型ETO (1U/ml)或mEPO (1 和100 U/ml)或PBS (對(duì)照)，72小時(shí)后用胎盤藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞的數(shù)量。在野 生型EPO存在的條件下，32D-EP0R細(xì)胞在72小時(shí)內(nèi)增殖了大約13倍(2.7x107), 而 mEPO和PBS對(duì)照一樣，只有O. 1%細(xì)胞存活，即使增加mEPO濃度100倍后對(duì)32D-EP0R細(xì)胞的存活也沒(méi)有任何影響，表明mEPO喪失了促紅細(xì)胞生成的能力。 二 、 mEP0對(duì)小鼠血紅蛋白濃度的影響
取體重25-30g， 2-3月齡C3H/HEN雌性小鼠(Taconic Laboratories, Taconic, 美國(guó))，以每公斤體重5000單位的劑量腹腔內(nèi)注射mEPO或野生型EP0，每周2次， 連續(xù)注射4周。每2周隱靜脈采血一次，用血紅蛋白儀(HemoCue AB， Angelholm，瑞 典)檢測(cè)血液中血紅蛋白濃度。隱靜脈采血具體操作如下采用氣體麻醉，1.5%異氟 垸混合70%N20和30%02經(jīng)氣管插管行吸入麻醉。將覆蓋在小鼠后肢外側(cè)隱靜脈之上 的毛發(fā)剃除，用右手拇指和食指擠壓覆蓋在外側(cè)隱靜脈之上的皮膚，使隱靜脈充盈， 酒精常規(guī)消毒后采用帶有毛細(xì)軟管的25號(hào)針頭采血。當(dāng)取夠100 " 1靜脈血后迅速拔 出針頭，用棉球按壓穿刺點(diǎn)l-3分鐘促進(jìn)創(chuàng)口止血。C3H/HEN雌性小鼠血紅蛋白的 正常值為14.5土2.0 g/100ml，長(zhǎng)期大劑量mEPO注射對(duì)血紅蛋白沒(méi)有影響 (14. 3±1.8 g/100ml),而野生型EPO顯著增加血紅蛋白的含量，在第二周和第四周 分別達(dá)到注射前的115%和130%,表明mEPO喪失了促紅細(xì)胞生成的能力。
三、結(jié)果
體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mEP0喪失了維持促紅細(xì)胞生成素依賴性細(xì)胞株(32D-EPOR)生存的 特性；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明大劑量，多次注射mEPO不增加小鼠的紅細(xì)胞數(shù)量和血紅 蛋白值，表明mEPO喪失了促紅細(xì)胞生成的能力。本發(fā)明的創(chuàng)造性之一在于新型腦保護(hù) 藥物無(wú)促紅細(xì)胞生成作用，從而避免了常規(guī)促紅細(xì)胞生成素有可能導(dǎo)致的繼發(fā)性血栓 形成，增加了臨床應(yīng)用的安全性。
實(shí)施例4: mEPO腦保護(hù)作用的體外研究
為了確定純化的mEPO蛋白是否具有生物活性，我們驗(yàn)證了其在NMDA毒性誘導(dǎo)的 祌經(jīng)細(xì)胞死亡中的作用。
一、大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)
按Cao等報(bào)道的方法進(jìn)行(Cao G， J Neurosci. 2001, 21 (13): 4678-90)。簡(jiǎn)言 之，取懷孕16至17天的SD大鼠胚胎，用剪刀將大腦皮層組織剪成約lmni3小塊，用 0.0W胰酶緩沖液37'C消化30分鐘后，加入馬血清滅活胰酶，用吸管吹打后過(guò)濾190g 離心10分鐘后收集細(xì)胞，重懸于Neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen)后種于poly-D-lysine coated 24孔板(3X105)或100mm盤(5X 106)中，同時(shí)加入50XB27 (+)添加 劑(invitrogen)，每72小時(shí)更換一次液體。用Neurobasal培養(yǎng)基所得神經(jīng)元側(cè)純度
15為95%。
二、 NMDA毒性模型
生長(zhǎng)至11天的原代培養(yǎng)神經(jīng)元更換新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)加入B27 (-)添加劑以及 mEP0或野生型EP0 (lU/ml)繼續(xù)培養(yǎng)。24小時(shí)后加入200幽NMDA，作用15分鐘后更 換為新鮮培養(yǎng)基及B27 (-)添加劑，同時(shí)加入mEP0或野生型EP0。 24小時(shí)后取培養(yǎng)基 上清檢測(cè)LDH活性，作為細(xì)胞死亡的標(biāo)記。同時(shí)用Hoechest染色細(xì)胞核，計(jì)數(shù)濃縮及 片段化的細(xì)胞核比例。
三、 結(jié)果
如圖5所示，mEPO能顯著降低由隨DA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及壞死，其效果與商用標(biāo) 準(zhǔn)EP0 (股D System, Minneapolis,美國(guó))相似。表明mEP0和野生型EP0—樣，在 抗函DA所致神經(jīng)毒性方面具有相同的保護(hù)作用。
實(shí)施例5: mEPO對(duì)小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型腦梗死體積的影響
一、 小鼠短暫局部腦缺血模型的制作
利用單股尼龍縫合線栓塞左側(cè)大腦中動(dòng)脈制作局部腦缺血模型。取體重25-30g ， 2-3月齡雄性C57/B6小鼠(The Jackson Laboratory, Bar Harbor,美國(guó))，1. 5%異 氟烷/70°州20/30%02混和氣體氣管插管吸入麻醉。手術(shù)全程動(dòng)物的直腸溫度通過(guò)反饋 恒溫加熱毯維持在37.0土0.5 'C之間，栓塞時(shí)使用鼠尾血壓監(jiān)測(cè)器監(jiān)測(cè)小鼠的平均動(dòng) 脈壓，于栓塞后15分鐘取動(dòng)脈血行血?dú)夥治?。栓?0分鐘后于各指定時(shí)間點(diǎn)拔出線 栓恢復(fù)血供造成再灌注。手術(shù)完畢解除麻醉，小鼠北方回籠內(nèi)飼養(yǎng)在2(TC恒溫的空調(diào) 屋內(nèi)。
二、 梗死體積測(cè)定
梗死體積的測(cè)定采用Yang所描述方法(Stroke. 1994， 25(1) :165-70)。概括如下 于再灌注不同時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，快速取出腦組織，冠狀位切片，共6片，每片厚2毫 米，將切好的腦片放入用PBS配置的2y。TTC (氯化2， 3, 5-三苯基四氮唑)溶液中， 37. 5'C水浴20分鐘，然后將其放入4%的多聚甲醛中固定15分鐘后取出拍照。使用圖 像分析系統(tǒng)(MCID, St. Catherine' s,加拿大)。計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各層腦組 織面積。公式為梗塞面積=非梗塞面積-梗塞側(cè)正常腦組織面積，這樣可以減小腦水 腫對(duì)計(jì)算梗塞面積的影響。總的梗塞體積^各層梗塞面積X層厚(2mm)。為了驗(yàn)證TTC 染色測(cè)定梗死體積的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了組織學(xué)染色與之對(duì)比。將動(dòng)物處死后快速取腦，將腦組織放入2-甲基-丁烷在3(TC下冰凍。行冠狀位連續(xù)冰凍切片，每片厚20陶， 每隔0. 5mm取一張腦片(每個(gè)腦組織大概可取22-24張腦片)。切好的腦組織切片進(jìn)行 甲酚紫染色，按上述的方法進(jìn)行梗塞體積的計(jì)算。 三、結(jié)果
我們進(jìn)一步證實(shí)了 mEPO在小鼠腦缺血再灌注模型中的神經(jīng)保護(hù)作用。C57/B6小 鼠大腦中動(dòng)脈栓塞60分鐘再灌注72小時(shí)后造成同側(cè)半球梗死，TTC染色顯示梗死體 積大約為32誦3。缺血后再灌注即刻使用5000U/kg mEPO可明顯減少梗死體積(P〈0. 01， 與空白對(duì)照組比較)，其效果與野生型EPO相似(圖6A和6B)，同時(shí)可以明顯改善神 經(jīng)功能(圖6C)。表明無(wú)論是體內(nèi)或體外，mEPO都具有很強(qiáng)很的神經(jīng)保護(hù)作用。此研究 結(jié)果令人意外因?yàn)槟壳暗难芯空J(rèn)為EPO具有神經(jīng)保護(hù)作用，而神經(jīng)保護(hù)作用是通過(guò) EPO與神經(jīng)元上的EPO受體結(jié)合，激活與促紅細(xì)胞生成相同的信號(hào)通路而發(fā)揮作用。 因此，從理論上來(lái)講，破壞EPO受體結(jié)合位點(diǎn)后，EPO將不再具有神經(jīng)保護(hù)作用。令 人意想不到的是，點(diǎn)突變破壞了 EPO受體結(jié)合位點(diǎn)后，EPO仍具有神經(jīng)保護(hù)作用，使 這種突變型促紅細(xì)胞生成素成為一種無(wú)促紅細(xì)胞生成作用，但有神經(jīng)保護(hù)作用的新型 神經(jīng)保護(hù)藥物。
實(shí)施例6: mEP0促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)
到目前為止所有治療中風(fēng)的試劑，若在中風(fēng)48小時(shí)后給藥，均無(wú)治療效果。令人 興奮地是新型腦保護(hù)藥物在48小時(shí)后給藥(遲發(fā)性)，仍具有明顯的改善神經(jīng)功能的 作用。遲發(fā)性給藥仍具有治療效果，其機(jī)制目前尚不清楚，可能與新型腦保護(hù)藥物誘 導(dǎo)血管再生和神經(jīng)再生，從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)有關(guān)。為了證實(shí)新型腦保護(hù)藥物是 否通過(guò)誘導(dǎo)血管再生和神經(jīng)再生而發(fā)揮作用，我們進(jìn)一步研究了新型腦保護(hù)藥物對(duì) 新生鼠缺氧缺血模型所致的神經(jīng)功能損傷影響。 一、新生鼠缺氧缺血模型
應(yīng)用出生后7天的新生Sprague-Dawley大鼠(Charles River實(shí)驗(yàn)室，Wilmington, Mass)制備130分鐘缺氧/再灌注模型。簡(jiǎn)而言之，在3%異氟烷麻醉下，結(jié)扎左側(cè)頸 總動(dòng)脈，90分鐘后將動(dòng)物放置于缺氧環(huán)境中(含氧量為8%)。 40分鐘后將動(dòng)物放放回 正常環(huán)境中侍養(yǎng)。非缺血?jiǎng)游镒鳛閷?duì)照組。將野生型rEP0和變構(gòu)型mEP0溶于0. 1%牛 血清白蛋白磷酸鹽緩沖溶液中，按照?qǐng)D7A所示劑量腹腔注射制備野生型rEP0 (5000 U/kg)和變構(gòu)型mEP0 (5000U/kg)。 0. 1%牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖溶液注射作為非治療對(duì)照組。
二、 神經(jīng)功能檢測(cè)
我們應(yīng)用"腳踩空實(shí)驗(yàn)"檢測(cè)神經(jīng)功能。簡(jiǎn)言之，動(dòng)物被放置在升高8.5毫米 的網(wǎng)格地板上(34 x 29 mm)。網(wǎng)眼面積為2. 2 x 2. 2 cm。當(dāng)大鼠在網(wǎng)格上移動(dòng)的時(shí) 候，未受損傷的動(dòng)物可以將爪子放在網(wǎng)架，在網(wǎng)上移動(dòng)時(shí)可以抓牢格子。缺氧損傷的 動(dòng)物不能準(zhǔn)確地將一側(cè)前或者后肢放置踩在格子上，甚至?xí)⑶爸笾珡木W(wǎng)眼中跌落， 即為1次"腳踩空"。觀察1分鐘，記錄腳步的總數(shù)，"腳踩空"次數(shù)。圖7D顯示缺 氧/再灌注之后感覺(jué)運(yùn)動(dòng)行為顯著缺失。與對(duì)照組相比，非治療組動(dòng)物對(duì)側(cè)的(圖7E) 和同側(cè)的(圖7F)肢體"腳踩空"次數(shù)均顯著增高，EPO的應(yīng)用可以減小這種神經(jīng)功 能缺失的程度(圖7D， 7E和7F)(圖6B-D)。因此，外源性EP0在改善缺氧/再灌注后 的神經(jīng)損傷是有效的。
三、 結(jié)果
出生后7天的Sprague-Dawley新生鼠給予缺氧缺血130分鐘，2, 4, 6, 9和 13天后分別給予腹腔注射mEPO (5000U/kg)，然后檢測(cè)祌經(jīng)功能的恢復(fù)。我們發(fā)現(xiàn)盡 管遲發(fā)性mEPO注射不能減少缺氧缺血所致的梗死體積(圖7B和7C)，但能顯著提高 神經(jīng)功能的恢復(fù)(圖7D, 7E和7F)，其效果與野生型EP0相似，而且mEPO可以大劑 量多次注射而不用擔(dān)心野生型EPO所致的血液學(xué)副作用。此結(jié)果意義重大，目前中風(fēng) 唯一有效的藥物是t-PA，其治療窗口非常短，為中風(fēng)后3小時(shí)內(nèi)，因此只有不到10% 的中風(fēng)患者適合t-PA治療。而EPO擴(kuò)大了治療窗口，從而使更多中風(fēng)患者得到治療。 此外，新型腦保護(hù)藥物可以長(zhǎng)期注射而對(duì)血液系統(tǒng)沒(méi)有刺激作用，特別適用于用于腦 中風(fēng)的康復(fù)治療。序列表
〈110〉曹國(guó)棟、陳俊、羅玉敏、吉訓(xùn)明、邢娟
<120>無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素及其用途
<130>
〈160〉 68
〈170> Patentln version 3.5
<210> 1 〈211〉 582 <212> DNA <213〉人屬，人種
<400> 1 (人類促紅細(xì)胞生成素cDNA)
atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180
agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240
atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300
gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360
catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctgcga 420
gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540
aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582
〈210〉 2 <211> 193 〈212〉 PRT <213〉人屬，人種
〈400〉 2 (人類促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列)
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Pro
19Leu Gly Leu Pro Arg Tyr Leu Leu Ser Leu Asn Glu Met Glu Val Gly Val Leu Arg Gly His Val Asp Lys Ala Gin Lys Glu Thr Ala Asp Thr Lys Leu Tyr Thr
5 10 Val Leu Gly Ala Pro Pro 25 30 Glu Ala Lys Glu Ala Glu 45 50 Asn lie Thr Val Pro Asp 65 70 Gin Gin Ala Val Glu Val 85 90 Gin Ala Leu Leu Val Asn 105 110 Ala Val Ser Gly Leu Arg 125 130 Ala lie Ser Pro Pro Asp 145 150 Phe Arg Lys Leu Phe Arg 165 170 Gly Glu Ala Cys Arg Thr 185 190
15
Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val 35
Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu 55
Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp 75
Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser 95
Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu 115
Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala 135
Ala Ala Ser Ala Ala Pro L>eu Arg 155
Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly 175
Gly Asp Arg
20
Leu Glu 40
His Cys 60
Lys Arg 80
Glu Ala
100 Gin Leu
120 Leu Arg
140 Thr lie
160 Lys Leu
180
〈210〉 3 <211> 166 〈212〉 PRT <213>人屬，人種
<400> 3 (成熟的人類促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Giu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr 45
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu 65
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu 85
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro 125
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
〈210〉 4 <211〉 5 〈212〉 PRT 〈213〉人屬，人種 <400〉 4 (成熟的人促紅細(xì)胞生成素的第11-15號(hào)氨基酸) Val Leu Gin Arg Tyr
<210〉 5
〈211〉 8
〈212〉 PRT
<213>人屬，人種
<400> 5 (成熟的人促紅細(xì)胞生成素的第44-51號(hào)氨基酸) Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp
21
Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 50 55 60
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 70 75 80
Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 90 95 100
Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 110 115 120
Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 130 135 140
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 150 155 160<210〉 6
<211> 9
<212> PRT
<213〉人屬，人種
<400> 6 (成熟的人促紅細(xì)胞生成素的第100-108號(hào)氨基酸) Ser Gly Leu Arg Ser L>eu Thr Thr Leu
〈210〉 7 <211> 166 <212> PRT <213>人屬，人種 <400〉 7 (I6A-EPO) Ala Pro Pro Arg Leu 1
Glu Ala Glu
Ala Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 5 10 15
Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His
85 90
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
105
110
75 Val
95 Gin 115
Asp Lys
Lys Ala
Glu Ala
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser 100
lie Ser 120
Arg Lys 140
Glu Ala
22145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
〈210〉 8 〈211> 166 〈212〉 PRT <213〉人屬，人種 〈400> 8 (C7A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Ala Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165<210〉 9 <211> 166 <212〉 PRT 〈213>人屬，人種 〈400〉 9 (C7S-EP0) Ala Pro Pro Arg Leu 1
Glu Ala Glu
Val Pro Asp
Val Glu Val
Leu Val Asn
Gly Leu Arg
Pro Pro Asp
Leu Phe Arg
Cys Arg Thr
5
Asn lie 25 Thr Lys 45
Trp Gin
65 Ser Ser 85
Ser Leu
105 Ala Ala
125 Val Tyr
145 Gly Asp
165
lie Ser Asp Ser Arg Val 10
Thr Thr Gly Cys Ala Glu 30
Leu Glu Arg Tyr Leu 15
His Cys Ser Leu Asn 35
Leu Glu Ala Lys 20
Glu Asn lie
Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin
50 55 Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val
70
Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His 90
Leu 75 Val 95
Asp
Gly Gin Ala Lys Ala Val
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie 110 115 Thr lie Thr Ala 135
Lys Leu Lys
Ser Ala Ala Pro Leu Arg 130
Ser Asn Phe Leu Arg Gly
Asp Thr Phe Arg
150
Leu 155
Tyr Thr Gly Glu
Arg
Thr 40 Ala 60 Leu 80 Ser 100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
<210> 10
〈211〉 166
<212> PRT 〈213〉人屬,
人種
〈400〉 10 (R10I-EP0) Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser lie Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys1 5 Glu Ala Glu Asn lie 25
Val Pro Asp Thr Lys 45
Val Glu Val Trp Gin 65
Leu Val Asn Ser Ser 85
Gly Leu Arg Ser Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala 125
Leu Phe Arg Val Tyr 145
Cys Arg Thr Gly Asp 165
10 15
Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
30 35
Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin
50 55
Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala
70 75
Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val
90 95
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie 110 115
Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg 130 Arg 150
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr
135
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Arg
Leu Tyr Thr Gly Glu 155
20 Thr
40 Ala
60 Leu
80 Ser
100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
<210> 11
〈211〉 166
〈212〉 PRT <213〉人屬
人種
<400〉 11 (VllS-EPO) Ala Pro Pro Arg Leu lie 1 5 Glu Ala Glu Asn lie Thr 25
Val Pro Asp Thr Lys Val 45
Ser Leu Glu Arg Glu His Cys Ser
Cys Asp Ser Arg 10
Thr Gly Cys Ala 30
Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met 50
Tyr 15
Leu 35
Glu 55
Leu Leu Glu Ala
Asn Glu Asn lie
Val Gly Gin Gin
Lys 20
Thr 40
Ala 60
25Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
<210>12
〈211〉166
<212〉PRT
〈213〉人屬，人種
〈400>12 (L12A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu ]lie Cys Asp Ser Arg Val Ala Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 5055 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 7075 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 9095 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser105 Ala Als 125 Val Tyr 145
Cys Arg Thr Gly Asp 165
Pro Pro Asp Leu Phe Arg
110 115 120
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
130 135 140
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
150 155 160
Arg
〈210〉 13
<211> 166
<212〉 PRT
<213>人屬，人種
〈400〉 13 (E13A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Ala Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
27Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
<210> 14
〈211〉 166
〈212> PRT
〈213〉人屬,,人種
〈400> 14 (R14A-EP0)
Ala Pro ProArg LeulieCys AspSerArgValLeu Glu Ala TyrLeuLeuGluAla
151015
Glu Ala GluAsn lieThrThr GlyCysAlaGluHis Cys Ser LeuAsnGluAsnlie
253035
Val Pro AspThr LysValAsn PheTyrAlaTrpLys Arg Met GluValGlyGinGin
455055
Val Glu ValTrp GinGlyLeu AlaLeuLeuSerGlu Ala Val LeuArgGlyGinAla
657075
Leu Val AsnSer SerGinPro TrpGluProLeuGin Leu His ValAspLysAlaVal
859095
Gly Leu ArgSer LeuThrThr LeuLeuArgAlaLeu Arg Ala GinLysGluAlalie
105110115
Pro Pro AspAla AlaSerAla AlaProLeuArgThr lie Thr AlaAspThrPheArg
125130135
Leu Phe ArgVal TyrSerAsn PheLeuArgGlyLys Leu Lys LeuTyrThrGlyGlu
145150155
Cys Arg ThrGly AspArg
165
20 Thr
40 Ala
60 Leu
80 Ser 100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
〈210〉 15<211〉 166
<212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400〉 15 (R14Q-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Gin Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210> 16
〈211〉 166
<212〉 PRT <213>人屬,
人種
〈400〉 16 (R14E-EPO) Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Glu Tyr Leu Leu Glu Ala Lys1 5
Glu Ala Glu Asn lie
Val Pro Asp
Val Glu Val
Leu Val Asn
Gly Leu Arg
Pro Pro Asp
Leu Phe Arg
Cys Arg Thr
25
Thr Lys
45 Trp Gin
65 Ser Ser
85 Ser Leu
105 Ala Ala
125 Val Tyr
145 Gly Asp
165
10 15 20
Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 30 35 40
Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 50 55 60
Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 70 75 80
Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 90 95 100
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 110 115 120
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 130 135 140
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 150 155 160
Arg
〈210〉 17
<211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400〉 17 (Y15A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Ala Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉18
〈211〉166
<212>PRT
〈213〉人屬，人種
<400>18 (Y15P-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu ]lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Pro Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
31105
Pro Pro Asp Ala Ala125
Leu Phe Arg Val Tyr145
Cys Arg Thr Gly Asp165
110 115 120
Ser Ala Ala Pro Uu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
130135 140
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
150155 160
<210〉19
〈211〉166
<212〉PRT
<213〉人屬，人種
〈400〉19 (Y15I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu ]lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg lie Leu Leu Glu1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr145 150 155
Gly GinGly GinLys AlaGlu AlaThr PheThr Gly
Ala Lys20
lie Thr40
Gin Ala60
Ala Leu80
Val Ser
100lie Ser
120Arg Lys
140Glu Ala
160
32Cys Arg Thr Gly Asp Arg165
〈210〉 20〈211〉 166〈212〉 PRT<213>人屬，人種〈400〉 20 (T44I-EP0)Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala5 10 15
Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
25
30
35
Val Pro Asp lie Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Gly GinGly GinLys Ala
Gin
Ala
Val
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu
145 150 155
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
Lys
20Thr
40Ala
60Leu
80Ser100Ser120Lys140Ala160
<210> 21<211> 166
<212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400〉 21 (K45A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Ala Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 22〈211〉 166<212> PRT<213〉人屬:
人種
〈400〉 22 (K45E-EPO)Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys10
15
20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn
25 30 Val Pro Asp Thr Glu Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
45 50 Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg
65 70 Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys
105 110 Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu
125 130 Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg
145 150 Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
Arg Thr lie Thr Ala Asp Gly Lys Leu Lys Leu Tyr
Leu 35 Glu 55 Leu 75 Val 95 Gin 115 Ala 135 Leu 155
Glu Asn lie Thr 40
Gly Gin Gin Ala 60
Gly Gin Ala Leu 80
Lys Ala Val Ser 100
Glu Ala lie Ser 120
Thr Phe Arg Lys 140
Thr Gly Glu Ala 160
〈210〉 23
<211> 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 23 (V46A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Ala Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
<210〉 24 〈211〉 166 〈212〉 PRT 〈213〉人屬，人種
〈400〉 24 (N47A-EP0) Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser 1 5 Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys 25
Val Pro Asp Thr Lys Val Ala Phe Tyr 45
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu 65
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu
Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
10 15 20
Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
30 35 40
Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
70 75 80
Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
3685
Gly Leu Arg Ser Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala 125
Leu Phe Arg Val Tyr 145
Cys Arg Thr Gly Asp 165
95 100
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
115 120
Ala Asp Thr Phe Arg Lys
135 140
Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
155 160
90 Arg 110 Leu 130 Arg 150
Ser Ala Als Pro Leu Arg Thr lie Thr
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys
Arg
〈210〉 25
〈211〉 166
〈212〉 PRT
<213>人屬，人種
〈400〉 25 (F48A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
1 5
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala 10 15 His Cys
25 30 Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Ala Tyr Ala Trp
Lys Arg
Ser Leu Asn Glu Asn lie 35
Met Glu Val Gly Gin Gin 55
45 50
Vai Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val
85 90 95
Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie
110
Gly Leu Arg Pro Pro Asp
105 110 115
Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp 125 130 135
Thr Phe Arg
Lys
20 Thr
40 Ala
60 Leu
80 Ser
100 Ser
120 Lys
140
37Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
<210> 26
〈211〉 166
〈212〉 PRT
<213>人屬，人種
〈400> 26 (F48I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn lie Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165〈210〉 27
<211> 166
<212〉 PRT
<213〉人屬，人種
〈400〉 27 (Y49A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp
1
Glu Ala Glu
5
Asn lie Thr Thr Gly
25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu
10 15
Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
30 35
Ala Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin 50 55
45
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
Cys Arg Thr
Gly 165
145 Asp
150
155
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160
Arg
<210> 28
〈211〉 166
〈212〉 PRT 〈213〉人屬:
人種
39)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Ser Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
<210> 29
<211> 166
〈212〉 PRT
<213>人屬，人種
〈400〉 29 (W51E-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
40Arg Asp
30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Glu Lys Arg Met Glu Val
50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu
70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val
90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys
110 115
Leu Arg Thr lie Thr Ala
130 135
Arg Gly Lys Leu Lys Leu
150 155
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
25 Lys 45 Gin 65 Ser 85 Leu 105 Ala 125 Tyr 145 Asp 165
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
Asp
Tyr
40
Gly Gin Gin Ala 60
Gly Gin Ala Leu 80
Lys Ala Val Ser 100
Glu Ala lie Ser 120
Thr Phe Arg Lys 140
Thr Gly Glu Ala 160
<210> 30
<211> 166
<212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400> 30 (W51F-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Phe Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
<210〉31
<211>166
<212>PRT
<213>人屬，人種
〈400>31 (K52A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu ]1
Glu Ala Glu
5
Asn lie Thr 25
Cys Asp Thr Gly
Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu
10 15 Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
30
35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Ala Arg Met Glu Val Gly Gin
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser 100
lie Ser 120
Arg Lys125
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe 145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
130 135 Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu 150 155
140
Tyr Thr Gly Glu Ala 160
〈210〉 32
<211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400> 32 (K97A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Ala Ala Val
90
85
95
Gly Leu Arg Pro Pro Asp
Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie 105 110 115
Ala Ala Ser Ala Ala Pro 125
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp 130 135
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr 150 155
Thr Phe Arg Thr Gly Glu
Lys
20 Thr
40 Ala
60 Leu
80 Ser 100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
43>人屬，人種 〈400〉 33 (S100A-EP0) Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu Val Pro Asp Val Glu Val Leu Val Asn Gly Leu Arg Pro Pro Asp Leu Phe Arg Cys Arg Thr
<210> 34 <211> 166 〈212〉 PRT
5
Asn lie
25 Thr Lys
45 Trp Gin
65 Ser Ser
85 Ser Leu
105 Als Ala
125 Val Tyr
145 Gly Asp
165
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 10 15 20
Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 30 35 40
Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 50 55 60
Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 70 75 80
Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ala 90 95 100
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 110 115 120
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 130 135 140
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
160
150
155
Arg〈213〉人屬，人種 〈400〉 34 (S100E-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Glu
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
<210> 35
<211> 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400〉 35 (S100T-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr
145 150 155
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
40
Gly Gin Gin Ala 60
Gly Gin Ala Leu 80
Lys Ala Val Thr 100
Glu Ala lie Ser 120
Thr Phe Arg Lys 140
Thr Gly Glu Ala 160
<210〉 36 〈211〉 166
〈212〉 PRT
〈213>人屬，人種
〈400〉 36 (G101A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
4665 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Ala Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu
145 150 155
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
80
Lys Ala Val Ser 100
Glu Ala lie Ser 120 Lys 140 Ala 160
〈210〉 37
<211> 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400〉 37 (G101I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala
15 10 15
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
45 50
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val
65 70
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His
85 90
lie Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
105
110
55 Leu
75 Val
95 Gin 115
Arg Asp Lys
Gly Gin Gly Gin Lys Ala
Gin
Ala
Val
Glu Ala lie
Lys
20
Thr
40 Ala 60 Leu
80 Ser 100 Ser 120
47Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
〈210〉 38
〈211〉 166
〈212> PRT
<213>人屬，人種
<400〉 38 (L102A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu
15 10 15
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin
45 50
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val
65 70
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His
Gly Ala Arg Pro Pro Asp Leu Phe Arg
85 90 Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
105
110
55 Leu
75 Val
95 Gin 115
Arg Asp Lys
Gly Gin Lys Ala Glu Ala
Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
125 130 135
Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
150
155
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160165
<210> 39 <211> 166 〈212〉 PRT <213>人屬，人種 〈400〉 39 (R103A-EP0) Ala Pro Pro Arg Leu lie 1
Glu Ala Glu Asn
5
lie 25
Thr
Cys Asp Thr Gly
Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala
10 15 Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
30
35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg 65 70 75
Gly Gin Gly Gin
Gly Leu Ala Ser Pro Pro Asp Ala Leu Phe Arg Val Cys Arg Thr Gly
Leu 105 Ala 125 Tyr 145 Asp 165
Ser Ala Ala Pro
Ser Asn Phe Leu
Gin
Ala
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val 85 90 95
Thr Thr Leu Leu Arg Ala l>eu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie 110
Leu Arg 130
Arg Gly
150 155
115
Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg 135
Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu
Lys
20 Thr
40 Ala
60 Leu
80 Ser
100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
Arg
<210> 40 <211> 166
49<212> PRT
〈213>人屬，人種
<400> 40(R103E-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
6570 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
8590 95 100
Gly Leu Glu Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 41
〈211〉 166
<212〉 PRT
<213〉人屬，人種
<400〉 41 (R103H-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val
90 Arg 110 Leu 130
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys 150
85
Gly Leu His Ser Leu Thr Thr Leu Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro 125 Tyr 145
Asp Arg 165
Ala Uu Arg Ala Arg Thr lie Thr
Leu Phe Arg Val Cys Arg Thr Gly
95 Gin 115 Ala 135 Leu 155
Lys Glu Ala lie Asp Thr Phe Arg
Tyr
Thr Gly Glu
40 Ala
60 Leu
80 Ser 100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
〈210〉 42 <211〉 166 〈212〉 PRT 〈213〉人屬，人種
〈400〉 42 (R103N-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
51Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 85 90
Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys 105 110
Ala Ser Ala Ala Pro Leu 125 130
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 145 150
Asp Arg 165
Gly Leu Asn Ser Pro Pro Asp Ala Leu Phe Arg Val Cys Arg Thr Gly
Arg Thr lie Thr Gly Lys Leu Lys
75 Val
95 Gin 115 Ala 135 Leu 155
Asp
Tyr
80
Lys Ala Val Ser 100
Glu Ala lie Ser 120
Thr Phe Arg Lys 140
Thr Gly Glu Ala 160
<210> 43
<211> 166
〈212> PRT
<213>人屬，人種
<400> 43(R103Q-EPO)
Ala Pro ProArgLeulieCys AspSerArgVal Leu Glu ArgTyr
151015
Glu Ala GluAsnlieThrThr GlyCysAlaGlu His Cys SerLeu
253035
Val Pro AspThrLysValAsn PheTyrAlaTrp Lys Arg MetGlu
455055
Val Glu ValTrpGinGlyLeu AlaLeuLeuSer Glu Ala ValLeu
657075
Leu Val AsnSerSerGinPro TrpGluProLeu Gin Leu HisVal
859095
Gly Leu GinSerLeuThrThr LeuLeuArgAla Leu Arg AlaGin
105110115
Leu Leu Glu Ala Lys 20
Asn Glu Asn lie Thr 40
Val Gly Gin Gin Ala 60
Arg Gly Gin Ala Leu 80
Asp Lys Ala Val Ser 100
Lys Glu Ala lie Ser 120
52Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
〈210〉 44
〈211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 44 (S104A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala
15 10 15
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
Gly Gin Gly Gin Lys Als
Gin
Ala
Val
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Gly Leu Arg Ala Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu
145 150 155
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
Lys
20
Thr
40 Ala 60 leu
80 Ser 100 Ser 120 Lys 140 Ala 160165
<210〉 45 <211〉 166 <212> PRT 〈213〉人屬，人種 〈400〉 45 (S104I-EP0) Ala Pro Pro Arg Leu lie 1
Glu Ala Glu Asn
5
lie 25
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 10 15 Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
30
35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin 45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg 65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His 85 90
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
Gly Gin Lys Ala
Gly Leu Arg lie Pro Pro Asp Ala
Ser Ala Ala Pro
leu 105 Ala 125
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
110 Leu 130 Arg 150
Arg Gly
Val Asp 95
Gin Lys Glu Ala 115
Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe 135
Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly 155
Als Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160
〈210> 46 〈211〉 166 〈212〉 PRT
54<213>人屬，人種<400〉 46(S104E-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Glu Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
<210> 47
〈211〉 166
〈212> PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 47 (L105A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys15 10 15 20Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
90 95 100
Gly Leu Arg Ser Ala Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
110 115 120
Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys130135 140
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala150155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
lie25Lys45Gin65Ser85Ala105Ala125Tyr145Asp165
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
〈210〉 48
〈211〉 166
〈212〉 PRT〈213〉人屬，人種
〈400〉 48 (T106A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Ala Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 49
〈211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 49 (T106I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys八la Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu lie Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
57Pro Pro Asp
Leu Phe Arg
Cys Arg Thr
105Ala Ala
125Val Tyr
145Gly Asp
165
110 115
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg
130 135
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu
Arg
150
155
120Lys140Ala160
〈210〉 50
〈211> 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 50 (T107A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145150155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165
<210〉 51
<211> 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 51 (T107I-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr lie Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala
105 110
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu
125 130
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg
145 150Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
115
Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe135
Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly155
Ala Lys20
lie Thr40
Gin Ala60
Ala Leu80
Val Ser
100lie Ser
120Arg Lys
140Glu Ala
160
〈210〉 52
59<211> 166
<212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400> 52 (L108A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala L.eu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Ala Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 53
〈211〉 166
〈212〉 PRT〈213>人屬:
人種
〈400〉 53 (L108E-EPO)Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
601 5 Glu Ala Glu Asn lie 25
Val Pro Asp Thr Lys 45
Val Glu Val Trp Gin 65
Leu Val Asn Ser Ser 85
Gly Leu Arg Ser Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala 125
Leu Phe Arg Val Tyr 145
Cys Arg Thr Gly Asp 165
10
Thr Thr Gly Cys Ala 30
Val Asn Phe Tyr Ala 50
Gly Leu Ala Leu Leu 70
Gin Pro Trp Glu Pro 90
Thr Thr Glu Leu Arg 110
Ser Ala Ala Pro Leu 130 Arg 150
15
Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn 35
Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin 55
Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin 75
Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala 95
Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala 115
Arg Thr lie Thr
Ala Asp Thr Phe 135
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
155
20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160
Arg
〈210〉 54
〈211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 54(L108K-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Lys Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 55
〈211〉 166
<212> PRT 〈213〉人屬,
人種
<400〉 55(L108S-EPO) Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser
1 5 Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys 25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr 45
Arg
10
Ala
30
Ala
50
Val Leu Glu Arg Glu His Cys Ser Trp Lys Arg Met
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val
65 70 Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His
85 90 Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Ser Leu Arg Ala Leu Arg Ala
Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
15 20 Leu Asn Glu Asn lie Thr 35 40 Glu Val Gly Gin Gin Ala
55 60 Leu Arg Gly Gin Ala Leu
75 80 Val Asp Lys Ala Val Ser
95 100 Gin Lys Glu Ala lie SerPro Pro Asp Leu Phe Arg Cys Arg Thr
105 Ala Ala
125 Val Tyr
145 Gly Asp
165
110
Ser Ala Ala Pro Leu 130
Ser Asn Phe Leu Arg 150
Arg
115 120 Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
135 140 Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
155 160
〈210> 56
<211> 166
〈212〉 PRT
〈213>人屬，人種
〈400〉 56 (S146A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu
5
Asn lie Thr Thr Gly
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 10 15
Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 45
Cys Tyr
Ala 30 Ala 50
35
Trp Lys Arg Met Glu Val 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg 65 70 75
Gly Gin Gly Gin
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ala Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
145 150 155
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
AIei Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160
63Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
<210> 57
〈211〉 166
〈212> PRT
〈213〉人屬，人種
<400> 57 (N147A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu
Cys Asp Thr Gly
Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 10 15
5
Asn lie Thr 25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin
Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn 30 35
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Ala Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
150
155
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160
<210〉 58〈211〉 166
〈212〉 PRT
<213>人屬，人種
<400〉 58 (F148A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Ala Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 59
〈211〉 166
<212> PRT <213>人屬:
人種
〈400〉 59 (F148Y-EPO) Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys1 5 Glu Ala Glu Asn lie 25
Val Pro Asp Thr Lys 45
Val Glu Val Trp Gin 65
Leu Val Asn Ser Ser 85
Gly Leu Arg Ser Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala 125
Leu Phe Arg Val Tyr 145
Cys Arg Thr Gly Asp 165
Thr Thr Gly Cys Val Asn Phe Tyr
10 15
Ala Glu His Cys Ser Leu Asn 30 35
Ala Trp Lys Arg Met Glu Val 50 55
Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg
70 75
Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
90 95
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys
110 115
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp
130 135
Ser Asn Tyr Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr 150 155
Arg
20
Glu Asn lie Thr 40
Gly Gin Gin Ala 60
Gly Gin Ala Leu 80
Lys Als Val Ser 100
Glu Ala lie Ser 120
Thr Phe Arg Lys 140
Thr Gly Glu Ala 160
〈210〉 60
〈211〉 166
〈212〉 PRT 〈213〉人屬，人種
<400〉 60 (L149A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
6645 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Ala Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 61
〈211〉 166
〈212〉 PRT
<213>人屬，人種
<400〉 61 (R150A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu
5
Asn lie Thr Thr Gly
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 10 15
Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 45
Cys Tyr
Ala 30 Ala 50
35
Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala 85 90 95
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser 100
67Gly Leu Arg Ser Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala 125 Val Tyr 145 Gly Asp 165
Leu Phe Arg Cys Arg Thr
Thr Thr Uu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
115 120
Ala Asp Thr Phe Arg Lys
135 140
Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
155 160
Arg 110 Leu 130 Ala 150
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr
Ser Asn Phe Leu Ala Gly Lys Leu Lys
Arg
〈210〉 62
<211> 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400〉 62 (R150E-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu
5
Asn lie Thr Thr Gly
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 10 15
Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
Cys Tyr
35
Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin
Ala 30 Ala
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala 85 90 95
Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala
Gly Leu Arg Pro Pro Asp Leu Phe Arg
105 110 115
Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
125 130 135
Val Tyr Ser Asn Phe Leu Glu Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Als L>eu 80
Val Ser 100
lie Ser 120
Arg Lys 140
Glu Ala145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
<210> 63
<211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 63 (R150I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu
Cys Asp Thr Gly
Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 10 15
5
Asn lie Thr 25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin
Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn 30 35
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His
85 90
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
105 110 Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu
125 130 Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu lie
145 150 Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
Arg Gly
75
Val Asp Lys Ala 95
Gin Lys Glu Ala 115
Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe 135
Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly 155
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Als Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160〈210> 64
〈211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 64 (G151A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Ala Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
〈210〉 65
〈211〉 166
<212〉 PRT
<213>人屬，人種
<400> 65 (K152A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys1 5 Glu Ala Glu Asn lie Thr 25
Val Pro Asp Thr Lys Val 45
Val Glu Val Trp Gin Gly 65
Leu Val Asn Ser Ser Gin 85
Gly Leu Arg Ser Leu Thr 105
Pro Pro Asp Ala Ala Ser 125
Leu Phe Arg Val Tyr Ser 145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
<210〉 66 〈211〉 166 〈212〉 PRT 〈213〉人屬，人種 <400> 66(K152W-EPO) Ala Pro Pro Arg Leu lie 1 5 Glu Ala Glu Asn lie Thr 25
Val Pro Asp Thr Lys Val 45
Val Glu Val Trp Gin Gly
10
Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn 30
Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val 50
Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg 70
Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 90
Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys 110
Ala Ala Pro Leu 130
Asn Phe Leu Arg 150
Arg Thr lie Thr Ala Asp 135
Gly Ala Leu Lys Leu Tyr
15 Leu 35 Glu 55 Leu 75 Val 95 Gin 115 Ala 135 Leu 155
20
Glu Asn lie Thr 40
Gly Gin Gin Ala 60
Gly Gin Ala Leu 80
Lys Ala Val Ser 100
Glu Ala lie Ser 120
Thr Phe Arg Lys 140
Thr Gly Glu Ala 160
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
10 15 20
Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
30 35 40
Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
50 55 60
Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser85 90 95 100Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser105 110115 120Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys125 130 135 140Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Trp Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165〈210〉 67〈211〉 166〈212〉 PRT<213>人屬，人種<400> 67 (C161A-EP0)Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60Val Giu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser120105110115Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 125Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe 145Ala Arg Thr Gly Asp Arg 165Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp 130 135Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr 150 155Thr Phe Arg Lys 140Thr Gly Glu Ala 160〈210〉 68<211〉 166〈212> PRT〈213〉人屬，人種<400> 68 (R162A-EPO)Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu15 10 15Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn25 30 35Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin45 50 55Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin65 70 75Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala85 90 95Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala110105Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu 125 130Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 145 150Cys Ala Thr Gly Asp Arg 165Arg GlyThr lie ThrLys Leu Lys115 Ala 135 Leu 155Asp TyrThr PheThr GlyAla Lys 20lie Thr 40Gin Ala 60Ala Leu 80Val Ser100 lie Ser120 Arg Lys140 Glu Ala1607權(quán)利要求
1.一種無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素，為野生型人促紅細(xì)胞生成素在下述三個(gè)區(qū)域中的至少一個(gè)區(qū)域進(jìn)行突變而產(chǎn)生的變構(gòu)體(1)VLQRY人促紅細(xì)胞生成素的第11-15號(hào)氨基酸；(2)TKVNFYAW人促紅細(xì)胞生成素的第44-51號(hào)氨基酸；(3)SGLRSLTTL人促紅細(xì)胞生成素的第100-108號(hào)氨基酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素， 其特征在于所述突變?yōu)閱吸c(diǎn)或多點(diǎn)突變、單個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、以及突變加缺失復(fù)合突 變。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生 成素，其特征在于所述無(wú)促紅細(xì)胞生成特性的新型促紅細(xì)胞生成素為序列表SEQID No.7至SEQ ID No.68中的任一氨基酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素， 其特征在于，特別是第14號(hào)精氨基突變?yōu)楸被?序列#14)，谷氨酰胺(序列S15)以 及谷氨酸(序列#16);第45號(hào)賴氨酸突變?yōu)楸被?序列#21)以及谷氨酸(序列 #22);第100號(hào)絲氨酸突變?yōu)楸被?序列tt33)以及谷氨酸(序列#34);第103號(hào)精 氨基突變?yōu)楸被?序列tt39)以及谷氨酸(序列tt40);第104號(hào)絲氨酸突變?yōu)楸被?序 列M4)，異亮氨酸(序列M5)以及谷氨酸(序列1146)。
5. —種無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素，其特征在于 除權(quán)利要求l中所述三個(gè)區(qū)域外，在人促紅細(xì)胞生成素的第6， 7， 10， 20， 21， 29， 33， 38， 42， 52， 59， 63， 67， 70， 83， 96， 97， 126， 142， 149， 150， 151， 152, 153， 155， 156， 161號(hào)氨基酸位置進(jìn)行突變而產(chǎn)生的變構(gòu)體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的無(wú)促紅細(xì)胞生成特性的新型促紅細(xì)胞生成素，與其 它蛋白或多肽進(jìn)行融合、置換、化學(xué)交聯(lián)而產(chǎn)生的新型融合蛋白。
7. —種無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素在制備保持、 增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用、或用于神經(jīng)功能康復(fù)治療的藥物中的應(yīng)用。
8. —種無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素在制備用于中 樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的臟器，如心臟、腎臟等臟器的缺血性損傷的治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無(wú)促紅細(xì)胞生成特性、具有神經(jīng)保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素及其用途。本發(fā)明為在野生型人促紅細(xì)胞生成素的下述三個(gè)區(qū)域中的至少一個(gè)區(qū)域及其它28個(gè)散在位點(diǎn)發(fā)生突變產(chǎn)生的變構(gòu)體(1)VLQRY人促紅細(xì)胞生成素的第11-15號(hào)氨基酸；(2)TKVNFYAW人促紅細(xì)胞生成素的第44-51號(hào)氨基酸；(3)SGLRSLTTL人促紅細(xì)胞生成素的第100-108號(hào)氨基酸。本發(fā)明具有神經(jīng)保護(hù)作用，但無(wú)促紅細(xì)胞生成作用，避免了常規(guī)促紅細(xì)胞生成素導(dǎo)致繼發(fā)性血栓形成，增加臨床應(yīng)用安全性；擴(kuò)大了治療群體，使血液粘稠度較高而不能用常規(guī)促紅細(xì)胞生成素進(jìn)行治療的腦卒中患者得到治療；本發(fā)明48小時(shí)后給藥，仍具有明顯改善神經(jīng)功能作用?？梢蚤L(zhǎng)期注射對(duì)血液系統(tǒng)沒(méi)有刺激。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101671389SQ20081022210
公開(kāi)日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2008年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日
發(fā)明者吉訓(xùn)明, 曹國(guó)棟, 羅玉敏, 娟 邢, 俊 陳 申請(qǐng)人:曹國(guó)棟;陳 俊;羅玉敏;吉訓(xùn)明;邢 娟