專利名稱：保持內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素組織保護(hù)活性的長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的能較好保持組織保護(hù)能力的長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成素。特別的，本發(fā)明涉及經(jīng)化學(xué)修飾的長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成素，所述化學(xué)修飾不僅延長(zhǎng)了其在血清中的半衰期，也保持了天然蛋白在體內(nèi)的組織保護(hù)功能。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明所述長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成素來治療貧血及其相關(guān)疾病。最后，本發(fā)明涉及一種分析促紅細(xì)胞生成素是否具有組織保護(hù)能力的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
自然生成的或內(nèi)源性的促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種主要由腎臟生的糖蛋白激素。內(nèi)源性的EPO包含165個(gè)氨基酸，分子量(人類的)為大約30,000大約到34,000道爾頓。EPO中的糖基，其由3個(gè)N-連接和1個(gè)O-連接的寡糖鏈構(gòu)成，它占了整個(gè)蛋白質(zhì)分子量的大約40％。N-連接的寡糖鏈結(jié)合在24，38和83位的天冬酰胺的氨基氮上，而O-連接的寡糖鏈結(jié)合在126位上的絲氨酸殘基的氧原子上。EPO可能存在3種形式α、β和脫唾液酸形式(Asialo)。α和β形式具有相同的效力，生物活性，和分子量，但在糖類的組成上略有不同，而脫唾液酸形式是糖鏈中的末端唾液酸被除去的α或β形式，所述末端唾液酸屏蔽糖鏈，使其不被肝臟識(shí)別。
直到最近，內(nèi)源性的EPO的主要功能是和其它生長(zhǎng)因子一同刺激響應(yīng)性骨髓紅細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖和成熟，以及保持個(gè)體的血細(xì)胞比容(在含有紅細(xì)胞的全血中所占的百分率)。紅細(xì)胞的產(chǎn)生過程稱為紅細(xì)胞生成，它是一種被精確調(diào)控的生理機(jī)制，在不妨礙循環(huán)的情況下優(yōu)化紅細(xì)胞的數(shù)量使其滿足組織氧化的需要。例如，當(dāng)紅細(xì)胞輸送的氧減少時(shí)，EPO通過刺激骨髓中前體細(xì)胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)化為成熟的紅細(xì)胞增加紅細(xì)胞的產(chǎn)生，產(chǎn)生的紅細(xì)胞隨即進(jìn)入循環(huán)體系中。當(dāng)循環(huán)系統(tǒng)中的紅細(xì)胞的數(shù)量超過正常組織循環(huán)需要時(shí)，循環(huán)體系中的EPO就減少。因此，當(dāng)機(jī)體處于健康狀態(tài)時(shí)，血漿中EPO的濃度是非常低，僅足以刺激替代由于老化而正常損失的紅細(xì)胞。血漿EPO的正常范圍是從0.01單位/ml到0.03單位/ml。
假定個(gè)體中大多數(shù)的EPO是由腎產(chǎn)生的，腎功能的損失，例如慢性腎衰竭(CRE)，會(huì)導(dǎo)致EPO數(shù)量的減少并且常常會(huì)導(dǎo)致貧血。同樣，貧血可能由其它的慢性疾病，例如癌癥，或與這些疾病相關(guān)的治療，如化療所引起。因此，已經(jīng)證明，給紅細(xì)胞減少的個(gè)體施用重組的EPO(后面將詳細(xì)敘述到)能夠有效的恢復(fù)血細(xì)胞比容的水平，所述重組的EPO與內(nèi)源性EPO有基本上同樣的生物活性。
除了其在慢性癥狀下保持血細(xì)胞比容水平中的作用外，重組EPO已經(jīng)被用于在選擇性或預(yù)定的手術(shù)之前增加紅細(xì)胞水平，從而減少或取消輸血的需要。例如，施用重組EPO可以解除患者對(duì)通過輸血而感染病毒或病原的顧慮，或解決宗教上限制輸血的問題。
進(jìn)一步的，近來的一些證據(jù)表明，EPO作為細(xì)胞因子超家族的一員，具有其它重要的治療屬性，這通過其與EPO受體(EPO-R)的相互作用來介導(dǎo)。例如，EPO及其受體在緩減組織損傷中起著重要的作用，因?yàn)镋PO和其受體相互作用提供了改變?nèi)毖跫?xì)胞微環(huán)境的補(bǔ)償性應(yīng)答，以及調(diào)控由于代謝壓力產(chǎn)生的程序性細(xì)胞死亡。事實(shí)上，患有慢性腎衰竭和/或癌癥的患者使用EPO治療后，一般會(huì)提高康復(fù)的感覺或智力的敏銳性，這樣的效果此前被歸功于患者血細(xì)胞比容的增加。但近來，如在國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩O/02053580和美國(guó)專利公開號(hào)2002/0086818和2003/0072737中所述的，這些改進(jìn)被歸功于EPO的組織保護(hù)和增強(qiáng)的活性。
最近的研究同樣表明，全身性施用的EPO可以通過血腦屏障，因?yàn)樾纬裳X屏障的毛細(xì)管也表達(dá)EPO受體。因此，這提供了從外周循環(huán)到腦部的受體介導(dǎo)的胞吞作用的解剖基礎(chǔ)。
重組人EPO(epoetinα)，可以通過商業(yè)途徑獲得，如商品名為PROCRIT(來自O(shè)rtho Biotech Inc.，Raritan，NJ)，和EPOGEN(來自Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA)，已經(jīng)用于治療由晚期腎病引起的貧血，同AZT(疊氮胸苷)療法一起使用來治療感染HIV的患者，和用于抵消化療的影響。雖然重組人EPO的治療作用有很多種，但至今為止重組人EPO最主要的用途是緩減慢性貧血。在這一點(diǎn)上，在大約6到8周內(nèi)重組人EPO典型的初始施用劑量是50-150單位/kg每周三次，靜脈或皮下注射給藥，以恢復(fù)患者體內(nèi)指導(dǎo)性的血細(xì)胞比容范圍。當(dāng)患者獲得預(yù)期的血細(xì)胞比容水平，例如在約30％到約36％之間的量之后，可以在無缺鐵或并發(fā)癥的情況下通過維持EPO的劑量而維持所述的血細(xì)胞比容水平，所述劑量是足夠的量，并且以適于維持起始劑量的EPO所達(dá)到的正常血細(xì)胞比容水平的頻率施用。雖然劑量的要求可能根據(jù)患者個(gè)體的需求而變化，但通常維持劑量可以是每周約給藥三次(如果劑量更大的話，次數(shù)可以更少)。
重組EPO的施用劑量和次數(shù)部分取決于該分子的半衰期，當(dāng)分子處于體內(nèi)時(shí)可能是很有限的。例如，據(jù)報(bào)道在患有CRF的成年及兒童患者中，靜脈施用的EPOGEN以符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)的速率被清除，其循環(huán)半衰期在約4-13小時(shí)范圍內(nèi)。因此，為了達(dá)到治療效果考慮到重組EPO相對(duì)較短的半衰期，對(duì)施用劑量和效率進(jìn)行調(diào)整。
另外，因?yàn)橹亟MEPO通過靜脈或皮下注射，這常常就需要護(hù)士或醫(yī)師來給患者注射重組EPO。這給患者帶來了更多的不便，這也就成為另外一個(gè)之所以要考慮分子半衰期延長(zhǎng)的原因。因此，增加重組EPO半衰期的研究在過去的十年中受到重視，這基于如下前提，即延長(zhǎng)的半衰期可以減少需求的劑量，同時(shí)也提供了相同的或改進(jìn)了的治療效果。
事實(shí)上，關(guān)于人類EPO最新的實(shí)驗(yàn)表明，EPO中含有唾液酸的糖含量，它的循環(huán)半衰期，和體內(nèi)活性之間有著直接的關(guān)系。正如PCT公開號(hào)WO95/05465中描述的那樣，唾液酸殘基加在糖鏈的末端并阻止了肝臟對(duì)半乳糖的識(shí)別。典型地，每條N-連接的寡糖鏈含有至多4個(gè)唾液酸，每條O-連接的寡糖鏈含有至多2個(gè)唾液酸。因此，未被修飾的EPO多肽總共可以含有最多14個(gè)唾液酸。
隨著時(shí)間的推移，這些唾液酸殘基可能從蛋白質(zhì)上斷裂，從而暴露了可以被肝臟識(shí)別的半乳糖殘基。一旦肝臟識(shí)別到半乳糖殘基，蛋白質(zhì)就從血液中過濾掉了。因此，據(jù)信逐步增加每個(gè)EPO分子所含有的唾液酸，可以更好的避免半乳糖殘基的暴露，也相應(yīng)的逐步增加了它的生物活性(通過檢測(cè)分離的相同分子量濃度的促紅細(xì)胞生成素提高正常老鼠的血細(xì)胞比容的能力方法)。由于未修飾的EPO僅含有14個(gè)唾液酸位點(diǎn)，這樣的結(jié)構(gòu)限制了EPO半衰期的延長(zhǎng)。這導(dǎo)致了如下假說即工程化的含有額外寡糖鏈的EPO類似物可能具有更強(qiáng)的生物學(xué)活性。通過提供額外的糖基化位點(diǎn)，含有末端的額外的寡糖鏈可以被唾液酸殘基修飾。參見PCT公開號(hào)為WO91/05867，WO94/09257和WO01/81405的申請(qǐng)。
例如，修飾的EPO類似物可以至少含有一個(gè)額外的N-連接的糖鏈和/或至少一個(gè)額外的O-連接的糖鏈。特別是在WO01/81405中公開了在分子的30、51、57、69、88、89、136和/或138位點(diǎn)的氨基酸處增加N-連接的糖鏈。修飾過的EPO分子可以在任何位置含有1-4個(gè)額外的糖基化位點(diǎn)，使得EPO分子可以增加2-16個(gè)唾液酸殘基。此外，延長(zhǎng)EPO半衰期的嘗試涉及將聚乙二醇(PEGs)連接到EPO蛋白的氨基酸主鏈。參見，PCT公開WO0032772，WO0102017，WO03029291；美國(guó)公開Nos.US2003077753，US20030120045，US200301666566；和美國(guó)專利Nos.6,583,272和6,340,272。也已經(jīng)采用將其它蛋白連接于EPO的融合構(gòu)建體延長(zhǎng)EPO的半衰期。參見，美國(guó)公開nos.20040009902，20030124115，20030113871，和美國(guó)專利No.6,242,570。
雖然這些增加EPO血清半衰期的努力已經(jīng)被證明是成功的并且在保持血細(xì)胞比容水平上證明是有用的，但是卻沒有注意到這些額外的修飾對(duì)EPO的其它功能可能產(chǎn)生的影響。
因此，需要提供延長(zhǎng)了血清半衰期(長(zhǎng)效)并保持了內(nèi)源性EPO的功能的經(jīng)修飾的EPO。特別的，本領(lǐng)域內(nèi)需要一種長(zhǎng)效的EPO化合物，其具有促紅細(xì)胞功能和組織保護(hù)功能，用于治療貧血和/或相關(guān)疾病的藥物組合物。另外，人們還需要用于確定一種特定的EPO對(duì)內(nèi)源性EPO的組織保護(hù)能力是否具有拮抗性的檢測(cè)方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)人類血細(xì)胞比容水平的方法，包括提供一種比重組人類促紅細(xì)胞生成素(rhuEPO)有更長(zhǎng)血清半衰期的、具有組織保護(hù)功能的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品的步驟和施用治療有效量的該促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品(此后稱作長(zhǎng)效EPO)的步驟。在一個(gè)技術(shù)方案中，提供長(zhǎng)效EPO的步驟還包含使用至少一種化學(xué)修飾在至少一個(gè)N-連接的寡糖鏈或O-連接的寡糖鏈上修飾重組EPO的步驟，這里所述的化學(xué)修飾包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化或它們的組合。
另外，施用治療有效量的長(zhǎng)效EPO的步驟，可以包含施用低于rhuEPO摩爾量的長(zhǎng)效EPO，以達(dá)到相當(dāng)?shù)难?xì)胞比容。
在一個(gè)技術(shù)方案中，長(zhǎng)效EPO的血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期長(zhǎng)20％。在另一個(gè)技術(shù)方案中，長(zhǎng)效EPO的血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期延40％。
本發(fā)明也涉及人造促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品(長(zhǎng)效EPO)，其包含至少一種促紅細(xì)胞生成素衍生物，其中至少一個(gè)N-連接的寡糖鏈或至少一個(gè)O-連接的寡糖鏈上有至少一種化學(xué)修飾所述化學(xué)修飾來源于氧化、硫化、磷酸化、PEG化或它們的組合，這里所述的長(zhǎng)效EPO具有比rhuEPO更長(zhǎng)的血清半衰期。該長(zhǎng)效EPO優(yōu)選具有組織保護(hù)功能。
在一個(gè)技術(shù)方案中，至少一種化學(xué)修飾包括至少一個(gè)N-連接的寡糖鏈或至少一個(gè)O-連接的寡糖鏈氧化以提供至少一個(gè)額外的酸性殘基。例如，至少一種化學(xué)修飾可以包括在至少一個(gè)N-連接的寡糖鏈或至少一個(gè)O-連接的寡糖鏈的硫酸化以提供負(fù)電荷增加了的長(zhǎng)效EPO。在另一個(gè)技術(shù)方案中，至少一種化學(xué)修飾包括至少一個(gè)N-連接的寡糖鏈或至少一個(gè)O-連接的寡糖鏈的磷酸化以提供負(fù)電荷增加了的長(zhǎng)效EPO。在另一方面。至少一種化學(xué)修飾包括在至少一個(gè)N-連接的寡糖鏈或至少一個(gè)O-連接的寡糖鏈上增加聚乙二醇鏈。
本發(fā)明也涉及一種制備具有延長(zhǎng)的血清半衰期和組織保護(hù)功能的長(zhǎng)效EPO的方法，包括如下步驟提供至少一種促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素的衍生物；在所述至少一種內(nèi)源性或重組的促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素衍生物的至少一個(gè)N-連接的寡糖鏈或至少一個(gè)O-連接的寡糖鏈上進(jìn)行氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合方式的修飾。
修飾的步驟還可以包括將至少一個(gè)N-連接的寡糖鏈或至少一個(gè)O-連接的寡糖鏈上的至少一個(gè)鄰位羥基用至少一種酸殘基進(jìn)行取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，在至少一個(gè)N-連接的寡糖鏈或至少一個(gè)O-連接的寡糖鏈上的至少一個(gè)鄰位羥基用至少一種酸殘基進(jìn)行取代的步驟還可以包括用至少多種酸殘基進(jìn)行取代在至少一個(gè)N-連接的寡糖鏈或至少一個(gè)O-連接的寡糖鏈上的至少多個(gè)鄰位羥基。
在另一技術(shù)方案中，修飾的步驟還包括如下的步驟提供一種有機(jī)溶劑；在溶劑中溶解促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素的衍生物以形成溶液；提供至少一種縮合劑；提供至少一種硫酸鹽供體；并且將至少一種縮合劑和至少一種硫酸鹽供體混合到上述的溶液中去。在另一個(gè)技術(shù)方案中，修飾的步驟還包括如下的步驟提供一種有機(jī)溶劑；將所述促紅細(xì)胞生成素或促細(xì)紅胞生成素衍生物溶解到所有有機(jī)溶劑中的形成溶液；提供至少一種縮合劑；提供磷酸；并且將至少一種縮合劑和至少一種磷酸混合到上述的溶液中去。
在另一個(gè)技術(shù)方案中，修飾的步驟還包括如下的步驟提供一種有機(jī)溶劑；在該有機(jī)溶劑中溶解促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素的衍生物以形成第一溶液；提供至少一種氧化劑；將至少一種氧化劑加到第一溶液中以形成第二溶液；提供至少一種聚乙二醇鏈；將至少一種聚乙二醇鏈混合到第二溶液中去。提供至少一種聚乙二醇鏈的步驟可以包括提供在鏈的末端含有至少一個(gè)伯氨基團(tuán)的至少一種聚乙二醇鏈。
本發(fā)明也涉及一種治療有組織損傷危險(xiǎn)的患者的貧血的方法，其包括如下的步驟提供一種至少一個(gè)N-連接的寡糖鏈或至少一個(gè)O-連接的寡糖鏈上具有至少一種化學(xué)修飾的長(zhǎng)效EPO，這里所述的化學(xué)修飾包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合；施用治療有效量的長(zhǎng)效EPO，這里所述的長(zhǎng)效EPO的施用摩爾量低于rhuEPO，但可以達(dá)到相當(dāng)?shù)哪繕?biāo)血細(xì)胞比容，這里所述的長(zhǎng)效EPO具有組織保護(hù)功能。
在本發(fā)明的這一方面，長(zhǎng)效EPO優(yōu)選具有比rhuEPO的血清半衰期長(zhǎng)的半衰期。在一個(gè)實(shí)施方案中，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期長(zhǎng)20％。另一方面，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期長(zhǎng)40％。
本發(fā)明還涉及包括如下成分的藥物組合物至少一種治療有效量的長(zhǎng)效EPO，其至少一個(gè)N-連接的寡糖鏈或至少一個(gè)O-連接的寡糖鏈上有至少一種化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾來源于氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合方式，這里所述的至少一種長(zhǎng)效EPO具有比重組紅細(xì)胞生成素更長(zhǎng)的血清半衰期并且具有組織保護(hù)功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物組合物還包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體。該至少一種藥學(xué)上可接受的載體可以包含至少一種稀釋劑、佐劑、賦形劑、載體、或其組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該該藥物組合物還包含至少一種潤(rùn)濕劑、乳化劑、pH緩沖劑、或其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該該藥物組合物還包含至少一種組織保護(hù)因子。


本發(fā)明進(jìn)一步的特征和優(yōu)點(diǎn)在結(jié)合下述附圖進(jìn)行的詳細(xì)描述之后將變得更清楚，有關(guān)的附圖描述如下圖1示出了一些數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)證明過度糖基化的EPO類似物能夠通過血腦屏障，這是通過腦脊液取樣所證明的；和圖2是不同形式的EPO對(duì)于暴露在三甲基錫中引起的細(xì)胞死亡的保護(hù)作用有效性的比較。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及長(zhǎng)效EPO的應(yīng)用，所述長(zhǎng)效EPO是具有延長(zhǎng)了的血清半衰期(長(zhǎng)效)的EPO分子，所述長(zhǎng)效來源于化學(xué)修飾連接于EPO的氨基酸主鏈的糖鏈，從而得以保持內(nèi)源性EPO的功能。正如在背景技術(shù)中描述的那樣，延長(zhǎng)EPO半衰期的努力，通常集中在添加物質(zhì)到EPO的氨基酸主鏈--添加糖鏈、PEGs、蛋白等。但是據(jù)信，這些添加的物質(zhì)影響了EPO類似物的功能，從而使得，例如，該功能被損害以獲得較長(zhǎng)半衰期。雖然已知的比重組EPO具有更長(zhǎng)半衰期的EPO類似物具有紅細(xì)胞生成活性，但這些類似物沒有保留最近發(fā)現(xiàn)的EPO的其它治療功能，如，組織保護(hù)活性。
例如，對(duì)應(yīng)于EPO的30-47位的17個(gè)氨基酸的片斷，也被稱為O’Brien肽，已經(jīng)在體外顯示具有組織保護(hù)活性，但是在體外卻沒有促紅細(xì)胞活性。Campana，W.M.，Misasi，R.&O’Brien，J.S.，Int.J.Mol.Med.，1，235-41(1998)。因此，據(jù)信在O’Brien肽序列內(nèi)具有添加物質(zhì)的修飾過的EPO類似物在其它體外試驗(yàn)中不具備組織保護(hù)活性。另外，因?yàn)镋PO的三維取向?qū)τ谄涔δ芷鹬匾饔?，?duì)該分子添加物質(zhì)可能影響得到的EPO類似物的整體功能。
因此，本發(fā)明涉及長(zhǎng)效的EPO，其具有紅細(xì)胞生成活性、組織保護(hù)活性、胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)(transcytosis)能力中的至少一種或其組合。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO具有組織保護(hù)活性、胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用中的至少一種以及紅細(xì)胞生成活性。
在一個(gè)具體的方案中，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO具有比重組EPO長(zhǎng)至少約20％的血清半衰期。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO具有比重組EPO長(zhǎng)至少約30％的血清半衰期。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO具有比重組EPO長(zhǎng)至少約40％的血清半衰期。
簡(jiǎn)單的說，與天然(內(nèi)源性)EPO，優(yōu)選與天然的人類EPO相比，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs包括帶有通過至少一種修飾而改變的糖鏈的EPO類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs經(jīng)過對(duì)糖鏈的多種修飾。
在一個(gè)實(shí)施方案中，把天然EPO糖鏈的鄰位(vicinyl)羥基氧化成酸性殘基以制備本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用更穩(wěn)定的酸性殘基取代EPO分子上的唾液酸殘基。在又一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)EPO糖鏈的硫化和/或磷酸化會(huì)產(chǎn)生本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO。在再一個(gè)實(shí)施方案中，可以在EPO糖鏈加上聚乙二醇以獲得本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO。前述修飾的任意組合也包括在本發(fā)明中。并且，正如前面提到的那樣，本發(fā)明還包含組合物，包括藥物組合物，其包含一種或幾種前面提到的長(zhǎng)效EPO分子。
本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO分子預(yù)期應(yīng)用于藥物組合物中，該藥物組合物可以治療貧血及相關(guān)疾病、尤其是由包括但不限于急性腎衰竭、膿血癥、HIV、化療等等疾病所引發(fā)的并發(fā)癥。
本發(fā)明也涉及治療貧血及相關(guān)疾病的方法，同時(shí)涉及一種用于治療過程的試劑盒。這里用到的術(shù)語“治療”指藥物治療和預(yù)防或防護(hù)的措施，其目的是為了防止或減緩(減少)靶向的病理狀況或失調(diào)。那些需要治療的對(duì)象包括已經(jīng)患有該失調(diào)(disorder)的對(duì)象，以及那些易感該失調(diào)的對(duì)象，或那些有待于對(duì)該失調(diào)進(jìn)行預(yù)防的對(duì)象。本發(fā)明包括該長(zhǎng)效EPO可用于慢性給藥、急性治療、和/或間斷性給藥。為了本文的目的，“慢性給藥”是指相對(duì)于急性給藥模式而言以連續(xù)的模式給藥，以利于長(zhǎng)期保持起始治療效果(活性)，“間斷性給藥”不是無間斷地連續(xù)進(jìn)行的，而是循環(huán)進(jìn)行的。
本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO，和其用途，可以應(yīng)用于任何哺乳動(dòng)物。在這里，術(shù)語“哺乳動(dòng)物”是指任何分類在哺乳類的動(dòng)物，包括人類、馴服的和圈養(yǎng)的動(dòng)物，和動(dòng)物園的、比賽用的、或?qū)櫸?，如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔子等。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是人。本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO的給藥包括但不限于，口服、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、局部、腔內(nèi)、吸入或非腸胃給藥，后者包括靜脈、動(dòng)脈、皮下、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、黏膜下層、皮內(nèi)，及其組合方式。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO的應(yīng)用，其作為其它分子進(jìn)入體內(nèi)具有EPO受體的區(qū)域的載體。例如，因?yàn)橐恍┓肿泳哂械偷难X屏障穿透能力，將這些分子與本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs分子連接，就為這些分子進(jìn)入腦部提供了一個(gè)安全有效的轉(zhuǎn)運(yùn)體系。并且，隨后將詳細(xì)討論，因?yàn)樯眢w的其它區(qū)域表達(dá)EPO受體，如視網(wǎng)膜、心臟、和肺，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO可以為對(duì)于在這些區(qū)域穿透力低的分子擔(dān)當(dāng)起轉(zhuǎn)運(yùn)體系的角色。
進(jìn)一步，本發(fā)明涉及確定特定的EPO是否保持了內(nèi)源性EPO的功能的檢測(cè)方法。例如，本發(fā)明所述的檢測(cè)可以確定修飾過的EPO是否具有組織保護(hù)活性，也就是內(nèi)源性EPO的激動(dòng)劑。在這里，術(shù)語“激動(dòng)劑”用于其最寬的含義，包括那些模擬天然EPO生物活性的分子。用同樣的方式，術(shù)語“拮抗劑”最廣義上講包括那些部分或全部阻斷、抑制、或中和天然EPO活性的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，在體外分析中檢測(cè)特殊EPO的存在，如P19細(xì)胞和/或老鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分析。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的檢測(cè)包括評(píng)價(jià)特殊EPO在體內(nèi)的活性，使用各種不同的分析方法如大鼠定點(diǎn)局部缺血、大鼠視網(wǎng)膜缺血、脊椎損傷、和荷包牡丹堿發(fā)作模型。
功能正如在背景技術(shù)部分描述的那樣，為了增加EPO半衰期的各種嘗試已經(jīng)成功，因?yàn)槠涞玫搅司哂休^長(zhǎng)半衰期和保持促紅細(xì)胞生成活性的EPO類似物。并且，正如描述的那樣，具有較長(zhǎng)半衰期的EPO類似物主要包括對(duì)EPO的氨基酸序列的添加物質(zhì)。所述添加包括糖鏈、PEGs和蛋白序列。但是可以預(yù)見到，這些添加可能影響EPO的其它治療活性，如組織保護(hù)功能和分子胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用。不受任何特別的理論的局限，基于O’Brien肽序列對(duì)組織保護(hù)功能的重要性，在O’Brien肽序列上增加糖鏈，可能影響其功能。另外，增加的糖鏈，不論是在O’Brien肽序列內(nèi)或之外，據(jù)信都會(huì)影響到分子的三維取向。例如，在分子的三維構(gòu)型中，增加的糖鏈可能阻斷分子中對(duì)其功能來說必不可少的區(qū)域。進(jìn)一步的，據(jù)信添加物質(zhì)可能也會(huì)影響到糖蛋白的功能。盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員可能熟悉一些在EPO的氨基酸主鏈上添加或連接額外的糖類、聚乙二醇、蛋白等的方法，添加的糖類將代表對(duì)EPO的氨基酸主鏈的其它添加。
組織保護(hù)能力為了評(píng)價(jià)增加的糖鏈影響糖蛋白功能的可能性，本發(fā)明人研究了各種形式的具有5個(gè)N-連接糖鏈(相比于重組EPO的3-個(gè)N-連接的糖鏈)的EPO類似物。具體說來，本發(fā)明人使用了EPO類似物，所述類似物在32位氨基酸處有額外的糖基化位點(diǎn)，其導(dǎo)致了比重組EPO(epoetinα)延長(zhǎng)了約3倍的半衰期。
雖然該EPO類似物在全身注射后在腦脊髓液中出現(xiàn)(圖1)，但在隨后的體外P19檢測(cè)(圖2)中驚奇的發(fā)現(xiàn)沒有組織保護(hù)活性。這種組織保護(hù)活性的缺失是意外的。另外，如果這些患者有需要組織保護(hù)能力的其它病況的話，組織保護(hù)活性的缺失可能會(huì)在治療貧血患者時(shí)引起并發(fā)癥。例如，如果這些沒有組織保護(hù)活性的EPO類似物與有組織保護(hù)活性的內(nèi)源性EPO競(jìng)爭(zhēng)那些引發(fā)組織保護(hù)應(yīng)答的受體，由損傷產(chǎn)生的受傷程度可能會(huì)由于這樣的EPO的作用而實(shí)際上被加重。事實(shí)上，如果遭受中風(fēng)的患者施用這樣的EPO類似物，相比較于沒有使用EPO類似物治療的個(gè)體來說，由中風(fēng)引起的梗塞體積實(shí)際上可能會(huì)更大。
不受束縛于任何特殊的理論，這些發(fā)現(xiàn)揭示了至少一種額外的EPO受體類型功能性地存在于神經(jīng)組織中，其發(fā)出的信號(hào)不同于紅細(xì)胞前體所發(fā)出的信號(hào)，存在某種EPO類似物可能拮抗內(nèi)源性EPO與這種形式的受體結(jié)合的能力的危險(xiǎn)。內(nèi)源性EPO和這些EPO類似物的明顯不同的生物活性揭示了受體是通過相應(yīng)于EPO分子不同結(jié)構(gòu)域的功能差異EPO受體產(chǎn)生信號(hào)的。事實(shí)上，雖然已經(jīng)報(bào)道EPO受體基因蛋白質(zhì)序列與紅細(xì)胞前體所表達(dá)的相同，但在體外，神經(jīng)型EPO受體的結(jié)合親和力大大低于前紅細(xì)胞的EPO受體。參見，例如Masuda，S.，等，J Biol Chem，268，11208-16(1993)。可能，這些不同是由輔助蛋白引起的，并且可能表明其中所用到的信號(hào)傳導(dǎo)途徑不同于紅細(xì)胞成熟過程中活化的途徑。有趣的是，這種親和力上的不同不會(huì)被EPO的完全去糖基化所修飾，如果在正常的非糖基化的EPO的AB環(huán)域出現(xiàn)神經(jīng)活性結(jié)合的話，這就并非是一個(gè)意外的結(jié)果。此外，由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的EPO(可能是與其他細(xì)胞例如神經(jīng)元所產(chǎn)生的相同的產(chǎn)物)也比由腎所產(chǎn)生的要小。Masuda，S.，J.Bio Chem，269，19488-93(1994)。這種差異似乎是由糖基化程序的差異引起的。脫唾液酸的天然配體與這些已知受體蛋白的親和力是否有差異尚未確定，但是明顯是有關(guān)系的。
除了存在EPO受體修飾的輔助蛋白，EPO受體是一個(gè)復(fù)雜的基團(tuán)，存在多種改變形式，包括截短的可溶受體。Yamaji，R.，等.，Eur JBiochem，239，494-500；Yamaji，R.，等，Bichim Biophys Acta，1403，169-78(1998)；Barron，C.，等，Gene，147，263-8(1994)；Chin，K.，等，Brain ResMol Brain Res，81，29-42(2000)；Fujita，M.，等，Lukemia，11Suppl 3，444-5(1997)；Westenfelder，C.，Biddle，D.L.Baranowski，R&.L.，Kid.Internat.，55，808-820(1999).是否任何這樣的形式都促進(jìn)EPO的神經(jīng)活性仍然還沒被確定。
進(jìn)一步，如在背景技術(shù)中討論的那樣，O’Brien肽在體外表現(xiàn)出組織保護(hù)活性，但在體外卻沒有促紅細(xì)胞生成活性。事實(shí)上，對(duì)在O’Brien肽內(nèi)包含加入的糖鏈的EPO類似物進(jìn)行的分析表明該EPO類似物缺失組織保護(hù)功能。這一結(jié)果暗示對(duì)O’Brien肽的某種修飾，如增加糖鏈，影響了蛋白的功能。O’Brien肽修飾的EPO類似物可能扮演著對(duì)位于體內(nèi)的內(nèi)源性EPO的拮抗劑的作用，因?yàn)槠洳糠值幕蛉康淖钄鄡?nèi)源性EPO結(jié)合EPO受體的能力。因此，這樣的EPO類似物的使用有著導(dǎo)致由損傷引起的受傷程度增加的危險(xiǎn)。因此，在其它體外的檢測(cè)，例如大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元檢測(cè)，以及體內(nèi)檢測(cè)例如大鼠定點(diǎn)局部缺血檢測(cè)，荷包牡丹堿發(fā)作檢測(cè)，大鼠視網(wǎng)膜局部缺血檢測(cè)，和脊髓損傷檢測(cè)中，據(jù)信在O’Brien肽上修飾過的EPO類似物將會(huì)缺失組織保護(hù)能力。
受體介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用使用上述的相同EPO類似物，也就是具有5個(gè)N-連接的糖鏈的EPO類似物(相比于重組EPO的3個(gè)N-連接的糖鏈)，發(fā)明人研究了該類似物穿過血腦屏障的能力。在全身注射后(圖1和2)，EPO類似物出現(xiàn)在腦脊液中。不受任何特殊理論的限制，據(jù)信該EPO類似物可以穿過完整血腦屏障，因?yàn)樾纬裳X屏障的毛細(xì)血管也表達(dá)EPO受體，并且為從外周循環(huán)到腦部的由受體介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用提供了解剖學(xué)的基礎(chǔ)。這樣，其它全身施用的EPO類似物據(jù)信也能夠穿過血腦屏障，以及其它具有表達(dá)EPO受體的毛細(xì)血管的屏障。
總的說來，因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)中的EPO類似物在犧牲內(nèi)源性EPO的至少某些功能的情況下保持促紅細(xì)胞生成的活性，本領(lǐng)域需要一種長(zhǎng)效的EPO，其能夠保持內(nèi)源性EPO已知的全部功能。具有優(yōu)勢(shì)的，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO不僅增加了相對(duì)于重組EPO較長(zhǎng)的血清半衰期，而且保持了內(nèi)源性EPO的全部功能，即組織保護(hù)功能和胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)能力。下面的部分中提供了用于獲得此類有益蛋白質(zhì)的多種修飾EPO的方法。
天然EPO的修飾本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO可以用各種方法來制備?？偟恼f來，長(zhǎng)效EPO可以通過化學(xué)修飾連接在EPO上的糖鏈來獲得。這里，術(shù)語“糖鏈”是指存在于內(nèi)源性EPO上的N-連接和O-連接的寡糖鏈，存在于EPO類似物上的增加的N-連接和O-連接的寡糖鏈，和連接在EPO上的任何其他糖鏈，尤其是糖鏈(Sugar chains)。
在一個(gè)技術(shù)方案中，內(nèi)源性或重組EPO被修飾以阻止對(duì)內(nèi)源性EPO的組織保護(hù)能力的任何干擾。另外，根據(jù)本發(fā)明，考慮了對(duì)EPO類似物進(jìn)行修飾以提供額外的糖基化位點(diǎn)，其并不位于O’Brien肽，即30-47位的氨基酸序列附近。這里，術(shù)語“EPO類似物”是指被修飾的EPO分子，其具有至少1個(gè)增加的的N-連接的糖鏈和/或至少1個(gè)增加的O-連接的糖鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于修飾的EPO類似物在O’Brien肽的5個(gè)氨基酸內(nèi)不含有任何增加的糖基化位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該EPO類似物在O’Brien肽的3個(gè)氨基酸內(nèi)不含有任何增加的糖基化位點(diǎn)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該EPO類似物在O’Brien肽內(nèi)不含有任何增加的糖基化位點(diǎn)，EPO類似物也可以用于如本發(fā)明所述的修飾，前提是應(yīng)在三維空間上考慮該類似物并且確認(rèn)增加的糖鏈沒有阻礙到O’Brien肽或降低了組織保護(hù)能力。另一方面，考慮了將EPO類似物用于本發(fā)明的修飾，前提是糖基化方法不會(huì)抑制該肽的組織保護(hù)功能。在又一個(gè)方面，按照本發(fā)明提供的修飾方法修飾的EPO類似物，在O’Brien肽有一個(gè)糖鏈(或更少)。例如，內(nèi)源性EPO在38位氨基酸處有一個(gè)糖鏈，并且在O’Brien肽內(nèi)的額外的糖鏈已被證明抑制該蛋白的組織保護(hù)功能。因此，在O’Brien肽上有一個(gè)或沒有糖鏈的EPO類似物可以用于修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合在38位氨基酸處的糖鏈可以重新連接到該肽的其它位置。
根據(jù)本發(fā)明所述的修飾方法的非限制性實(shí)例包括(1)通過鄰位羥基的氧化作用在糖鏈上提供額外的酸性殘基；(2)用更穩(wěn)定的殘基取代唾液酸殘基；(3)通過硫酸化和/或磷酸化增加促紅細(xì)胞生成素的負(fù)電荷；和/或(4)用更復(fù)雜的分子終止糖鏈。因此，對(duì)EPO糖鏈的修飾可以包括氧化、硫酸化、磷酸化、和/或PEG化以及其它的步驟，它們將在后面詳細(xì)的描述，并且在實(shí)施例1中進(jìn)一步的舉例說明。
糖鏈的氧化和唾液酸殘基的取代化學(xué)修飾的本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO可以包括在EPO的糖鏈(糖)上氧化以提供額外的酸性殘基。一方面，可以用更穩(wěn)定的酸性殘基取代唾液酸殘基。這種類型的修飾相對(duì)于內(nèi)源性EPO而言導(dǎo)致了分子半衰期的增加，這是因?yàn)楦闻K篩選半乳糖鏈并將相關(guān)蛋白從循環(huán)系統(tǒng)中除去，而此時(shí)半乳糖鏈被保護(hù)起來使之不被檢測(cè)到。在EPO糖鏈上更顯著的修飾導(dǎo)致本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs的血清半衰期更多的延長(zhǎng)。例如，當(dāng)更多的鄰位羥基被酸取代后，導(dǎo)致了血清半衰期更多的延長(zhǎng)。
盡管本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道幾種合適的用于改變促紅細(xì)胞生成素的半乳糖單元的方法，一種合適的方法包括(1)將具有鄰位羥基的糖分子用高碘酸鹽氧化成醛；和(2)將醛氧化成酸。適合將糖鏈氧化成醛的試劑對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員來說是熟知的，包括但不限于，高碘酸鹽，如高碘酸鈉，和糖氧化酶，如半乳糖酶。另外，技術(shù)人員知道合適的試劑來轉(zhuǎn)化醛，如定量本尼迪特試劑(Kuantitative Benedict Solution)(可以從Fisher購(gòu)得)。另一方面，糖分子可以被高碘酸鈉氧化，進(jìn)一步用定量本尼迪特試劑(Fisher)處理將醛轉(zhuǎn)化成酸。
另一方面，EPO異構(gòu)體EPO，其具有約0-13個(gè)唾液酸殘基，或EPO類似物，其至少一條糖鏈缺失唾液酸殘基，被半乳糖醇氧化。脫唾液酸形式的EPO可以用于本發(fā)明的這一方面，即所有單個(gè)酸從糖鏈的末端去除的α或β形式的EPO。優(yōu)選的使用脫唾液酸的促紅細(xì)胞生成素。一旦EPO被氧化，使用其他的氧化劑如定量本尼迪特試劑將醛轉(zhuǎn)化成酸。
再一方面，四氧化釕可以用來生成糖鏈上的酸。由于該系統(tǒng)修飾了半乳糖鏈，即使涉及的得到的酸從EPO分子中被除去，該分子應(yīng)該仍然能夠躲避肝臟的清除，因?yàn)楦闻K所篩查的成分半乳糖鏈不再存在。
增加負(fù)電荷本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO可以通過在EPO分子上添加硫酸鹽和/或磷酸鹽來制備，它將會(huì)增加分子的負(fù)電荷，從而增加分子的半衰期。也就是說，EPO分子的負(fù)電荷可以通過硫酸化來增加，其涉及了從硫酸鹽供體來轉(zhuǎn)移磺基。并且，還可以通過將磷酸基團(tuán)引入到糖中來增加負(fù)電荷。
一種合適的用于硫酸化胰島素的方法描述在S.Pongor等，Preparation of High-Potency，Non-aggregating Insulins Using a NovelSulfation Procedure，Diabetes，Vol.32，No.12，December 1983。例如，胰島素的硫酸化可以在有機(jī)溶劑中，如二甲基甲酰胺(DMF)，在縮合劑存在的情況下，如N，N’-二環(huán)己基二亞胺(DCC)，和硫酸鹽供體進(jìn)行。硫酸化的程度可以通過改變縮合劑的量來控制在8倍范圍內(nèi)。盡管傳統(tǒng)制備的硫酸化的胰島素導(dǎo)致其喪失了胰島素的主要生物活性，使用Ponger程序制備的硫酸化胰島素的生物活性在未被修飾胰島素的78％到87％之間。
類似的步驟用于EPO，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以控制硫酸化的量從而控制化學(xué)修飾的EPO的血清半衰期。例如，可以通過將EPO或EPO類似物溶解在至少一種水溶性碳二亞胺優(yōu)選為DCC之中，溫度約為4℃，而將硫酸加入到蛋白質(zhì)中，從而增加EPO的負(fù)電荷。DCC是優(yōu)選的硫酸鹽供體，本領(lǐng)域的技術(shù)人員易知其它的用于本發(fā)明合適的硫酸鹽供體。
相似的步驟可用于控制EPO的磷酸化，使用磷酸(H3PO4)作為磷酸供體。還有，雖然優(yōu)選磷酸，但技術(shù)人員能夠容易的選擇其它的磷酸供體來對(duì)EPO磷酸化。
糖鏈末端使用PEGs終止EPO的糖鏈也可以通過增加至少一種聚乙二醇(PEG)來修飾，其具有悠久的安全的臨床歷史，分子式如下 PEG也可以是甲氧基化PEG(mPEG)，具有如下的分子式 在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG是氨基PEG，優(yōu)選在甲基化PEG的末端具有伯氨基團(tuán)(mPEG-NH2)。末端具有伯氨基團(tuán)的PEG鏈?zhǔn)欠浅Ｓ杏玫墓δ芑嗑畚?。mPEG-NH2氨基端的基團(tuán)比一般PEGs的羥基更傾向于發(fā)生?；磻?yīng)，并且它們也容易發(fā)生氨基還原反應(yīng)(reductiveamination reactions)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PEG是親電子活化的PEG，如mPEG-琥珀酸丙酯(mPEG-SPA)或mPEG-琥珀酸丁酯(mPEG-SBA)，它們都可以從Nektar Therapeutics of Birmingham，Alabama公司購(gòu)得。在又一個(gè)實(shí)施方案中，PEG是甲氧基化的PEG-酰肼。
另一方面，可以通過高碘酸鹽(上述討論的)的氧化作用，隨后使用氰基硼氫化物和氨基PEG來增加至少一個(gè)PEG。例如，溶液中的EPO首先用高碘酸鹽氧化，如高碘酸鈉，在室溫下反應(yīng)預(yù)先設(shè)定的一段時(shí)間，在糖鏈上產(chǎn)生醛。一種合適的高碘酸鹽是間高碘酸鈉，可以從Sigma公司購(gòu)得。高碘酸鹽然后被緩沖交換去除，與此同時(shí)，EPO的N-連接的寡糖鏈上的氧化的唾液酸基團(tuán)可在氰基硼氫化物存在的情況下至少與一個(gè)氨基PEG接觸。可用的適合的PEG包括但不限于，甲氧基化PEG-酰肼，其可以從Nektar Therapeutics ofBirmingham，Alabama公司購(gòu)得。
另一方面，在用半乳糖酶氧化后，可以通過將PEG基團(tuán)連接到末端的半乳糖殘基來增加至少一個(gè)PEG。例如，緩沖液中的脫唾液酸形式的EPO(暴露了末端的半乳糖殘基)首先與半乳糖氧化酶(從Sigma公司購(gòu)得)接觸以在糖鏈中產(chǎn)生醛。然后通過緩沖交換去除緩沖液，同時(shí)，在有氰基硼氫化物存在的情況下將氧化的半乳糖殘基與至少一種氨基PEG接觸。
上面所述的方法并不是限制性的，其它的方法也可以用于制備本發(fā)明的化合物。例如，技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到可以將這些化學(xué)修飾用于制造其它EPO衍生物的長(zhǎng)效形式如在國(guó)際公開號(hào)WO/02053580和美國(guó)專利公開號(hào)2002/0086816和2003/0072737中公開的組織保護(hù)細(xì)胞因子，在此整體引入本發(fā)明作為參考。
制備EPO分子各種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可以用于生產(chǎn)EPO，以制備本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO分子。此類宿主表達(dá)載體代表了一類載體(vehicle)，通過這些載體，感興趣的EPO得以生產(chǎn)出來并隨后被純化；也代表了一類細(xì)胞，當(dāng)所述細(xì)胞被適當(dāng)?shù)暮塑账峋幋a序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)，可以原位表達(dá)經(jīng)修飾的促紅細(xì)胞生成素基因產(chǎn)物。這些包括但不限于，細(xì)菌，昆蟲，植物，哺乳動(dòng)物宿主系統(tǒng)，例如但不限于，用含有編碼長(zhǎng)效EPO產(chǎn)物的序列的重組病毒表達(dá)載體(如棒狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞體系；用含有編碼促紅細(xì)胞生成素相關(guān)分子的序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化或重組病毒表達(dá)載體(如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系，包括人類細(xì)胞體系，如HT1080，COS，CHO，BHK，293，3T3，其中含有重組表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體中含有來源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子，如金屬硫蛋白啟動(dòng)子，或來源于哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子，如腺病毒晚期啟動(dòng)子，牛痘病毒7.5K啟動(dòng)子。
另外，選擇的宿主細(xì)胞株可以調(diào)控插入序列的表達(dá)，或以期望的特有方式修飾和加工基因產(chǎn)物。蛋白產(chǎn)物的這樣的修飾和加工，對(duì)于蛋白的功能而言可能是非常重要的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道不同的宿主細(xì)胞具有特定的蛋白和基因產(chǎn)物翻譯后加工和修飾的機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主體系以保證對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行正確的加工和修飾。在這一點(diǎn)上，具有用于初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的正確加工，基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞可以使用。這樣的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括人類宿主細(xì)胞，其包括但不限于HT1080，CHO，VERO，BHK，HeLa，COS，MDCK，293，3T3，和WI38。
為了長(zhǎng)期、高產(chǎn)量的產(chǎn)生重組蛋白，優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)體系。例如，可以工程化穩(wěn)定表達(dá)重組的EPO分子的基因產(chǎn)物的細(xì)胞系。不使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，宿主細(xì)胞可以用被合適的表達(dá)調(diào)控元件所控制，如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，序列，轉(zhuǎn)錄終止子，多聚腺苷酸位點(diǎn)等的DNA，以及選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化。引入外源DNA之后，工程化的細(xì)胞可以在營(yíng)養(yǎng)豐富的的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1到2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記使之具有選擇抗性，并且允許將質(zhì)粒穩(wěn)定的整合到細(xì)胞的染色體中，并生長(zhǎng)成點(diǎn)(foci)，其隨后可被克隆被擴(kuò)增到細(xì)胞系中。這種方法可有利地被用于工程化表達(dá)EPO突變蛋白相關(guān)分子的基因產(chǎn)物的細(xì)胞系。這樣的工程化細(xì)胞系在篩選和評(píng)價(jià)那些影響EPO相關(guān)分子基因產(chǎn)物的內(nèi)源性活性的化合物中可能是特別有用的。
或者，細(xì)胞系或微生物中內(nèi)源性EPO突變蛋白基因的表達(dá)特征可以通過在穩(wěn)定細(xì)胞系或克隆微生物基因組中插入異源DNA調(diào)控單元以至于插入的調(diào)控單元有效的連接在內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素突變蛋白的基因上而被修飾。例如，內(nèi)源性EPO突變蛋白基因其通常是“轉(zhuǎn)錄沉默的”，即通常不表達(dá)EPO基因，或在細(xì)胞系中表達(dá)的水平非常低，其可以通過在所述細(xì)胞系或微生物中插入能夠促進(jìn)基因產(chǎn)物表達(dá)的調(diào)控序列?；蛘?，可以通過插入能在多種細(xì)胞類型中起作用的混合調(diào)控單元來激活轉(zhuǎn)錄沉默的內(nèi)源性EPO基因。
異源調(diào)控單元可以插入到穩(wěn)定的細(xì)胞系或克隆微生物中，使之能夠有效的連接到內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素蛋白的基因上，使用的技術(shù)，如靶向同源重組，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，并且在法國(guó)專利號(hào)2646438，美國(guó)專利號(hào)4,215,051和5,578,461，和國(guó)際公開號(hào)WO93/09222和WO91/06667中有描述，其公開的內(nèi)容在此整體引入。
藥物組合物本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO的藥物組合物。因?yàn)楸景l(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs有利的具有促紅細(xì)胞生成活性以及組織保護(hù)能力和胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)能力，預(yù)期它們可以治療同時(shí)也有各種組織損傷的危險(xiǎn)如中風(fēng)和心急梗塞的個(gè)體的貧血及相關(guān)疾病。另外，預(yù)期本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs可用于治療同時(shí)也經(jīng)歷了精神系統(tǒng)惡化如老年性癡呆、帕金森等疾病的個(gè)體的貧血和相關(guān)疾病。進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs可以用來治療遭受了由正常老化過程產(chǎn)生的病況(如導(dǎo)致跌倒的平衡問題、容易挫傷等)的個(gè)體的貧血。還有，本發(fā)明涉及本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs作為其它分子載體的應(yīng)用，其中所述分子難于穿透具有EPO受體的毛細(xì)血管的屏障。
例如，前述任何的長(zhǎng)效EPOs可以被包含在本發(fā)明所述的藥物組合物中。另外，各種形式的EPO類似物可以被包含在本發(fā)明所述的藥物組合物中，并與至少一種組織保護(hù)性細(xì)胞因子混合，后者將在后面詳細(xì)的討論。
本發(fā)明所述的藥物組合物含有治療有效量的長(zhǎng)效EPO，優(yōu)選為以純化的形式存在。制劑應(yīng)當(dāng)與給藥模式相適應(yīng)。制成便于施用的形式。換句話說，本發(fā)明所述的藥物組合物包含一定量的本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO，從而使得在使用了正確的劑量和策略的情況下，其靶向的病況可以被治療。并且，后面將詳細(xì)討論，藥物組合應(yīng)當(dāng)以非毒性劑量施用。
本發(fā)明所述的藥物組合物可以含有治療有效量的長(zhǎng)效EPO化合物和合適量的藥學(xué)上可接受的載體，以便提供能夠正確向患者給藥的形式。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指經(jīng)聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或列在美國(guó)藥典或其它公認(rèn)的用于哺乳動(dòng)物，尤其是人的外國(guó)藥典上的。術(shù)語“載體”是指與治療劑一同施用的稀釋劑，佐劑，賦形劑或藥載體。這樣的藥物載體可以是無菌液體，如水和油的鹽溶液，包括石油，動(dòng)物，植物或合成的來源的，如花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。當(dāng)藥物組合物靜脈施用時(shí)，鹽溶液是優(yōu)選的載體。鹽溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可以作為液體載體，特別是作為注射用溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，凝膠，麥芽，大米，面粉，白堊，硅膠，硬脂酸鈉，單硬脂酸甘油，滑石，氯化鈉，干粉脫脂牛奶，甘油，丙二醇，水，乙醇等。
本發(fā)明所述的藥物組合物也可以含有少量的潤(rùn)滑劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以制成溶液，懸浮液，乳化液，片劑，丸劑，膠囊，粉劑，緩釋劑等形式。
本發(fā)明所述的組合物可以制成中性或鹽的形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括那些與自由氨基形成的鹽，如來源于鹽酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的鹽，以及那些與自由羧基生成的鹽，如那些來源于鈉，鉀，銨，鈣，氫氧化鐵，異丙基胺，三乙基胺，2-乙胺乙醇，組氨酸，普魯卡因等的鹽。
含有長(zhǎng)效EPO的組合物如前所述，任何本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO可用于藥物組合物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，由鄰位羥基氧化而產(chǎn)生的長(zhǎng)效EPO包含在本發(fā)明所述的藥物組合物中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的藥物組合物包含至少一種長(zhǎng)效EPO，其是用更穩(wěn)定的殘基取代唾液酸殘基產(chǎn)生的。在又一個(gè)實(shí)施方案中，包含在藥物組合物中的長(zhǎng)效EPO是通過硫酸化和/或磷酸化增加EPO的負(fù)電荷而得到的。在再一個(gè)實(shí)施方案中，包含在本發(fā)明所述的藥物組合物中的長(zhǎng)效EPO是通過用更復(fù)雜的分子如PEG鏈終止糖鏈而產(chǎn)生的，。
另外，本發(fā)明涉及用本發(fā)明所述任何方法產(chǎn)生的長(zhǎng)效EPOs的混合物在本發(fā)明所述的藥物組合物中的用途。例如，本發(fā)明所述的藥物組合物可以包含至少一種用更穩(wěn)定的殘基取代唾液酸而形成的長(zhǎng)效EPO，和至少一種通過硫酸化和/或磷酸化增加EPO的負(fù)電荷而形成的長(zhǎng)效EPO。
轉(zhuǎn)運(yùn)體系如前所述，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs有利地能夠跨越具有EPO受體的毛細(xì)血管的屏障。因此，本發(fā)明的在另一個(gè)實(shí)施方案中是轉(zhuǎn)運(yùn)體系，其使用本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs作為一些分子的載體，這些分子進(jìn)入體內(nèi)含有EPO受體的靶向區(qū)域的屏障穿透能力較低。這樣的轉(zhuǎn)運(yùn)體系優(yōu)先有利地提供了一種新的安全的跨越完整屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs和至少一種腦部穿透能力較低的分子，提供了一種新的安全的穿越完整血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)方法。即，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs讓那些腦部穿透能力低的分子扮演了分子“特洛伊木馬”的角色，從而增強(qiáng)了腦部攝取小分子或大分子的診斷劑或治療分子的能力。
事實(shí)上，在治療人類腦部腫瘤中的一個(gè)重要問題來源于需要將治療劑傳送到腦部的特定區(qū)域，將其分布在腦部腫瘤其中并且靶向作用于腦部腫瘤。在其它情況下可能在診斷和治療中有效的分子，或是不能以足夠量穿過腦部緊鄰腫瘤的血腦屏障(BBB)，或是不能以足夠量穿過血瘤屏障(BTB)。因此，需要新的傳送策略，其專門針對(duì)腦部并且能穿過脈管系統(tǒng)。例如，用于診斷或治療的抗體分子，由于它們的大小而不能以足夠量穿過BTB。因此，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs可以作為載體，使這些分子穿越BBB或BTB。一個(gè)可與本發(fā)明所述長(zhǎng)效EPOs一起使用的分子的例子是反義寡核苷酸，其典型的用于抑制致癌基因信號(hào)或?qū)δX部基因的體內(nèi)表達(dá)進(jìn)行成像。另外，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs可以包含在各種基因治療劑中(病毒的或非病毒的制劑)，這些治療劑通常太大以致于在沒有輔助的情況下不能穿過BTB。
進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs可以用作各種化療劑的載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)者。因?yàn)楸磉_(dá)在BBB和BTB上的藥物活性流出(efflux)轉(zhuǎn)運(yùn)者活躍地將化療劑從腦部流回到血內(nèi)，這些試劑在腦部的分布可能被抑制或阻止。部分地由于這些原因，大部分傳統(tǒng)的用來治療位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)外的癌癥的化療分子對(duì)于腦部腫瘤的治療不起作用。因此，使用本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO作為這些化療劑的載體，不僅在把試劑傳送到腦部方面是有用的，而且還可用于將試劑保持在腦部用于治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該長(zhǎng)效EPO可以與藥物一起使用，所述藥物抑制活性流出轉(zhuǎn)運(yùn)者，以進(jìn)一步的確保吸收這些通常從腦部回流到血液的化療劑。
另外，本發(fā)明也包括修飾過的EPO作為一些分子的載體的應(yīng)用，這些分子在體內(nèi)表達(dá)EPO受體的其它區(qū)域具有低的穿透性。此類細(xì)胞的非限制性的例子包括視網(wǎng)膜、肌肉、心臟、肺、肝、腎、小腸、腎上腺皮質(zhì)、腎上腺髓質(zhì)、毛細(xì)血管內(nèi)皮、睪丸、卵巢、胰腺、骨、皮膚和子宮內(nèi)膜細(xì)胞。特別的，應(yīng)答細(xì)胞包括但不限于，神經(jīng)元細(xì)胞；視網(wǎng)膜細(xì)胞光受體細(xì)胞(視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞)；神經(jīng)結(jié)，雙極細(xì)胞，水平細(xì)胞，無長(zhǎng)突細(xì)胞和Müeller細(xì)胞；肌肉細(xì)胞；心臟細(xì)胞心肌細(xì)胞，起搏細(xì)胞，竇房結(jié)細(xì)胞，竇結(jié)細(xì)胞，和連接組織(房室結(jié)與his束)細(xì)胞；肺細(xì)胞；肝臟細(xì)胞肝細(xì)胞，星型細(xì)胞，和Kupffer細(xì)胞；腎臟細(xì)胞腎小球，腎上皮細(xì)胞，和腎小管間質(zhì)細(xì)胞；小腸細(xì)胞杯形細(xì)胞，腸腺(隱窩)和腸內(nèi)分泌細(xì)胞；腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞腎小球細(xì)胞，束狀細(xì)胞，和網(wǎng)狀細(xì)胞；腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞嗜鉻細(xì)胞；毛細(xì)血管細(xì)胞足細(xì)胞；睪丸細(xì)胞Leydig細(xì)胞，Sertoli細(xì)胞，和精子細(xì)胞及其前體細(xì)胞；卵巢細(xì)胞Graffian卵泡和原始卵泡細(xì)胞；胰腺細(xì)胞Langerhans胰島細(xì)胞，α-細(xì)胞，β-細(xì)胞，γ-細(xì)胞，和F-細(xì)胞；骨細(xì)胞骨原細(xì)胞，破骨細(xì)胞，和成骨細(xì)胞；皮膚細(xì)胞；子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)膜基質(zhì)和內(nèi)膜細(xì)胞；和存在于上述器官中的干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
混合了EPO類似物和組織保護(hù)細(xì)胞因子的組合物如前所述，本發(fā)明所屬的藥物組合物可以包含具有至少一個(gè)增加的N-連接的糖鏈和/或至少一個(gè)O-連接的糖鏈的EPO類似物(表現(xiàn)出延長(zhǎng)的血清半衰期但缺失組織保護(hù)活性)與至少一種組織保護(hù)細(xì)胞因子的混合。例如，具有至少2個(gè)增加的N-連接的糖鏈的EPO類似物，其中一條糖鏈位于O’Brien肽上，與組織保護(hù)細(xì)胞因子一起，可以形成本發(fā)明所述的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的藥物組合物可以包含至少一種組織保護(hù)細(xì)胞因子和至少一種含有額外糖鏈的EPO，其中通過在三維空間中考慮該類似物，已知所述糖鏈阻斷了O’Brien肽序列。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的藥物組合物包含至少一種組織保護(hù)細(xì)胞因子和至少一種EPO類似物，所述EPO類似物由于采用了向蛋白質(zhì)中增加額外糖鏈的方法而導(dǎo)致其不具有組織保護(hù)功能。
具有重新定位的糖基化位點(diǎn)的EPO類似物預(yù)期可以用在本發(fā)明所述的藥物組合物中。不受限于任何特別的理論，據(jù)信如果在38位氨基酸處天然生成的糖基化位點(diǎn)被重定位于EPO類似物30-47位氨基酸片斷之外的其它位點(diǎn)，那么EPO類似物的組織保護(hù)能力相比于在38位具有糖基化位點(diǎn)的EPO類似物將會(huì)增強(qiáng)。因此，本發(fā)明所述的藥物組合物可以包含將38位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)重定位在分子其它位點(diǎn)的EPO類似物。重定位的糖基化位點(diǎn)可能發(fā)生在51，57，69，88，89，136或138位上，如在PCT公開號(hào)WO01/81405中指出的那樣。在一個(gè)實(shí)施方案中，O’Brien肽序列含有1個(gè)或更少的糖鏈。
用于本發(fā)明這方面的合適的組織保護(hù)細(xì)胞因子優(yōu)選那些缺失對(duì)骨髓的作用但保持內(nèi)源性組織保護(hù)作用的細(xì)胞因子，但是任何具有組織保護(hù)能力的細(xì)胞因子也可以用于本發(fā)明。例如，合適的組織保護(hù)細(xì)胞因子包含由胍化作用，脒化作用，氨基甲?；?甲氨?；?作用，苦味酸化作用，酰化作用(乙?；蜱牾；?，硝化作用，或其組合方式進(jìn)行化學(xué)修飾而生成的EPOs。另外，至少一個(gè)精氨酸，賴氨酸，酪氨酸，色氨酸，半胱氨酸殘基或羥基基團(tuán)被修飾的EPO分子預(yù)期也可用作根據(jù)本發(fā)明該方面的組織保護(hù)細(xì)胞因子。
還有，另外用于本發(fā)明的另外的組織保護(hù)細(xì)胞因子可以通過有限的蛋白水解、去除氨基和/或以分子生物學(xué)技術(shù)引入突變?nèi)〈彼?、賴氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基而獲得，所述分子生物學(xué)技術(shù)在Satake等，1990，Biochim.Biophs.Acta 1038125-9中公開，在此整體引入。例如，合適的組織保護(hù)細(xì)胞因子包括至少一個(gè)或多個(gè)突變的EPO，所述EPO在C7S，R10I，V11S，L12A，E13A，R14A，R14B，R14E，R14Q，Y15A，Y15F，Y15I，K20A，K20E，E21A，C29S，C29Y，C33S，C33Y，P42N，T44I，K45A，K45D，V46A，N47A，F(xiàn)48A，F(xiàn)48I，Y49A，Y49S，W51F，W51N，Q59N，E62T，L67S，L70A，D96R，S100R，S100E，S100A，S100T，G101A，G101I，L102A，R103A，S104A，S104I，L105A，T106A，T106I，T107A，T107L，L108K，L108A，S126A，F(xiàn)142I，R143A，S146A，N147K，N147A，F(xiàn)148Y，L149A，R150A，G151A，K152A，L153A，L155A，C160S，I6A，C7A，B13A，N24K，A30N，H32T，N38K，N83K，P42A，D43A，K52A，K97A，K116A，T132A，I133A，T134A，K140A，P148A，R150B，G151A，K152W，K154A，G158A，C161A，和/或R162A上有點(diǎn)突變。上面所提到的修飾的實(shí)例在共同未決的美國(guó)專利公開號(hào)2003/0104998，2002/00861816和2003/0072737中進(jìn)行了描述，在此全文引入作為參考。在本文使用的突變蛋白命名法中，被改變的氨基酸采用如下方式描述首先是天然氨基酸的單字母代碼，緊跟的是它在EPO分子中的位置，隨后是替換氨基酸的單字母代碼。例如，S100E是指在人類EPO分子中，將100位處的絲氨酸替換為谷氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，組織保護(hù)細(xì)胞因子可以包含一個(gè)或多個(gè)上述點(diǎn)突變，前提是所述點(diǎn)突變不包括I6A，C7A，K20A，P42A，D43A，K45D，K45A，F(xiàn)48A，Y49A，K52A，K49A，S100B，R103A，K116A，T132A，I133A，K140A，N147K，N147A，R150A，R150E，G151A，K152A，K154A，G158A，C161A或R162A。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，組織保護(hù)細(xì)胞因子可以包含點(diǎn)突變的組合，如K45D/S100E，A30N/H32T，K45D/R150E，R103E/L108S，K140A/K52A，K140A/K52A/K45A，K97A/K152A，K97A/K152A/K45A，K97A/K152A/K45A/K52A，K97A/K152A/K45A/K52A/K140A，K97A/K152A/K45A/K52A/K140A/K154A，N24K/N38K/N83K，和N24K/Y15A。在再一個(gè)實(shí)施方案中，組織保護(hù)細(xì)胞因子不包括任一上述組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組織保護(hù)細(xì)胞因子可以包含上述點(diǎn)突變的任何一種，前提是所述點(diǎn)突變不包括任何下述突變組合N24K/N38K/N83K和/或A30N/H32T。
某些修飾或修飾組合可以影響突變蛋白與其受體如EPO受體或第二受體結(jié)合能力的靈活性。此類修飾或修飾組合的例子包括但不限于，K152W，R14A/Y15A，I6A，C7A，D43A，P42A，F(xiàn)48A，Y49A，T132A，I133A，T134A，N147A，P148A，R150A，G151A，G158A，C161A，和R162A。對(duì)人類生長(zhǎng)激素有害的相關(guān)突變對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，組織保護(hù)細(xì)胞因子不包含那些可能影響突變蛋白與其受體結(jié)合能力的靈活性的一種或多種修飾或修飾組合。對(duì)這樣的組織保護(hù)細(xì)胞因子的進(jìn)一步的討論包含在共同未決的美國(guó)申請(qǐng)No.10/612,665，申請(qǐng)日為2003年7月1日，名稱為“Recombinant Tissue Protective Cytokines and Encoding NucleicAcid Thereof for Protection，Restoration，and Enhancement ofResponsive Cells，Tissues，and Organs”的美國(guó)專利申請(qǐng)，其全部公開的內(nèi)容引入這里作為參考。
最后，具有組織保護(hù)能力的任何細(xì)胞因子超家族都可以使用，只要其不影響長(zhǎng)效EPO的促紅細(xì)胞生成活性或血清半衰期。實(shí)例包括但不限于，白介素-3(IL-3)，白介素-5(IL-5)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)，色素上皮衍生因子(PEDF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。
本發(fā)明的在另一個(gè)方面中，本發(fā)明所述的藥物組合物包含具有至少一個(gè)增加的N-連接的糖鏈和/或至少一個(gè)增加的O-連接的糖鏈的EPO類似物(具有延長(zhǎng)的血清半衰期但缺乏組織保護(hù)活性)與至少一種具有組織保護(hù)功能的小分子的混合。合適的小分子包括但不限于，類固醇(例如拉扎堿類和糖皮質(zhì)激素)，抗氧化劑(例如輔酶Q10，α硫辛酸，和NADH)，抗分解酶(anticatabolic enzyme)(例如谷胱甘肽過氧化物酶，超氧化物歧化酶，過氧化氫酶，合成催化凈化劑，和模仿劑)，吲哚衍生物(例如吲哚胺，咔唑，和咔啉)，硝酸中和劑，腺苷/腺苷激動(dòng)劑，植物化學(xué)劑(黃烷類)，草藥提取物(銀杏和姜黃)，維生素(維生素A，E和C)，氧化酶電子受體抑制劑(例如氧雜蒽氧化酶電子受體抑制劑)，礦物(例如銅，鋅，和鎂)，NSAIDS(例如乙酰水楊酸，甲氧萘丙酸，和異丁苯丙酸)，和它們的組合。另外，本發(fā)明所述的藥物組合物含有EPO類似物、組織保護(hù)細(xì)胞因子、和具有組織保護(hù)活性的小分子。
存在于本發(fā)明所述的藥物組合物中的組織保護(hù)細(xì)胞因子和/或小分子的量?jī)?yōu)選足夠保持或超過由內(nèi)源性EPO在神經(jīng)或其它應(yīng)答細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，組織保護(hù)細(xì)胞因子和/或小分子的量足以增強(qiáng)個(gè)體的組織保護(hù)能力，這是通過保護(hù)，維持，或增強(qiáng)促紅細(xì)胞生成應(yīng)答細(xì)胞的存活力和功能實(shí)現(xiàn)的。例如，本發(fā)明該方面中所述的藥物組合物優(yōu)選含有有效、非毒性量的組織保護(hù)細(xì)胞因子，例如約1ng或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，存在于本發(fā)明所述的藥物組合物中的組織保護(hù)細(xì)胞因子的量大約是5mg或更少。在另一個(gè)實(shí)施方案中，存在于本發(fā)明所述的藥物組合物中組織保護(hù)細(xì)胞因子的量大約是500ng到5mg。在又一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物含有約1μg到5mg的組織保護(hù)細(xì)胞因子，優(yōu)選含有約500μg到5mg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，存在于本發(fā)明所述的藥物組合物中的組織保護(hù)細(xì)胞因子的量更大，約為1mg到5mg。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知，給患者施用的藥物組合物的劑量取決于以下因素，但不限于，患者的身體狀況和服藥的頻率。關(guān)于服藥的劑量將在后面詳細(xì)的討論。
治療和給藥方法前面提到的長(zhǎng)效EPOs和含有長(zhǎng)效EPOs的藥物組合物，預(yù)期可以用于貧血、涉及貧血或貧血癥狀的人類疾病、或?qū)е仑氀募膊』蛑委煼椒ǖ闹委熜曰蝾A(yù)防性處理。通常，在不危害患者從其它組織損傷中康復(fù)的能力的情況下，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs可以允許頻率更低的給藥或使用更少劑量的促紅細(xì)胞生成素來治療上述的疾病，特別是其它EPO應(yīng)答細(xì)胞、組織、或器官的損傷。所述EPO應(yīng)答細(xì)胞的非限定性實(shí)例包括視網(wǎng)膜、肌肉、心臟、肺、肝、腎、小腸、腎上腺皮質(zhì)、腎上腺髓質(zhì)、毛細(xì)血管內(nèi)皮、睪丸、卵巢、胰腺、骨、皮膚和子宮內(nèi)膜細(xì)胞。特別的，應(yīng)答細(xì)胞包括但不限于，神經(jīng)元細(xì)胞；視網(wǎng)膜細(xì)胞光受體細(xì)胞(視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞)；神經(jīng)結(jié)，雙極細(xì)胞，水平細(xì)胞，無長(zhǎng)突細(xì)胞和Müeller細(xì)胞；肌肉細(xì)胞；心臟細(xì)胞心肌細(xì)胞，起搏細(xì)胞，竇房結(jié)細(xì)胞，竇結(jié)細(xì)胞，和連接組織(房室結(jié)與his束)細(xì)胞；肺細(xì)胞；肝臟細(xì)胞肝細(xì)胞，星型細(xì)胞，和Kupffer細(xì)胞；腎臟細(xì)胞腎小球系膜，腎上皮細(xì)胞，和腎小管間質(zhì)細(xì)胞；小腸細(xì)胞杯形細(xì)胞，腸腺(隱窩)和腸內(nèi)分泌細(xì)胞；腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞腎小球細(xì)胞，束狀細(xì)胞，和網(wǎng)狀細(xì)胞；腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞嗜鉻細(xì)胞；毛細(xì)血管細(xì)胞足細(xì)胞；睪丸細(xì)胞Leydig細(xì)胞，Sertoli細(xì)胞，和精子細(xì)胞及其前體細(xì)胞；卵巢細(xì)胞Graffian卵泡和原始卵泡細(xì)胞；胰腺細(xì)胞Langerhans胰島細(xì)胞，α-細(xì)胞，β-細(xì)胞，γ-細(xì)胞，和F-細(xì)胞；骨細(xì)胞骨原細(xì)胞，破骨細(xì)胞，和成骨細(xì)胞；皮膚細(xì)胞；子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)膜基質(zhì)和內(nèi)膜細(xì)胞；和存在于上述器官中的干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。易患中風(fēng)、脊髓損傷、外周神經(jīng)損傷、糖尿病神經(jīng)病、視網(wǎng)膜病，包括但不限于黃斑水腫、糖尿病腎病等的個(gè)體也可以從使用長(zhǎng)效EPO獲益。長(zhǎng)效EPO的其它疾病和組織保護(hù)作用討論于2002年7月3日提交的共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/188,905和2003年7月1日提交的申請(qǐng)序列號(hào)No.10/612,665，在此全文引入作為參考。
本發(fā)明預(yù)期該長(zhǎng)效EPOs可以用于全身或慢性施用，急性治療和/或間斷性施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的藥物組合物可以慢性的施用以保護(hù)或增強(qiáng)靶細(xì)胞、組織或器官。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的藥物組合物可以急性的施用，即在損傷期間的單一治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的藥物組合物可以循環(huán)的方式施用。
該組合物的施用可以是非腸胃的，例如，通過靜脈注射，腹腔注射，動(dòng)脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮內(nèi)，或皮下施用；通過吸入；跨粘膜，例如，口服，鼻腔，直腸，陰道內(nèi)，舌下，粘膜下層，和經(jīng)皮；或其組合方式施用。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的藥物組合物的施用方式是非腸胃的。這樣的施用方式的劑量約為0.01pg到約5mg，優(yōu)選約1pg到約5mg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，劑量約為500pg到約5mg。在又一個(gè)實(shí)施方案中，劑量約為500ng到約5mg。在再一個(gè)實(shí)施方案中，劑量約為1μg到約5mg。例如，劑量可以為約500μg到約5mg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，劑量可以是約1mg到約5mg。
適用于非腸胃給藥的本發(fā)明所述的藥物組合物含有水性或非水性無菌注射溶液或懸浮液，其可以包含抗氧化劑，緩沖劑，細(xì)菌抑制劑和溶質(zhì)，所述溶質(zhì)使該組合物基本與受試體的血液等滲。在本發(fā)明的這方面，該藥物組合物也可以含有水、乙醇、多羥基化合物、甘油、植物油、及其混合物。適用于非腸胃給藥的藥物組合物可以存在于單位劑量或多劑量的容器中，例如，密封的安瓿和小瓶，并且可以凍干(冷凍干燥)保存，在這種情況下只需在馬上就要使用之前加入無菌液體載體，例如注射用的無菌鹽溶液。臨時(shí)用注射液和懸浮液可以配制成無菌粉末，顆粒和片劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs注射液的自動(dòng)注射器，可以用在救護(hù)車、應(yīng)急室和戰(zhàn)場(chǎng)的情況下緊急使用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的組合物可以根據(jù)常規(guī)的步驟制成適合給人靜脈施用的藥物組合物。例如，該藥物組合物可以作成無菌等滲水性緩沖溶液。如果需要，該藥物組合物也可以含有增溶劑和/或局部麻醉劑如利多卡因，用于減輕注射位點(diǎn)處產(chǎn)生的疼痛。所述成分可以單獨(dú)或混合在一起以單位劑量形式提供，如以凍干粉或無水濃縮物的形式存在于密封的容器內(nèi)，如標(biāo)有活性成分用量的安瓿或小藥囊。當(dāng)通過灌輸?shù)男问绞┯帽景l(fā)明所述的藥物組合物時(shí)，含有無菌藥物級(jí)的水或鹽水溶液的輸液瓶可以用來分散藥物。并且，當(dāng)以注射的形式施用本發(fā)明所述的藥物組合物時(shí)，在施用前可以用含有無菌鹽溶液的安瓿來混合各成分。
適用于口服的藥物組合物可以以如下形式提供膠囊或片劑；粉劑或顆粒劑；溶液、糖漿或懸浮液(含水或不含水的液體)；可食用的泡沫(foams或whips)；乳化劑；或其組合?？诜苿┛梢园亓堪俜直燃s10％到約95％的活性成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，口服制劑中活性成分的重量百分比是約20％到約80％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，口服制劑中活性成分的重量百分比是約25％到約75％。
片劑或硬質(zhì)明膠膠囊可以含有乳糖、淀粉及其衍生物、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂、硬脂酸及其鹽。軟質(zhì)明膠膠囊含有蔬菜油、蠟、脂肪、半固體、液體多元醇、或其混合物。溶液和糖漿含有水、多元醇、糖、或其混合物。
此外，用于口服的活性劑可以用推遲活性劑在胃腸道內(nèi)崩解和/或吸收的材料進(jìn)行包衣或混合。例如，用單硬脂酸甘油、雙硬脂酸甘油、或其組合與活性劑混合或進(jìn)行包衣。因此，活性劑的持續(xù)釋放可以維持很多個(gè)小時(shí)，如果需要，可以阻止活性劑在胃內(nèi)的降解?？诜乃幬锝M合物可以根據(jù)特殊的pH或酶條件進(jìn)行配制，以助于在胃腸道的特定部位釋放活性劑。
適合于經(jīng)皮給藥的藥物組合物可以以不連續(xù)片(discrete patch)的方式提供，其可保持與受試者表皮緊密接觸較長(zhǎng)時(shí)間。另外，適合于局部給藥的藥物組合物可以以如下形式提供油膏劑、乳膏劑、懸浮劑、洗劑、粉劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑、油劑、滴眼劑、糖錠、軟錠劑、和漱口劑及其組合。當(dāng)局部給藥用于皮膚、口腔、眼睛、或其它的外部組織時(shí)，優(yōu)選使用局部油膏劑或乳膏劑。并且，當(dāng)存在于油膏劑中時(shí)，活性成分，即長(zhǎng)效EPO，可以與蠟或易與水混溶的油膏基質(zhì)一起使用。或者，使用水包油或油包水的基質(zhì)將活性成分制備為乳膏劑。當(dāng)局部給藥采用滴眼劑形式時(shí)，本發(fā)明所述的藥物組合物優(yōu)選含有溶解或懸浮在合適的載體例如水性溶劑中的活性劑。
適用于鼻腔和肺部給藥的藥物組合物可以含有固體載體，如粉末(優(yōu)選顆粒大小在約20到約500微米內(nèi)的)。粉末可以通過從靠近鼻子的含有粉末的容器中快速吸入鼻腔的方式來施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的用于鼻腔施用的藥物組合物含有液體載體，如噴鼻劑或滴鼻劑。優(yōu)選在鼻腔內(nèi)直接施用本發(fā)明所述的藥物組合物。
直接的肺部吸入可以通過伸入到咽喉的口腔插管和其它的特殊設(shè)計(jì)的裝置深吸來完成，所述裝置包括但不限于，壓力氣霧器、噴霧器、或噴灑器，其可經(jīng)專門設(shè)計(jì)以提供預(yù)定量的活性成分。優(yōu)選，藥物組合物通過直接深吸入咽喉的方式施用。
適合于直腸給藥的藥物組合物可以以栓劑或灌腸劑的形式提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的栓劑含有重量百分比為約0.5％到10％的活性成分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該栓劑含有重量百分比為約1％到約8％的活性成分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該栓劑含有的活性成分重量百分比為約2％到約6％。在本發(fā)明的這一方面，本發(fā)明所述的藥物組合物可以含有常用的粘合劑和載體，如甘油三酸脂。
適于陰道給藥的藥物組合物可以以如下形式提供陰道栓劑、棉塞劑、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑。
本發(fā)明所述的藥物組合物也可以以使用灌輸液、器官注射或局部給藥的方式來施用。在這些實(shí)施方式中，該藥物組合物優(yōu)選的含有約0.01pM到約30pM，優(yōu)選是約15pM到約30nM的本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO。在一個(gè)實(shí)施方案中，灌輸溶液是University of Wisconsin(UW)溶液(具有約7.4到約7.5的pH和約320mOSm/l的摩爾滲透壓濃度)，它含有約1U/ml到約25U/ml的EPO；5％的羥乙基淀粉(優(yōu)選具有分子量約從200,000到約300,000并且基本上不含乙二醇、2-氯乙醇、氯化鈉、和丙酮)，25mM KH2PO4、3mM谷胱甘肽；5mM腺苷；10mM葡萄糖；10mM HEPES緩沖液；5mM葡萄糖酸鎂；1.5mM CaCl2；105mM葡萄糖酸鈉；200,000單位的青霉素；40單位的胰島素；16mg的地塞米松；和12mg的酚紅。UW溶液在美國(guó)專利號(hào)4,798,824中有詳細(xì)的描述，在此全文引入作為參考。在另一個(gè)實(shí)施方案中，UW溶液可以含有約0.01pg/ml到約400ng/ml，優(yōu)選40ng/ml到約300ng/ml的重組組織保護(hù)細(xì)胞因子。
向需要治療的區(qū)域局部施用本發(fā)明所述的藥物組合物可能是令人期待的。這樣的給藥方式可以通過如下方式來實(shí)現(xiàn)在手術(shù)中局部灌輸；局部應(yīng)用，如手術(shù)后與傷口敷料一起應(yīng)用；通過注射；通過導(dǎo)管；通過栓劑；或通過植入的方式，所述的植入方式可以用帶孔的、無孔的、或膠質(zhì)材料，包括膜，如硅膠膜，或纖維。
另外，如前所述的關(guān)于經(jīng)皮施用的方式，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO可以由控釋體系來輸送。例如，使用靜脈灌輸、植入滲透泵、經(jīng)皮膜片、脂質(zhì)體、或其它的方式施用該肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用泵，如在Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574中描述的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用載體輸送該化合物，特別是脂質(zhì)體，如在國(guó)際公開號(hào)WO91/04014和美國(guó)專利號(hào)4,704,355中描述的那樣，在此將其整體引入?yún)⒖肌Ｔ诹硪粋€(gè)實(shí)施方案中，聚合物材料可以用于制備控釋體系，如那些在Howard等，1989，J.Neurosurg.71105中描述的材料。
這樣的控釋體系可以置于靠近治療目標(biāo)的地方，即靶細(xì)胞、組織或器官，因此只需要全身劑量的一部分。參見，例如，Goodson，MedicalApplications of Contolled Release，vol.2，pp.115-138，1984?？捎糜诒景l(fā)明的其它控釋體系在Langer，Science 2491527-1533，1990的綜述里有描述。
劑量基于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知常識(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以選擇適用于上述施用方法的優(yōu)選的有效和非毒性劑量。這些因素的實(shí)例包括長(zhǎng)效EPO的特殊形式；該EPO的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如生物利用度、新陳代謝、半衰期等(已提供給技術(shù)人員)；有待治療的情況或疾病；在普通個(gè)體中所取得的療效；患者的體重；給藥方法；給藥頻率，即慢性的、急性的、間斷的給藥；伴隨藥物；和其它已知的影響所施用的藥劑的有效性的因素。這樣，精確的劑量應(yīng)當(dāng)根據(jù)專業(yè)人員的判斷和特定患者的情況來確定。
例如，Physicians Desk Reference(PDR)表明了，依據(jù)使用EPO治療的患者群體，考慮不同的血細(xì)胞比容水平以避免毒性。PhysiciansDesk Reference，54thEd.，519-525和2125-2131(2000)。事實(shí)上，對(duì)患有CRF的患者，PDR推薦施用的EPO劑量是達(dá)到非毒性目標(biāo)血細(xì)胞比容30％到36％。相反，對(duì)于進(jìn)行化療的癌癥患者，PDR教導(dǎo)將劑量調(diào)節(jié)到不同的血細(xì)胞比容水平，也就是如果血細(xì)胞比容水平超過40％。PDR表明，專業(yè)人員在使用EPO治療期間監(jiān)控患者的血細(xì)胞比容，并且如果患者的血細(xì)胞比容達(dá)到或超過預(yù)定范圍的上限，則調(diào)整劑量和/或停止治療以避免毒性。因而，熟練的專業(yè)人員，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，應(yīng)該能夠使EPO的施用劑量足以達(dá)到治療的效果而又避免了任何的毒性并發(fā)癥。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO以劑量為每次約0.1μg/kg體重到約100μg/kg體重慢性或全身的施用。例如，在治療接受化療的癌癥患者時(shí)，以約1μg/kg體重到約5μg/kg體重的劑量每周施用一次。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該長(zhǎng)效EPO的劑量是每次約5μg/kg體重到約50μg/kg體重。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該長(zhǎng)效EPO的劑量是約10μg/kg體重到約30μg/kg體重。在再一個(gè)實(shí)施方案中，該長(zhǎng)效EPO的施用量約為1μg/kg體重或更少。例如，在每周給藥一次治療CRF患者的貧血時(shí)，約0.45μg/kg體重到約0.75μg/kg體重的長(zhǎng)效EPO可能是有效的。
有效的劑量?jī)?yōu)選足以獲得大于約10,000mU/ml(80ng/ml)的長(zhǎng)效EPO的血清水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，有效劑量能夠獲得約15,000mU/ml(120ng/ml)或更高的長(zhǎng)效EPO的血清水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，有效劑量能夠獲得約20,000mU/ml(160ng/ml)的長(zhǎng)效EPO的血清水平。最好在施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小時(shí)或其組合時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員認(rèn)為需要時(shí)，可以重復(fù)施用的劑量。例如，只要臨床需要，每天都可以重復(fù)給藥，或經(jīng)過一個(gè)適當(dāng)?shù)拈g歇后重復(fù)給藥，如每1到12周，優(yōu)選每1到3周。
由于本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs具有延長(zhǎng)的半衰期，因此它們?cè)隗w內(nèi)的活性也會(huì)增加。例如，當(dāng)哺乳動(dòng)物的病體進(jìn)行癌癥的全身性化療治療時(shí)，包括放療，在治療期間施用本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO藥物組合物可以減少貧血相關(guān)的癥狀，其施用的頻率和劑量都少于現(xiàn)有的重組EPO組合物。
并且，如前所述，當(dāng)本發(fā)明所述的藥物組合物含有本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO或EPO類似物與組織保護(hù)細(xì)胞因子的混合形式時(shí)，該組合物可以用于治療同時(shí)還有組織損傷危險(xiǎn)的患者的貧血及相關(guān)疾病。例如，患有貧血同時(shí)也是心臟病高危的患者，可以用本發(fā)明所述的組合物代替現(xiàn)有的EPO類似物來治療，以避免因治療而增加損害的風(fēng)險(xiǎn)。
治療試劑盒本發(fā)明同時(shí)也提供了一種藥物試劑包或盒，其含有用本發(fā)明所述的藥物組合物的一種或多種成分填充的一個(gè)或多個(gè)容器。在一個(gè)實(shí)施方案中，有效量的長(zhǎng)效EPO和藥學(xué)上可接受的載體可被包裝在單劑量瓶或其它容器中。
當(dāng)本發(fā)明所述的藥物組合物用于非腸胃給藥時(shí)，例如，可在凍干的條件下保藏該組合物。因此，試劑盒可以包括凍干組合物、無菌液體載體、和用于注射的注射器。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包括含有足夠用于幾次治療的凍干材料的安瓿，以便施用者可以稱出特定量的材料并且加入特定量的載體用于每次治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括多個(gè)安瓿，每個(gè)安瓿中都含有特定量的凍干材料，以及多個(gè)容器，每個(gè)容器中都含有特定量的載體，以便施用者只需將一個(gè)安瓿和一個(gè)載體容器的內(nèi)容物混合用于每次治療，而不用測(cè)定或稱量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包括自動(dòng)注射器，其含有本發(fā)明所述的EPO的注射用溶液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包括至少一個(gè)含有凍干組合物的安瓿、至少一個(gè)含有載體溶液的容器、至少一個(gè)含有局部麻醉劑的容器、和至少一個(gè)注射器(或類似物)。安瓿和容器優(yōu)選是密封的。
當(dāng)以灌輸?shù)姆绞绞┯帽景l(fā)明所述的藥物組合物時(shí)，該試劑盒優(yōu)選包括至少一個(gè)含有該藥物組合物的安瓿和至少一個(gè)含有無菌藥物級(jí)的水或鹽溶液的輸液瓶。
本發(fā)明所述的試劑盒也可以包括至少一個(gè)口腔插管或適用于直接肺部吸入的特別裝置如壓力氣霧器、噴霧器、或噴灑器。在本發(fā)明的這一方面，該試劑盒可以包括用于直接肺部吸入的裝置，其含有該藥物組合物，或該裝置和至少一個(gè)含有本發(fā)明所述長(zhǎng)效EPO的水或油溶液的安瓿。
當(dāng)本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO藥物組合物適合于口服、經(jīng)皮、直腸、陰道、或鼻腔給藥時(shí)，該試劑盒優(yōu)選包括至少一個(gè)含有活性成分的安瓿和至少一種給藥輔助物。給藥輔助物的例子包括但不限于，稱量勺(用于口服)、無菌清潔墊(用于經(jīng)皮給藥)、和鼻腔吸氣器(用于鼻腔給藥)。這樣的試劑盒可以含有單劑量的長(zhǎng)效EPO(急性治療)或多劑量的長(zhǎng)效EPO(慢性治療)。
另外，該試劑盒可以配備有一種或多種類型的溶液。例如，本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPO藥物組合物可以被制備在白蛋白溶液和聚山梨醇酯溶液中。如果試劑盒含有聚山梨醇酯溶液，“不含白蛋白”的字樣優(yōu)選出現(xiàn)在容器的標(biāo)簽上和試劑盒的主面板上。
另外，該試劑盒還包括管理藥物或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的形式的聲明，該聲明反映了上述機(jī)構(gòu)已經(jīng)批準(zhǔn)用于人體的生產(chǎn)、使用或銷售。
EPO檢測(cè)試驗(yàn)本發(fā)明也涉及用于確定本發(fā)明所述的長(zhǎng)效EPOs以及用在本發(fā)明所述的幾種藥物組合物中的EPO類似物的促紅細(xì)胞生成能力和組織保護(hù)能力的檢測(cè)方法。例如，長(zhǎng)效EPOs的促紅細(xì)胞生成活性可以使用TF-1分析來檢測(cè)，這將在實(shí)施例2中更詳細(xì)的描述。EPO化合物的組織保護(hù)活性可以使用體外和體內(nèi)分析來檢測(cè)，這將在后面更詳細(xì)的討論。另外，預(yù)期本發(fā)明也包括不僅能用于確定特定的EPO化合物是否具有組織保護(hù)活性，而且也能用于確定該EPO化合物是否作為內(nèi)源性EPO的拮抗物的檢測(cè)方法。
本發(fā)明所述的檢測(cè)方法優(yōu)選設(shè)計(jì)成在短時(shí)間內(nèi)使用最少量的EPO混合物來完成。還有，這里提供的檢測(cè)方法是非限制的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解到其它的用于檢測(cè)EPO化合物的促紅細(xì)胞生成活性和組織保護(hù)活性的方法。
促紅細(xì)胞生成活性檢測(cè)特定EPO化合物的促紅細(xì)胞生成特性，即控制血細(xì)胞比容水平的能力，可以通過多種檢測(cè)方法確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，TF1細(xì)胞系可以用于確定EPO化合物是否具有促紅細(xì)胞生成活性。該細(xì)胞可以被沉淀、沖洗、和重懸在濃度為1毫升105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液中，添加有一定濃度的重組EPO和感興趣的EPO化合物。個(gè)別培養(yǎng)物可以被維持24小時(shí)，同時(shí)使用formazan反應(yīng)物(CellTiter；Promega，Madison，WI)來測(cè)定細(xì)胞的數(shù)目。
感興趣的EPO化合物的活性可以首先通過使用雌性BALA/c小鼠，觀察其對(duì)血紅蛋白濃度的影響來進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)。給動(dòng)物皮下施用500U/kg-bw的EPO、感興趣的EPO化合物、或等體積的載體，每周三次給藥總共三周(足以觀察到紅細(xì)胞生成反應(yīng)的時(shí)間間隔)。如果EPO化合物提高了小鼠的血清血紅蛋白的濃度，就確定它具有促紅細(xì)胞生成活性。
對(duì)活性的進(jìn)一步評(píng)價(jià)可以使用TF1紅白血病細(xì)胞而體外獲得。如果TF1細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目超過了對(duì)照組，那么感興趣的EPO化合物就具有促紅細(xì)胞生成活性。另外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道其它檢測(cè)促紅細(xì)胞生成活性的檢測(cè)方法也可以使用。例如，歐洲藥典記載了至少兩種用于檢測(cè)EPO化合物的促紅細(xì)胞生成活性的方法，其包括組織缺氧小鼠試驗(yàn)及網(wǎng)狀細(xì)胞試驗(yàn)。
基于EPO受體的組織保護(hù)能力檢測(cè)在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的組織保護(hù)能力檢測(cè)是基于EPO的組織保護(hù)性受體。一旦分離了組織保護(hù)性受體的序列，就可以使用各種檢測(cè)方法來確定特定EPO化合物的組織保護(hù)能力。正如本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員已知的那樣，所用的檢測(cè)的類型主要取決于EPO化合物的重量。
例如，檢測(cè)方法可以是競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)或三明治檢測(cè)或空間位阻檢測(cè)。競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)依賴于示蹤劑類似物與檢測(cè)樣本分析物競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合有限個(gè)位于結(jié)合配體上的結(jié)合位點(diǎn)。這里，術(shù)語“分析物”是指有待于檢測(cè)其組織保護(hù)活性的感興趣的EPO化合物。術(shù)語“結(jié)合配體”是指結(jié)合分析物(特別是EPO受體)的任何蛋白?！笆聚檮笔侵副粯?biāo)記過的試劑，例如標(biāo)記的分析物類似物、固定的分析物類似物、標(biāo)記過的結(jié)合配體、固定的結(jié)合配體和空間偶聯(lián)物。這里的示蹤劑可以具有任何不影響分析物與其結(jié)合配體的結(jié)合的可被檢測(cè)到的功能。非限制的例子包括可被直接檢測(cè)到的部分(moiety)，如熒光染料、化學(xué)發(fā)光劑、和放射性標(biāo)記物，以及必須被反應(yīng)或衍生化才能被檢測(cè)到的部分，如酶。合適的示蹤劑可以是放射性同位素P32、C14、I125、H3、I131、及其混合物；熒光團(tuán)，如稀土螯合物、熒光素、熒光素衍生物、若丹明、若丹明衍生物、丹磺酰氯、傘形酮螢光素酶(螢火蟲螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶(美國(guó)專利號(hào)4,737,456))、熒光素、2，3-dihydrophthalazinediones、辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、與利用過氧化氫氧化染料前體如HRP、乳過氧化物酶、微過氧化物酶和其混合物偶聯(lián)的雜環(huán)氧化醇(尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)；生物素/抗生物素蛋白；自旋標(biāo)記物；噬菌體標(biāo)記；穩(wěn)定的游離自由基；和其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，示蹤劑為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶中的至少一種。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道將示蹤劑與蛋白或多肽偶聯(lián)的方法。例如，偶聯(lián)劑如二醛、碳二亞胺、二順丁烯二酰亞胺、二咪唑、二重氮化對(duì)二氨基聯(lián)苯等可以用于與上面提到的熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、和酶標(biāo)記來進(jìn)行標(biāo)記，其中一些已在美國(guó)專利號(hào)3,940,475和3,645,090中描述，在此全文引入作為參考。
在三明治檢測(cè)方法中，需要進(jìn)行反應(yīng)物的固定，也就是將結(jié)合配體與游離在溶液中的任何分析物分離，其可以通過在檢測(cè)步驟之前沉淀結(jié)合配體或分析物類似物來完成，如同通過共價(jià)偶聯(lián)，如戊二醛交聯(lián)吸附到不溶于水的基質(zhì)或表面(美國(guó)專利號(hào)3,720,760)，或在檢測(cè)步驟之后，通過如免疫沉淀法將配體或類似物固定。
因此，在競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)之前或之后可以將結(jié)合配體沉淀出來(insolubilize)，并且與結(jié)合配體相結(jié)合的示蹤劑或分析物從沒有結(jié)合的示蹤劑和分析物中分離出來。分離可以使用傾析(這里結(jié)合配體是提前沉淀的)或離心(這里結(jié)合配體是在競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)后沉淀的)。試樣分析物的量反比于由標(biāo)記物質(zhì)的量所測(cè)定出來的結(jié)合示蹤劑的量?？梢岳L制已知量分析物的劑量反應(yīng)曲線，并與試驗(yàn)結(jié)果相比較，以定量確定試樣中分析物的量。當(dāng)使用酶作為示蹤劑時(shí)，檢測(cè)方法通常是指ELISA系統(tǒng)。
在連續(xù)三明治檢測(cè)中，例如，被固定的結(jié)合配體用于吸附試驗(yàn)樣品分析物，沖洗去除試驗(yàn)樣品，結(jié)合的分析物用于吸附標(biāo)記過的結(jié)合配體，然后將殘留的示蹤劑與結(jié)合的物質(zhì)分離。結(jié)合示蹤劑的量正比于試驗(yàn)樣品的分析物。在“同時(shí)”三明治檢測(cè)中，加入標(biāo)記過的結(jié)合配體之前，不需要分離試驗(yàn)樣品。
競(jìng)爭(zhēng)性和三明治檢測(cè)方法使用相分離步驟作為檢測(cè)方法的必要部分，但空間位阻檢測(cè)方法在單個(gè)反應(yīng)混合物中進(jìn)行。另一種競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)方法，稱為“同源”檢測(cè)，其不需要相分離。在這樣的檢測(cè)方法中，制備和使用酶與分析物的偶聯(lián)物，從而使得當(dāng)抗分析物連接到分析物上時(shí)，抗分析物的存在影響了該酶的活性。用雙功能的有機(jī)橋?qū)⒔M織保護(hù)受體與酶如過氧化物酶偶聯(lián)。對(duì)與EPO一起使用的偶聯(lián)物進(jìn)行選擇，從而使得EPO的結(jié)合抑制或增強(qiáng)了標(biāo)記酶的活性。這種類型的檢測(cè)方法通常被稱為EMIT。
空間偶聯(lián)物用于同源檢測(cè)的空間位阻方法中。這些偶聯(lián)物可以通過在小分析物上共價(jià)連接一個(gè)小分子量的半抗原來合成，從而使得抗半抗原抗體基本不能與抗分析物同時(shí)結(jié)合到偶聯(lián)物上。存在于試驗(yàn)樣品中的分析物將結(jié)合抗分析物，從而允許抗半抗原結(jié)合到偶聯(lián)物上，導(dǎo)致了偶聯(lián)半抗原的特性改變，例如，當(dāng)半抗原是熒光團(tuán)時(shí)，熒光性發(fā)生變化。
關(guān)于組織保護(hù)能力的檢測(cè)的更多信息描述于共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?0/188,905，申請(qǐng)日為2002年7月3日的專利以及申請(qǐng)序列號(hào)為60/456,891，申請(qǐng)日為2002年4月25日的專利申請(qǐng)，在此全文引入作為參考。
功能檢測(cè)在缺失組織保護(hù)受體序列的情況下，EPO的組織保護(hù)功能可以由體內(nèi)和體外的功能檢測(cè)來確定。優(yōu)選地，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)行單獨(dú)的體外或體內(nèi)檢測(cè)就可以確定EPO化合物的組織保護(hù)活性，但在某些情況下需要兩者都進(jìn)行以確保化合物在體內(nèi)和體外都表現(xiàn)出相同的組織保護(hù)活性。
實(shí)踐中，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠使用本發(fā)明公開的檢測(cè)方法的組合來確定具有至少一個(gè)增加的N-連接的糖鏈和/或至少一個(gè)增加的O-連接的糖鏈的EPO類似物是否具有組織保護(hù)活性。首先，體外實(shí)驗(yàn)如P19細(xì)胞和大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元檢測(cè)可以用于確定感興趣的EPO是否具有組織保護(hù)活性。然后，體內(nèi)的檢測(cè)如大鼠定點(diǎn)局部缺血模型、荷包牡丹堿抽搐模型、或脊髓損傷模型能夠用于驗(yàn)證體外試驗(yàn)的結(jié)果。
本發(fā)明的體外模型包含但不限于，那些用來確定上述EPO類似物組織保護(hù)活性的缺失的模型P19細(xì)胞檢測(cè)、大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元檢測(cè)、和cDNA微列陣，其將在后面和實(shí)施例2中更加詳細(xì)的討論。這些例子是非限制性的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員已知道其它的適合體外檢測(cè)的模型，用于確定EPO化合物的組織保護(hù)活性?？偟恼f來，如果與對(duì)照相比，EPO化合物保持或增強(qiáng)了細(xì)胞的存活力，則EPO化合物將被認(rèn)為是有組織保護(hù)活性的。如果與對(duì)照相比，該促紅細(xì)胞生成素嚴(yán)重影響了檢測(cè)中細(xì)胞的存活力，則其將被認(rèn)為是拮抗性的。
A.基于P19細(xì)胞系的體外檢測(cè)在一個(gè)實(shí)施方案中，體外組織保護(hù)活性的檢測(cè)是基于P19細(xì)胞系的。例如，P19細(xì)胞可以在添加了2mM L-谷胱苷肽、100U/ml的青霉素G、100μg/ml的硫酸化鏈霉素(Gibco)和10％的胎牛血清(Hyclone Laboratories)的DMEM中保持不分化，其中含有1.2g/lNaHCO310mM的hepes緩沖液。除了以5μg/ml的胰島素、100μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、20nM的黃體酮、100μM的腐胺和30nM的Na2SeO3(Sigma)來代替胎牛血清以外，不含血清的培養(yǎng)液中可以含有上述培養(yǎng)液同樣的成分。
將與50％的融合劑(confluency)反應(yīng)的細(xì)胞用重組EPO和/或感興趣的EPO化合物處理過夜，用胰蛋白酶解離，在不含血清的培養(yǎng)液中沖洗并且置于25cm2的組織培養(yǎng)瓶中，達(dá)到在不含血清的培養(yǎng)液中(或含有預(yù)處理添加物)的最終密度為104細(xì)胞/cm2。細(xì)胞的存活力通過臺(tái)盼藍(lán)排斥反應(yīng)來檢測(cè)。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，在未分化的神經(jīng)元樣P19細(xì)胞中去除血清后，加入重組EPO可以阻止細(xì)胞的死亡。例如，如果使用的濃度為0.1U/ml到100U/ml，重組EPO挽救了至多50％的神經(jīng)元樣細(xì)胞使之免于死亡。因此，想要確定感興趣的EPO化合物具有組織保護(hù)活性，其必須相比于對(duì)照組挽救更多的P19細(xì)胞使之免于死亡，優(yōu)選必須挽救約25％到約50％的細(xì)胞，最優(yōu)選為約40％到約50％的細(xì)胞。
B.體外大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分析在另一個(gè)實(shí)施方案中，大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分析用于體外檢測(cè)感興趣的EPO化合物的組織保護(hù)活性。例如，初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可以從15天大的Sprauge Dawley大鼠的胚胎的脊髓中獲得并使用免疫淘選純化。細(xì)胞優(yōu)選以低密度(20000細(xì)胞/cm2)接種在24mm孔板的蓋玻片上，所述24mm孔板用聚-DL-鳥氨酸(orinthine)和N-三甲基賴氨酸內(nèi)鹽預(yù)先包被，并且含有完全培養(yǎng)液(Neurobasal、B27(2％)、0.SmM L-谷氨酰胺、2％的馬血清、25μM 2-巰基乙醇、25μM谷氨酸、1％的青霉素和鏈霉素，1ng/ml的BDNF)。經(jīng)過一段時(shí)間后，優(yōu)選約6天，EPO(10U/ml)和感興趣的EPO化合物(10U/ml)或賦形劑可以加到培養(yǎng)液中(最好優(yōu)選是在檢測(cè)存活的神經(jīng)元細(xì)胞密度前約5天)。然后去除培養(yǎng)液，細(xì)胞與含有4％多聚甲醛的PBS混合40分鐘，用0.2％的Triton X-100滲透，用含10％的小牛血清的PBS封閉，與抗非磷酸化的神經(jīng)絲(SMI-32；1∶9000)的抗體溫育過夜，并利用二氨基聯(lián)苯胺通過抗生物素蛋白-生物素方法來顯影。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活力可以通過SMI-32陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)來進(jìn)行形態(tài)上的評(píng)價(jià)。
運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的混合初級(jí)培養(yǎng)物在維持培養(yǎng)條件下特征性地經(jīng)歷程序性死亡。已經(jīng)表明，在檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目的5天前向培養(yǎng)液中添加重組EPO(10U/ml)，在第5天明顯的增加了初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)目。因此，被認(rèn)為具有組織保護(hù)活性，與對(duì)照組相比，感興趣的EPO化合物優(yōu)選至少挽救了相同數(shù)目的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。在一個(gè)實(shí)施方案中，在維持培養(yǎng)條件下，如果與對(duì)照組相比感興趣的EPO化合物挽救了更多的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，那么就認(rèn)為其具有組織保護(hù)活性。
C.基于cDNA微列陣的體外檢測(cè)另一種檢測(cè)感興趣的EPO化合物的組織保護(hù)活性的方法是cDNA微列陣。這種檢測(cè)方法可以用于確定EPO和感興趣的EPO化合物對(duì)P19細(xì)胞的基因表達(dá)的影響是否不同。從未分化的P19細(xì)胞中分離的mRNA可以顯示出不同的基因調(diào)控模式，這是由小鼠1200cDNA微列陣確定的，其取決于暴露至EPOs的程度。例如，在P19細(xì)胞中1,200基因的表達(dá)可以通過使用來自Clontech(Atlasmouse1.2)的尼龍膜列陣來檢測(cè)。細(xì)胞(107/樣品)可以用鹽水、重組EPO、感興趣的EPO化合物(1mU/ml)、或其混合物處理過夜。然后溶解細(xì)胞用于提取RNA或用3小時(shí)去除血清(總是存在在預(yù)處理時(shí)加入的同樣的細(xì)胞因子)。通過柱層析進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)總RNA提取之后，使用柱上DNase處理層析柱，可以將polyA+RNA純化出來。隨后在[P32]-ATP存在的情況下構(gòu)建探針。該標(biāo)記的探針，優(yōu)選具有兩千萬個(gè)計(jì)數(shù)或更多，可以在68℃的條件下雜交到cDNA尼龍膜上。沖洗該膜并曝光到x光膠片上。放射性信號(hào)的強(qiáng)度可以用Phosphor Imager來檢測(cè)并用Atlas Image 2.0計(jì)算機(jī)程序(Clontech)來分析。
本發(fā)明的體內(nèi)檢測(cè)包括但不限于，用于評(píng)價(jià)EPO化合物的組織保護(hù)活性的檢測(cè)方法，如定點(diǎn)局部缺血模型和海馬(intra-hippoeampal)內(nèi)荷包牡丹堿模型。另外，用于評(píng)價(jià)組織保護(hù)活性的體內(nèi)模型包括脊髓損傷檢測(cè)。進(jìn)一步的，公開在國(guó)際公開號(hào)WO/02053580和美國(guó)專利公開號(hào)2002/0086816和2003/0072737中的各種檢測(cè)方法都可以用于本發(fā)明。
D.基于局部缺血模型的體內(nèi)分析在一個(gè)實(shí)施方案中，這種用于檢測(cè)特定EPO化合物的組織保護(hù)能力的分析方法是基于局部缺血模型。例如，雄性Sprague-Dawley大鼠(～250g)可以用于三血管局部缺血模型。簡(jiǎn)而言之，使用戊巴比妥(60mg/kg-bw)麻醉大鼠并且使用水浴保持37℃的核心溫度。用兩條縫合線結(jié)扎右側(cè)頸動(dòng)脈并切斷。靠近右眼眶的喉孔使得中部腦血管可見，這樣可以麻醉鼻腔血管的末端。為了在固定的MCA傷口周圍產(chǎn)生半影，用鉗子牽引另一側(cè)的頸動(dòng)脈使其閉塞1小時(shí)。在可逆的頸動(dòng)脈閉合發(fā)作時(shí)，可以施用鹽水，重組EPO(5000U/kg-bw)或感興趣的EPO化合物(5000U/kg-bw)。
24小時(shí)后，取下腦部，使用腦部手術(shù)裝置(Harvard Apparatus)從整個(gè)腦部切下連續(xù)的1-mm厚的部分。每一部分然后在含有2％的氯化三苯基四唑的154mM的NaCl中37℃孵化30分鐘。受傷的體積可以用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(MCID，Imaging Reseach，St.Catharines，Ontario，Canada)來測(cè)定。在這樣的檢測(cè)中，如果感興趣的EPO化合物與重組EPO相比，對(duì)改善由于大鼠MCA局部缺血造成的梗塞體積的程度相同或更好，那么就認(rèn)為其具有神經(jīng)保護(hù)活性。
E.基于海馬內(nèi)的荷包牡丹堿抽搐模型的體內(nèi)檢測(cè)在另一個(gè)實(shí)施方案中，EPO化合物的組織保護(hù)能力可以通過體內(nèi)的海馬內(nèi)的荷包牡丹堿實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)。例如，雄性Sprangue-Dawley大鼠(250～280g)被關(guān)在恒定溫度(23℃)和相對(duì)濕度(60％)的條件下，施用充分的食物和水，提供固定的12小時(shí)的晝/夜循環(huán)。在立體定位引導(dǎo)下手術(shù)給大鼠植入套管和電極，按照Vezzani，A.，等，J.Neurosci，19，5054-65(1999)中所述。簡(jiǎn)要的，使用Equithesin(1％的戊巴比妥/4％的水合三氯乙醛；3ml/kg i.p.)麻醉大鼠。兩個(gè)螺旋的電極位于頂骨皮層的兩邊，還放入位于鼻竇下的接地線。雙極鎳鎘鐵合金線絕緣電極(60μm)然后可被植入到背面海馬(隔膜電極)的腦回的兩側(cè)，并且可植入位于硬腦膜頂部單側(cè)的套管(22-規(guī)格)用于海馬內(nèi)和腦室內(nèi)灌輸藥物。植入電極的基于前囪的位置坐標(biāo)應(yīng)當(dāng)是(mm)前-后-3.5；兩邊2.4和3硬腦膜下，使用壓尺設(shè)置在-2.5.Paxinos，G.&Waston，C.，The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates，AcademicPress，New York(1986)。電極可以與多孔插座連接(MarchElectronics，NY)和，連接在注射容器上，用丙烯酸牙齒粘合劑保護(hù)頭骨。
該實(shí)驗(yàn)優(yōu)選在動(dòng)物手術(shù)后的3到7天動(dòng)物完全康復(fù)時(shí)進(jìn)行。然后給動(dòng)物腹腔施用重組EPO或感興趣的EPO化合物(都是5000U/kg-bw)或載體，在誘導(dǎo)荷包牡丹堿發(fā)作之前24小時(shí)給藥一次，誘導(dǎo)前30分鐘時(shí)再給藥一次。記錄EEG和腦內(nèi)藥物注射的步驟已經(jīng)描述在Vezzani，A.，等，J.Pharmacol Exp Ther，239，256-63(1986)。簡(jiǎn)要的，在開始EEG記錄(4道EEG多種波動(dòng)描寫器，型號(hào)BP8，Battaglia Rangoni，Bologna，Italy)前，動(dòng)物可以放養(yǎng)在Plexiglass籠子中(25×25×60)最少10分鐘。約15到約30分鐘后，用0.8nmol/0.5μl的荷包牡丹堿甲碘化物灌輸后，進(jìn)行持續(xù)120分鐘的EEG記錄。所有的注射都是用伸到套管下方3mm的針頭(28-規(guī)格)施用于非麻醉大鼠。
可通過EEG分析來檢測(cè)抽搐，此前已經(jīng)表明其可以提供對(duì)藥物的抗驚厥活性的靈敏檢測(cè)。Vezzani，A.，等，J.Pharmacol Exp Ther，239，256-63(1986)。出于該檢測(cè)的目的，抽搐由全部4項(xiàng)記錄信息(leads of recordings)中同時(shí)發(fā)生的至少兩項(xiàng)下述改變組成高頻和/或多峰值復(fù)合(multispike complex)和/或高電壓同步峰值(highvoltage synchronized spike)或波浪型活動(dòng)?？捎^察到同步峰值與抽搐相混合。選擇用于定量抽搐的參數(shù)優(yōu)選是第一次抽搐(抽搐發(fā)作)的潛伏時(shí)間，癲癇反應(yīng)總共消耗的時(shí)間(通過將發(fā)作事件的持續(xù)時(shí)間加在一起而確定；抽搐持續(xù)時(shí)間)，和在EEG記錄期間(抽搐反應(yīng))的峰值反應(yīng)。
使用EEG反應(yīng)作為該數(shù)的海馬內(nèi)荷包牡丹堿抽搐模型已經(jīng)被證明是藥物的抗抽搐能力的靈敏和特異性的預(yù)報(bào)手段。Vezzani，A.，等，J.Pharmacol Exp Ther，239，256-63(1986)。因此，要想被認(rèn)為具有組織保護(hù)活性，感興趣的長(zhǎng)效EPO應(yīng)該相比于重組EPO而言相同程度或更大程度地減少了抽搐的頻率和嚴(yán)重程度。
F.基于急性可逆青光眼大鼠模型的體內(nèi)檢測(cè)在本發(fā)明的另一種體內(nèi)檢測(cè)中，急性可逆青光眼大鼠模型可以用于感興趣的特定EPO化合物的組織保護(hù)能力的檢測(cè)。例如，因?yàn)橐暰W(wǎng)膜細(xì)胞對(duì)局部缺血非常敏感，因此許多這樣的細(xì)胞在局部缺血脅迫下30分鐘后就會(huì)死亡。因此，為了檢測(cè)外周施用的感興趣的EPO化合物是否顯示足以保護(hù)對(duì)局部缺血敏感的細(xì)胞的組織保護(hù)活性，可以使用急性、可逆青光眼大鼠模型，其描述參見Rosenbaum等，Vis.Res.373443-51，1997。特別的，可以注射鹽水到成年雄性大鼠的眼部前腔，并使其壓力超過體動(dòng)脈血壓并維持60分鐘。然后在誘導(dǎo)出局部缺血之前24小時(shí)給大鼠腹腔內(nèi)施用鹽水和5000U EPO/kg體重，并且作為每日劑量連續(xù)施用額外的3天。
治療后1周可以用視網(wǎng)膜電流描記器可以檢測(cè)適應(yīng)了黑暗的大鼠，以確定感興趣的EPO化合物是否具有組織保護(hù)活性。如果該EPO具有組織保護(hù)活性，相那么比于用鹽水治療的大鼠，在視網(wǎng)膜電流描記中應(yīng)該有很好的活性保留。
G.心肌梗塞檢測(cè)心肌梗塞檢測(cè)也可以應(yīng)用于本發(fā)明，其用來檢測(cè)EPO化合物在整體上或特別在心臟內(nèi)是否具有組織保護(hù)活性。例如，在麻醉大鼠并準(zhǔn)備進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎前24小時(shí)可以給成年雄性大鼠施用5000U/kg體重的EPO。在程序開始時(shí)可以施用額外劑量的EPO，同時(shí)結(jié)扎左邊的主冠狀動(dòng)脈30分鐘然后松開。在處理后每天施用同樣劑量的EPO1周，同時(shí)檢測(cè)大鼠的心臟功能。接受了空白注射(鹽水)的大鼠將顯示出左邊末端心臟舒張壓的大幅度增加，預(yù)示了擴(kuò)大的、僵硬的心臟，僅次于心肌梗塞，而對(duì)施用了長(zhǎng)效EPO的動(dòng)物而言，如果該長(zhǎng)效EPO有組織保護(hù)活性的話，那么該動(dòng)物應(yīng)當(dāng)相比于空白對(duì)照組表現(xiàn)出未損傷的心臟功能(顯著性差異在P(0.01水平)。
H.脊髓損傷檢測(cè)脊髓損傷檢測(cè)也可以用于本發(fā)明來評(píng)價(jià)特定的感興趣EPO化合物的組織保護(hù)活性。特別的，可將大鼠脊髓壓縮液用于本發(fā)明。優(yōu)選使用體重約為180g到約300g的Wistar大鼠(雌性)。手術(shù)前，動(dòng)物優(yōu)選在手術(shù)前絕食12小時(shí)，人性化監(jiān)禁，并腹腔內(nèi)注射戊硫代巴比妥鈉(40mg/kg-bw)進(jìn)行麻醉。皮膚滲透(0.25％的布比卡因)之后，在解剖用顯微鏡的輔助下，通過2cm的切口進(jìn)行完全單水平(T-3)椎板切除術(shù)。創(chuàng)傷性脊髓損傷是由硬腦膜外的臨時(shí)動(dòng)脈瘤夾子通過施加在脊髓上0.6牛頓(65克)的閉合力1分鐘而誘導(dǎo)的。取下夾子后，縫合皮膚的切口，大鼠從麻醉中完全蘇醒，再放回到籠子中。使用至少每天兩次的膀胱觸診來監(jiān)控大鼠直到恢復(fù)自發(fā)性的排空。
對(duì)照組的動(dòng)物在縫合切口后迅速的立即施用通常的鹽水(通過靜脈注射)。其余的動(dòng)物靜脈施用16毫克/kg-bw的感興趣的EPO化合物。然后使用運(yùn)動(dòng)比率值(locomotor rating scale)來評(píng)價(jià)大鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)學(xué)功能。在這種數(shù)值里，動(dòng)物的得分范圍從0(沒有觀察到后肢運(yùn)動(dòng))到21(正常的步態(tài))。由不了解動(dòng)物所受治療的同一個(gè)檢驗(yàn)人員在損傷后1小時(shí)、12小時(shí)、12小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、和1周，分別測(cè)定大鼠的功能缺失。如果長(zhǎng)效EPO具有組織保護(hù)活性，施用了該EPO的大鼠應(yīng)當(dāng)比注射鹽水的大鼠更快更好的從損傷中痊愈。
I.兔脊髓局部缺血檢測(cè)在另一個(gè)實(shí)施方案中，將兔脊髓局部缺血檢測(cè)用于組織保護(hù)能力的檢測(cè)。例如，新西蘭白兔(36，8-12月大，雄性)重1.5kg-2.5kg可以用于該檢測(cè)中。動(dòng)物禁食12小時(shí)并人性化的管理。麻醉誘導(dǎo)是通過3％的三氟溴氯乙烷，其分散在100％的氧氣中，并維持于0.5-1.5％的三氟溴氯乙烷，其分散在50％的氧氣和50％的空氣混合氣體中。將靜脈注射用導(dǎo)管(22-規(guī)格)插入左耳靜脈。在手術(shù)過程中以每小時(shí)4ml/kg體重(bw)的速度灌輸Ringers乳酸鹽溶液。手術(shù)前，靜脈注射10ml/kg-bw的頭孢唑林(Cefazoline)以預(yù)防感染。動(dòng)物被放置成右邊臥姿，用聚乙烯吡酮碘處理皮膚，使用布比卡因(0.25％)滲透，并在平行于脊骨的第12節(jié)處開一側(cè)面的皮膚切口。在切開皮膚和皮下胸腰筋膜后，取出最長(zhǎng)腰肌和腰髂肋肌。通過左邊腹膜后方法暴露腹部動(dòng)脈，移動(dòng)到左邊的腎動(dòng)脈下方一點(diǎn)。一根PE-60管從左側(cè)腎動(dòng)脈遠(yuǎn)端繞住動(dòng)脈，并且兩端都穿過一個(gè)大一點(diǎn)的橡膠管。通過拉動(dòng)PE管，非外傷性的結(jié)扎腹部動(dòng)脈20分鐘。
在腹部動(dòng)脈結(jié)扎以靜脈丸劑形式施用肝素(400IU)。結(jié)扎20分鐘后，去除橡膠管和導(dǎo)管，縫合切口并監(jiān)護(hù)動(dòng)物直到痊愈，同時(shí)對(duì)動(dòng)物順序進(jìn)行神經(jīng)學(xué)功能的檢測(cè)。在解開腹部動(dòng)脈結(jié)扎后立即給對(duì)照組動(dòng)物靜脈注射通常的鹽水。在重新灌注后立即給另一組動(dòng)物靜脈注射6.5μg/kg-bw的感興趣的EPO化合物(每組的n＝6)。
由不了解動(dòng)物所受治療的檢測(cè)者在重新灌注后1小時(shí)、24小時(shí)、和48小時(shí)根據(jù)Drummond和Moore的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)。每只動(dòng)物得分為0到4，按如下標(biāo)準(zhǔn)打分0＝下肢麻痹，沒有明顯的后肢運(yùn)動(dòng)能力；1＝低的后肢運(yùn)動(dòng)能力，僅有微弱的抗重力運(yùn)動(dòng)；2＝中度的后肢運(yùn)動(dòng)能力并具有較強(qiáng)的抗重力能力但沒有從身體下面伸腿的能力；3＝很好的運(yùn)動(dòng)能力并具有從身體下面伸腿和跳躍的能力，但不是正常的；4＝正常的運(yùn)動(dòng)能力。在對(duì)下肢麻痹的動(dòng)物進(jìn)行每天兩次的人工膀胱排空。
如果長(zhǎng)效EPO具有組織保護(hù)活性，那么施用了該EPO的動(dòng)物應(yīng)該相比用鹽水注射的動(dòng)物應(yīng)該更快更好的從損傷中痊愈。
J.用于檢測(cè)EPO及其類似物的組織保護(hù)作用的其它可能的測(cè)定如前所述，好幾種組織具有EPO受體，從而，可能對(duì)EPO的組織保護(hù)能力有所應(yīng)答。因此，根據(jù)感興趣的EPO化合物的預(yù)期臨床用途，技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到也可以進(jìn)行涉及這些另外的應(yīng)答細(xì)胞的類似體外檢測(cè)，或進(jìn)行涉及到相應(yīng)器官的體內(nèi)檢測(cè)。例如，基于血清去除的體外檢測(cè)可以利用心肌、視網(wǎng)膜、和Leydig細(xì)胞以類似于上述用于P19檢測(cè)的方法來進(jìn)行。
體內(nèi)檢測(cè)也可以直接用于具體的器官。例如，為了評(píng)價(jià)EPO對(duì)于視網(wǎng)膜細(xì)胞的影響，本領(lǐng)域內(nèi)普通的技術(shù)人員可以進(jìn)行上述的視網(wǎng)膜局部缺血檢測(cè)。另外，為了評(píng)價(jià)EPO類似物對(duì)于心肌細(xì)胞的影響，本領(lǐng)域內(nèi)普通的技術(shù)人員可以容易地改變上述的心機(jī)梗塞檢測(cè)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠選擇合適的檢測(cè)方法或模型用于評(píng)價(jià)特定的EPO對(duì)促紅細(xì)胞生成應(yīng)答細(xì)胞、組織或器官是否具有組織保護(hù)活性。
實(shí)施例下面所述的實(shí)施例僅僅用于解釋本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，不能解釋為限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍是由附加的權(quán)利要求所限定的。
實(shí)施例1化學(xué)修飾的EPOA.糖鏈的氧化EPO的糖鏈部分可以使用下述的步驟轉(zhuǎn)化成酸。EPO和足以提供氧化所需量(高碘酸鈉的量越大，氧化程度越高)的高碘酸鈉可以被置于100mM乙酸鈉緩沖液中。然后該溶液冰浴20分鐘并使用蒸餾水透析。然后從透析管中取出產(chǎn)物并收集到一個(gè)干凈的試管里(產(chǎn)物I)。
定量本尼迪特溶液(18g的硫酸銅，100g的碳酸鈉(無水)，200g的檸檬酸鉀，125g的硫氰酸鉀，25g的氰亞鐵酸鉀)可以用蒸餾水溶解，最終體積為1升。然后在定量本尼迪特溶液(Quantitative BenedictSolution)中加入幾滴甲基藍(lán)。
產(chǎn)物I隨后可以被加到該定量本尼迪特溶液中直到溶液的顏色變得澄清，這表明溶液已完全氧化。然后可以將該溶液去鹽并用離心過濾裝置(Ultrafree Centrifugal Filter Unit)濃縮。然后該樣品(產(chǎn)物II)可以再進(jìn)一步用蒸餾水透析。
B.用葡萄糖氧化酶對(duì)脫唾液酸形式的EPO進(jìn)行氧化50到500μg的脫唾液酸形式EPO，10μl 1U/μl的葡萄糖氧化酶，和100μl 10mM的磷酸鈉緩沖液可以在15ml的圓錐形離心管中混合(總體積為110μl)。然后該混合物可以在37℃下溫育2小時(shí)，同時(shí)可用蒸餾水充分透析。然后可以從透析管中取出產(chǎn)物并收集到一個(gè)干凈的試管里(產(chǎn)物III)。
定量本尼迪特溶液(上述的)可以用蒸餾水溶解到最終體積為1升。然后可以在定量本尼迪特溶液加入幾滴甲基藍(lán)。
然后產(chǎn)物III可以加到該定量本尼迪特溶液中，直到溶液的顏色變得澄清，表明溶液已完全氧化。然后將該溶液去鹽并用離心過濾裝置(Ultrafree Centrifugal Filter Unit)濃縮。然后該樣品(產(chǎn)物IV)可以再進(jìn)一步用蒸餾水充分透析。
C.EPO的硫酸化EPO可以溶解在4℃的N，N-二甲基甲酰胺(DMF-SA)中。然后加入溶解在DMF中的N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，將溶液在4℃的條件下震蕩4小時(shí)。可加入碎冰并用10N的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.5?？梢哉{(diào)整溶液的體積并在HN-S2型離心管(DAMONIEC，NeedhamHts.，Massachusettes)中以1000xg離心15分鐘。然后可以將上清液充分透析。更多的有關(guān)硫酸化的描述參見S.Pongor等，Preparationof High-Potency，Non-aggregating Insulins Using a Novel SulfationProcedure，Diabetes，Vol.32，No.12，December 1983，在此全文引入作為參考。
D.將PEG鏈連接到EPO上可以通過將PEG鏈連接到氧化的糖鏈上來修飾EPO，如上述在A中獲得的(產(chǎn)物I)。修飾的程度可以通過調(diào)節(jié)氧化作用中高碘酸鹽的濃度來調(diào)控。
制備PEG-EPO偶聯(lián)產(chǎn)物時(shí)可以首先用1mM-10mM的間高碘酸鈉(Sigma)室溫下氧化EPO(2-4mg/ml在50mM乙酸鈉中)30分鐘。然后在100mM，pH5.4的乙酸鈉中通過緩沖交換除去磷酸緩沖液。
各種分子量的甲氧基-PEG-酰肼(Nektar Therapeutics)隨后可以以5到100倍的摩爾過量(多聚物蛋白質(zhì))加入。然后可以通過加入15mM的氰化硼氫化鈉(Sigma)，在4℃反應(yīng)過夜減少中間酰肼連接。獲得的偶聯(lián)物然后可以用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)分餾/純化。
E.連接PEG鏈到脫唾液酸的EPO脫唾液酸形式的EPO可以通過在用半乳糖氧化酶氧化后，將PEG鏈連接到新生成的末端半乳糖殘基上而進(jìn)行修飾，如那些在上述B中獲得的產(chǎn)物(產(chǎn)物III)。
重組人類EPO(rhuEPO)可以根據(jù)制造商手冊(cè)用唾液酸酶(Prozyme，Inc)進(jìn)行去唾液酸化?；瘜W(xué)修飾優(yōu)選是通過將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳上來確定。染色的產(chǎn)物帶應(yīng)該表明修飾的EPO具有約31kDa的表觀分子量，而未修飾的EPO具有約34kDa的分子量。保留在EPO中的唾液酸優(yōu)選少于0.1mol/mol EPO。
獲得脫唾液酸形式的EPO后，新暴露的EPO(2-4mg/ml，在10mM的磷酸鈉緩沖液中)的半乳糖殘基可以用每毫升EPO溶液100單位的半乳糖氧化酶(Sigma)(溶于PBS中)進(jìn)行氧化。反應(yīng)混和物然后在37℃溫育2小時(shí)。
然后在pH5.4的100mM乙酸鈉中通過緩沖交換去除磷酸緩沖液。然后將各種分子量的甲基化-PEG-酰肼(Nektar Therapeutics)以5到100倍的摩爾過量(多聚物蛋白質(zhì))加入。然后優(yōu)選通過加入15mM的氰化硼氫化鈉(Sigma)進(jìn)一步減少中間酰肼連接，在4℃反應(yīng)過夜。然后可以用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)分餾/純化獲得的偶聯(lián)物。
F.連接PEG鏈到脫唾液酸的EPO脫唾液酸形式的EPO可以通過在用半乳糖氧化酶氧化后，將PEG鏈連接到新生成的末端半乳糖殘基上而進(jìn)行修飾，如那些在上述B中獲得的產(chǎn)物(產(chǎn)物III)。
RhuEPO(1mg)可以用唾液酸苷酶(Seikagaku Corporation ofJapan，將1U的凍干粉溶解在100μL的75mM NaPO4(pH6.5)中)以1mgEPO比0.05單位唾液酸苷酶(5μL)的比例進(jìn)行去唾液酸化。然后在混合物中添加5個(gè)單位(5μL)的半乳糖氧化酶(450μL溶解在75mM NaPO4(pH6.5)(Sigma)中)。
然后通過緩沖交換在pH5.4的100mM乙酸鈉中去除磷酸緩沖液。然后向混合物中加入PEG-NH2(750分子量，Nektar Therapeutics)和15mM的氰化硼氫化鈉(Sigma)然后在4℃反應(yīng)過夜。優(yōu)選地，PEG-NH2加入量為250倍的摩爾過量(多聚物蛋白質(zhì))(80mg的PEG-NH2)。然后用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)分餾/純化獲得的偶聯(lián)物。
實(shí)施例2.功能檢測(cè)A.促紅細(xì)胞生成檢測(cè)一種特定的EPO化合物的促紅細(xì)胞生成能力，即調(diào)控血細(xì)胞比容水平的能力，通過如下的檢測(cè)方法確定。
TF1是一種完全依賴于生長(zhǎng)因子(包括EPO)的人類紅細(xì)胞白血病細(xì)胞。Kitamura，等，Blood 73，375-80。TF1細(xì)胞系從ACTT獲得并且用含有2mM L-谷氨酰胺，10mM Hepes，1mM丙酮酸鈉，4.5g/L葡萄糖，1.5g/L重碳酸鈉，5ng/ml GM-CSF，和10％胎牛血清的RPMI1640一直保存到實(shí)驗(yàn)時(shí)。從活性生長(zhǎng)期獲得的TF1細(xì)胞被沉淀下來，用培養(yǎng)液?jiǎn)为?dú)沖洗三次，并以1ml培養(yǎng)液中含有105個(gè)細(xì)胞的濃度重懸浮，其中可以有或沒有GM-CSF，并且添加有特定濃度的EPO或具有至少一個(gè)增加的N-連接的糖鏈和/或至少一個(gè)增加的O-連接的糖鏈的EPO類似物。各培養(yǎng)物保持24小時(shí)，使用formazan反應(yīng)物(CellTiter；Promega，WI)根據(jù)制造商手冊(cè)來確定細(xì)胞的數(shù)目。
此外，化學(xué)修飾的EPO化合物的活性通過觀察它對(duì)雌性BALB/c小鼠血紅蛋白濃度的影響而首先進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)。給動(dòng)物皮下施用500U/kg-bw的EPO，感興趣的EPO化合物，或等體積的載體，1周3次總共3周(足以觀察到促紅細(xì)胞生成反應(yīng)的時(shí)間間隔)。如果EPO化合物提高了小鼠的血清血紅蛋白的濃度，那么就認(rèn)為其具有促紅細(xì)胞生成活性。進(jìn)一步的活性檢測(cè)通過在體外使用TF1紅細(xì)胞白血病細(xì)胞而獲得。研究確認(rèn)如果相對(duì)TF1細(xì)胞數(shù)的增加超過了對(duì)照組，那么就認(rèn)為EPO具有促紅細(xì)胞生成活性。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道這些和其它的檢測(cè)方法，如組織缺氧小鼠檢測(cè)方法和網(wǎng)狀細(xì)胞檢測(cè)方法(歐洲藥典)，也適用于本發(fā)明以確定長(zhǎng)效組織保護(hù)細(xì)胞因子的促紅細(xì)胞生成活性。
B.組織保護(hù)活性檢測(cè)具有至少一個(gè)增加的N-連接的糖鏈和/或至少一個(gè)增加的O-連接的糖鏈的EPO類似物的組織保護(hù)功能通過如下的方法來檢測(cè)。
由18天大的大鼠胚胎的海馬體構(gòu)建神經(jīng)元培養(yǎng)物。從腦膜中取出并分離腦部，分離出海馬體。然后細(xì)胞分散在2.5％的胰蛋白酶溶液中，在37℃下溫育5分鐘，然后滴定。細(xì)胞懸浮液用不含血清的、含有1％B-27的補(bǔ)充液(Gibco，Rockville，MD，USA)的神經(jīng)基質(zhì)(neurobasal)培養(yǎng)液稀釋，并以每片蓋玻片80,000個(gè)細(xì)胞密度放置在覆蓋有多聚鳥苷酸的蓋玻片上。細(xì)胞然后用EPO過夜預(yù)處理，然后暴露在5μM TMT中24小時(shí)，有或沒有1)EPO，2)具有至少一個(gè)增加的N-連接的糖鏈和/或至少一個(gè)增加的O-連接的糖鏈的EPO類似物，或3)脫唾液酸形式的EPO。然后在體外使用介于10到14天的培養(yǎng)物。
可以通過溴化3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-聯(lián)苯四唑(MTT)檢測(cè)來測(cè)定細(xì)胞的存活力。Denziot，E.，and Lang，R.1986.RapidColormetric Assay for Cell Growth and Survial.Modifications to thetetrazolium dye procedure giving improved reliability。J ImmunolMethods 89271-277。簡(jiǎn)言之，將MTT四唑鹽溶解在不含血清的培養(yǎng)液中，至最終濃度為0.75mg/ml并在處理結(jié)束時(shí)加入到細(xì)胞中，在37℃下3小時(shí)。然后去除培養(yǎng)液并用1N HCl∶異丙醇(1∶24)提取formazan。在微量培養(yǎng)板讀數(shù)器上讀取560nm處的吸收值。
如在附圖1和2中描述的那樣，具有至少一個(gè)增加的N-連接的糖鏈和/或至少一個(gè)增加的O-連接的糖鏈的EPO類似物不具有組織保護(hù)功能。
這里描述和要求保護(hù)的發(fā)明的范圍不被本文所公開的具體實(shí)施方案所限制，因?yàn)檫@些具體實(shí)施方案僅用于解釋本發(fā)明的幾個(gè)方面。任何等價(jià)的實(shí)施方案也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實(shí)上，除了那些在這里描述的發(fā)明以外，本發(fā)明的各種修飾對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在閱讀了前面的描述之后將是顯而易見的。這樣的修飾也落在了所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。在此引用的所有文獻(xiàn)為各種目的全文引入作為參考。
權(quán)利要求
1.調(diào)節(jié)人類血細(xì)胞比容水平的方法，包括以下的步驟提供比rhuEPO具有更長(zhǎng)血清半衰期并包含組織保護(hù)功能的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品；和施用治療有效量的該促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品。
2.權(quán)利要求1所述的方法，所述提供促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品的步驟還包括以下的步驟用至少一種化學(xué)修飾在rhuEPO的至少一條N-連接的寡糖鏈或O-連接的寡糖鏈上修飾，其中，所述的化學(xué)修飾包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述施用治療有效量的該促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品的步驟包括以低于rhuEPO的摩爾量施用該促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品以獲得相當(dāng)?shù)哪繕?biāo)血細(xì)胞比容。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的血清半衰期比rhuEPO的血清半衰期至少長(zhǎng)約20％。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的血清半衰期比rhuEPO的血清半衰期至少長(zhǎng)約40％。
6.人工促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品，包括至少一種促紅細(xì)胞生成素衍生物，其中至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈具有至少一種化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾來源于氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其混合，并且其中所述促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品的血清半衰期比rhnEPO長(zhǎng)。
7.權(quán)利要求6所述的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品，其中，所述的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品具有組織保護(hù)功能。
8.權(quán)利要求6所述的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品，所述的至少一種化學(xué)修飾包括至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈的氧化以提供至少一個(gè)增加的酸殘基。
9.權(quán)利要求6所述的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品，所述的至少一種化學(xué)修飾包括至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈的硫酸化以在該促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品上提供增加的負(fù)電荷。
10.權(quán)利要求6所述的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品，所述的至少一種化學(xué)修飾包括至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈的磷酸化以在該促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品上提供增加的負(fù)電荷。
11.權(quán)利要求6所述的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品，所述的至少一種化學(xué)修飾包括在至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈上增加至少一條聚乙二醇鏈。
12.制備具有延長(zhǎng)的血清半衰期和組織保護(hù)活性的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品的方法，包括以下的步驟提供至少一種促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素衍生物；和在至少一種內(nèi)源性或重組促紅細(xì)胞生成素的至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈上通過氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合進(jìn)行修飾。
13.權(quán)利要求12所述的方法，所述的修飾步驟還包括用至少一個(gè)酸殘基取代至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈上的至少一個(gè)鄰位羥基的步驟。
14.權(quán)利要求13所述的方法，所述的用至少一種酸殘基取代至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈上的至少一個(gè)鄰位羥基的步驟還包括用多個(gè)酸殘基取代至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈上的多個(gè)鄰位羥基。
15.權(quán)利要求12所述的方法，所述的修飾步驟還包括以下的步驟提供一種有機(jī)溶劑；在該有機(jī)溶劑中溶解該促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素衍生物以形成溶液；提供至少一種縮合劑；提供至少一種硫酸鹽供體；和將所述的至少一種縮合劑和至少一種硫酸鹽供體混合到溶液中。
16.權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述的修飾步驟還包括以下的步驟提供一種有機(jī)溶劑；在該有機(jī)溶劑中溶解該促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素衍生物以形成溶液；提供至少一種縮合劑；提供磷酸；和將所述的至少一種縮合劑和至少一種磷酸混合到上述溶液中。
17.權(quán)利要求12所述的方法，所述的修飾步驟還包括以下的步驟提供一種有機(jī)溶劑；在該有機(jī)溶劑中溶解促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素衍生物以形成第一溶液；提供至少一種氧化劑；在該第一溶液中加入該至少一種氧化劑以形成第二溶液；提供至少一種聚乙二醇鏈；和將所述至少一種聚乙二醇鏈混合到第二溶液中。
18.權(quán)利要求17所述的方法，所述的提供至少一種聚乙二醇鏈的步驟包括在鏈的末端提供具有至少一個(gè)伯氨基團(tuán)的至少一種聚乙二醇鏈。
19.治療處于組織損傷危險(xiǎn)中的患者貧血的方法，包括如下的步驟提供在至少一條N-連接的寡糖鏈或O-連接的寡糖鏈上有至少一種化學(xué)修飾的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品，其中所述的化學(xué)修飾包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合；施用治療有效量的所述促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品，其中所述的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品施用的摩爾量低于rhuEPO，以獲得相當(dāng)?shù)哪繕?biāo)血細(xì)胞比容，其中所述的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品具有細(xì)胞保護(hù)功能。
20.權(quán)利要求19所述的方法，所述的促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)品具有比rhuEPO長(zhǎng)的血清半衰期。
21.權(quán)利要求20所述的方法，所述的血清半衰期比rhuEPO的血清半衰期至少長(zhǎng)約20％。
22.權(quán)利要求21所述的方法，所述的血清半衰期比rhuEPO的血清半衰期至少長(zhǎng)約40％。
23.一種藥物組合物，包含治療有效量的至少一種促紅細(xì)胞生成素衍生物，在其至少一條N-連接的寡糖鏈或至少一條O-連接的寡糖鏈上具有至少一種化學(xué)修飾，所述化學(xué)修飾來源于氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、或其組合，所述的至少一種促紅細(xì)胞生成素衍生物具有比重組促紅細(xì)胞生成素更長(zhǎng)的血清半衰期并具有組織保護(hù)功能。
24.權(quán)利要求23所述的藥物組合物，還包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
25.權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中所述的至少一種藥學(xué)上可接受的載體包含至少一種稀釋劑、佐劑、賦形劑、載體、或其混合。
26.權(quán)利要求23所述的藥物組合物，還包含至少一種潤(rùn)濕劑、乳化劑、pH緩沖劑或其組合。
27.權(quán)利要求23所述的藥物組合物，還包含至少一種組織保護(hù)細(xì)胞因子。
全文摘要
一種通過施用含有化學(xué)修飾的長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成素的藥物組合物增加個(gè)體血細(xì)胞比容同時(shí)保持了內(nèi)源性組織保護(hù)活性的方法。同時(shí)也公開了一種新的化學(xué)修飾的長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成素，制備該化學(xué)修飾的長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成素的方法，和含有該化學(xué)修飾的長(zhǎng)效促紅細(xì)胞生成素的組合物。
文檔編號(hào)C07K14/505GK1882355SQ200480032954
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月9日
發(fā)明者A·切拉米, J·斯馬特, M·布賴恩斯, C·切拉米 申請(qǐng)人:沃倫藥品公司, 肯尼思·S·沃倫研究院