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一種氯霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用與流程

文檔序號:12690436閱讀:542來源:國知局
一種氯霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及一種半抗原及其制備方法和應(yīng)用,尤其涉及一種氯霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用。



背景技術(shù):

氯霉素(Chloramphenicol,CAP)是Ehrlich(1947)分離出來的一種廣譜抗生素。由于其低廉的價格和穩(wěn)定的抗菌性,曾在一段時間內(nèi)作為飼料添加劑和獸醫(yī)臨床常用藥品。但氯霉素有嚴(yán)重的毒副作用,能引起再生障礙性貧血癥和嬰兒灰色綜合癥。美國和歐共體已禁止在動物中使用氯霉素,并規(guī)定在動物源食品中不得檢出,且這種不得檢出的低限已達(dá)到0.01μg/kg。目前,我國動物源食品中氯霉素殘留仍很嚴(yán)重,出口的水產(chǎn)品、蜂蜜屢屢被檢出氯霉素殘留。為保障人民的身體健康,迫切需要建立靈敏度高,特異性強(qiáng),簡便易行的檢驗方法。

氯霉素檢測方法包括微生物法、色譜法、免疫測定法。微生物法易操作、費(fèi)用低,但靈敏度低、特異性差。色譜法精確可靠、靈敏度高,檢測極限可達(dá)到0.1μg/kg,但前處理步驟多,回收率偏低。免疫測定具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、對儀器設(shè)備和人員素質(zhì)要求低以及樣品前處理簡單等優(yōu)點,適于現(xiàn)場監(jiān)控和大規(guī)模樣品篩選。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的是提供一種氯霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個方面是提供一種氯霉素半抗原,其分子結(jié)構(gòu)式為:

本發(fā)明的第二個方面是提供一種如本發(fā)明第一個方面所述的氯霉素半抗原的制備方法,包括以下步驟:步驟1,取氯霉素,加入叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)、咪唑和無水N,N-二甲基甲酰胺(DMF),室溫反應(yīng)完全,純化,得到TBS-氯霉素,其分子結(jié)構(gòu)式如式(2)所示,其中氯霉素、TBSCl、咪唑和無水DMF的用量比為:1g︰700-800mg︰300-500mg︰3-7mL;步驟2,取TBS-氯霉素,加入二氯甲烷溶解,加入丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺,室溫反應(yīng)完全,純化,得到含琥珀?;?TBS-氯霉素,其分子結(jié)構(gòu)式如式(3)所示,其中TBS-氯霉素、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的用量比為:0.9746g︰0.81-0.83g︰0.24-0.26g︰100-300μL;;步驟3,取含琥珀酰基-TBS-氯霉素,加入吡啶、乙腈和40%HF,冰浴冷卻后,室溫反應(yīng)完全,純化,得到權(quán)利要求1所述的氯霉素半抗原,其中含琥珀?;?TBS-氯霉素、吡啶、乙腈和40%HF的用量比為:954.94mg︰2-4mL︰5-7mL︰1.5-2mL;;

優(yōu)選地,上述步驟(1)中,氯霉素、TBSCl、咪唑和無水DMF的用量比為:1g︰750mg︰400mg︰5mL。

優(yōu)選地,上述步驟(2)中TBS-氯霉素、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的用量比為:0.9746g︰0.8236g︰0.2514g︰200μL。

優(yōu)選地,上述步驟(3)中含琥珀?;?TBS-氯霉素、吡啶、乙腈和40%HF的用量比為:954.94mg︰3mL︰6mL︰1.780mL。

本發(fā)明的第三個方面是提供一種氯霉素抗原,由本發(fā)明第一個方面所述的氯霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到,其分子結(jié)構(gòu)式為:

本發(fā)明的第四個方面是提供一種制備如本發(fā)明第三個方面所述的氯霉素抗原的方法,包括以下步驟:步驟a,取權(quán)利要求1所述的氯霉素半抗原,加入無水二甲基甲酰胺混勻后,加入二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺,室溫反應(yīng)過夜,其中,氯霉素半抗原、二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的用量比為:0.09mmol︰0.09-0.15mmol︰0.09-0.15mmol;步驟b,離心,取溶液,將溶液緩慢加入載體蛋白溶液中,所用載體蛋白的量按照半抗原與載體蛋白的摩爾比15-40︰1計;步驟c,反應(yīng)完全后,透析,得到氯霉素抗原。

優(yōu)選地,上述步驟a中,氯霉素半抗原、二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的用量比為:0.09mmol︰0.1mmol︰0.1mmol。

本發(fā)明的第五個方面是提供一種氯霉素抗體,由本發(fā)明第三個方面所述的氯霉素抗原免疫動物制備得到。

本發(fā)明的第六個方面是提供由本發(fā)明第五個方面所述的氯霉素抗體制備的氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒。

本發(fā)明的第七個方面是提供本發(fā)明第一個方面所述的氯霉素半抗原或本發(fā)明第三個方面所述的氯霉素抗原在制備氯霉素抗體中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第八個方面是提供本發(fā)明第五個方面所述的氯霉素抗體或本發(fā)明第六個方面所述的氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒在檢測動物源性食品中氯霉素殘留的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的氯霉素半抗原既最大程度地保留了氯霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu),又通過化學(xué)合成改造引入了可以與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的-COOH,合成方法簡單,純度、產(chǎn)率較高;用該半抗原作為原料,制備適于動物免疫的抗原體系免疫動物,所得抗體的效價、特異性、親和力都比較好;所得的抗體用于酶聯(lián)免疫試劑盒,使用方便、檢測成本低、檢測方法高效、準(zhǔn)確、快速、可同時檢測大批量的樣本,適于動物源性食品中氯霉素殘留的現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。本發(fā)明的氯霉素半抗原在氯霉素的檢測中發(fā)揮重要作用。

附圖說明

圖1為氯霉素半抗原合成路線圖。

圖2為氯霉素半抗原核磁共振氫譜圖。

圖3為氯霉素ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明,而不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1:氯霉素半抗原的合成

步驟1:

1、稱取1g氯霉素于100mL的圓底玻璃瓶中,往其中分別加入750mg叔丁基二甲基氯硅烷(TBS-Cl)、400mg咪唑和5mL無水二甲基甲酰胺(DMF)。選擇合適大小的小磁石置于圓底玻璃瓶中,用錫箔紙封好瓶口。將圓底玻璃瓶放在磁力攪拌器上,調(diào)節(jié)適宜的轉(zhuǎn)數(shù),室溫攪拌。同時用薄層色譜法(TLC)跟蹤原料反應(yīng)完全,此反應(yīng)可在1h內(nèi)反應(yīng)完全,且此過程的最適展開劑為乙酸乙酯:正己烷:乙酸=7:3:0.1。

2、薄層色譜法監(jiān)控反應(yīng)完全后,用量筒量取50mL乙酸乙酯稀釋反應(yīng)液,將稀釋后的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。往分液漏斗中加入10mL 0.1M HCl,手動搖晃5min,將其固定在鐵架臺上靜置10min,釋放下層溶液于小燒杯中,上層有機(jī)相留在分液漏斗。同樣,用10mL飽和NaCO3和10mL飽和NaCl對分液漏斗中的有機(jī)相進(jìn)行依次洗滌。經(jīng)三次洗滌后,將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至錐形瓶中,燒杯中的水相轉(zhuǎn)移至分液漏斗,用20mL乙酸乙酯對其進(jìn)行反提,棄去下層,合并上層有機(jī)相于錐形瓶。往錐形瓶中加入適量無水NaSO4進(jìn)行干燥,無水NaSO4結(jié)塊即可。

3、取干凈的200mL的圓底玻璃瓶,稱量可得瓶凈重163.7041g。將錐形瓶中的有機(jī)相轉(zhuǎn)移至該圓底玻璃瓶,用少量的乙酸乙酯多次潤洗錐形瓶,并將潤洗液合并到圓底玻璃瓶中置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干(水浴溫度為40℃,轉(zhuǎn)數(shù)60),未完全旋干則用氮吹儀氮吹至完全干燥。稱量可得圓底玻璃瓶和反應(yīng)產(chǎn)物重165.3077g。其中反應(yīng)產(chǎn)物(含TBS-氯霉素)的質(zhì)量為1.6036g。

4、純化反應(yīng)產(chǎn)物。往圓底玻璃瓶中加入8mL甲醇溶液溶解樣品,待完全溶解后吸450μL于2mL離心管中,再往離心管中加入約1500μL的甲醇溶液,混勻后進(jìn)行跑大板純化。此過程使用的展開劑為乙酸乙酯:正己烷:乙酸=70:30:1。跑完大板后,刮下含藥品的硅膠粉部分,碾碎,置于燒杯中。往燒杯中加入適宜的乙酸乙酯攪拌,放在超聲儀上超聲10min,同樣的步驟,直至洗下所有的藥品(通過點小板來檢測是否還有藥品)。用濾膜過濾所有的洗脫液于圓底玻璃瓶,空瓶重:163.6041g,將圓底玻璃瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋干。旋干后得到的圓底玻璃瓶重(含藥品):164.5787g。此時,純化后的反應(yīng)產(chǎn)物的量為0.9746g。

步驟2:

1、用4mL二氯甲烷溶解上述步驟所得的產(chǎn)物,吸取303.7μL于2mL離心管中,用氮?dú)獯蹈?,封口,置?℃保存。圓底玻璃瓶所剩的900mg轉(zhuǎn)移至新的100mL的圓底玻璃瓶中,瓶凈重為:111.4161g,再用6mL二氯甲烷分批次潤洗干凈轉(zhuǎn)移。往圓底玻璃瓶中分別加入0.8236g丁二酸酐、0.2514g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、200μL三乙胺。選擇合適大小的小磁石置于圓底玻璃瓶中,用錫箔紙封好瓶口。將圓底玻璃瓶放在磁力攪拌器上,調(diào)節(jié)適宜的轉(zhuǎn)數(shù),室溫攪拌。同時用薄層色譜法(TLC)跟蹤原料反應(yīng)完全,此反應(yīng)約在6h內(nèi)反應(yīng)完全,且此過程的最適展開劑為乙酸乙酯:二氯甲烷:乙酸=6:4:0.1。

2、薄層色譜法監(jiān)控反應(yīng)完全后,用量筒量取50mL乙酸乙酯稀釋反應(yīng)液,將稀釋后的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。往分液漏斗中加入10mL飽和NH4Cl,手動搖晃5min,將其固定在鐵架臺上靜置10min,釋放下層溶液于小燒杯中,上層有機(jī)相留在分液漏斗。同樣,再用10mL飽和NH4Cl對分液漏斗中的有機(jī)相再一次洗滌。經(jīng)兩次洗滌后,將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至錐形瓶中,燒杯中的水相轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,用20mL乙酸乙酯對其進(jìn)行反提,棄去下層,合并上層有機(jī)相于錐形瓶中。往錐形瓶中加入適量無水NaSO4進(jìn)行干燥,無水NaSO4結(jié)塊即可。

3、取干凈的200mL圓底玻璃瓶,稱量可得瓶凈重163.6046g。將錐形瓶中的有機(jī)相轉(zhuǎn)移至該圓底玻璃瓶中,用少量的乙酸乙酯多次潤洗錐形瓶,并將潤洗液合并到圓底玻璃瓶中置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干(水浴溫度為40℃,轉(zhuǎn)數(shù)60),未完全旋干則用氮吹儀氮吹至完全干燥。稱量可得圓底玻璃瓶(含反應(yīng)產(chǎn)物琥珀?;?TBS-氯霉素)重164.6587g。其中反應(yīng)產(chǎn)物(含琥珀?;?TBS-氯霉素)的量為1.0541g。

步驟3:

1、用2mL甲醇溶液溶解樣品,吸取100μL于2mL離心管中,用氮?dú)獯蹈?,封口,置?℃保存。剩余部分樣品置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干,稱量得藥品重量為954.94mg。往樣品中分別加入3mL吡啶、6mL乙腈、1.780mL 40%HF,整個加樣過程,圓底玻璃瓶應(yīng)置于冰盒中,冰浴冷卻,。待冷卻后將圓底玻璃瓶置于磁力攪拌器上,放入適宜大小的磁力攪拌子,調(diào)節(jié)適宜轉(zhuǎn)數(shù),室溫攪拌過夜。轉(zhuǎn)天早晨用薄層色譜法(TLC)跟蹤原料反應(yīng)完全,此反應(yīng)約在9.5h內(nèi)反應(yīng)完全,且此過程的最適展開劑為乙酸乙酯:二氯甲烷:乙酸=7:3:0.1。

2、薄層色譜法監(jiān)控反應(yīng)完全后,用量筒量取50mL乙酸乙酯稀釋反應(yīng)液,將稀釋后的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。往分液漏斗中加入10mL 0.1M HCl,手動搖晃5min,將其固定在鐵架臺上靜置10min,釋放下層溶液于小燒杯中,上層有機(jī)相留在分液漏斗。同樣,再用10mL 0.1M HCl、10mL飽和NaCl、10mL飽和NaCl對分液漏斗中的有機(jī)相進(jìn)行依次洗滌。經(jīng)四次洗滌后,將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至錐形瓶中,燒杯中的水相轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,用20mL乙酸乙酯對其進(jìn)行反提,棄去下層,合并上層有機(jī)相于錐形瓶中。往錐形瓶中加入適量無水NaSO4進(jìn)行干燥,無水NaSO4結(jié)塊即可。

3、取干凈的圓底玻璃瓶,稱量可得瓶凈重163.5687g。將錐形瓶中的有機(jī)相轉(zhuǎn)移至該圓底玻璃瓶中,用少量的乙酸乙酯多次潤洗錐形瓶,并將潤洗液合并到圓底玻璃瓶中置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干(水浴溫度為40℃,轉(zhuǎn)數(shù)60),未完全旋干則用氮吹儀氮吹至完全干燥。稱量可得圓底玻璃瓶(含反應(yīng)產(chǎn)物琥珀酰基-氯霉素)重164.1727g。其中反應(yīng)產(chǎn)物(含琥珀?;?氯霉素)的量為0.604g。

4、因為產(chǎn)物不純,含兩種物質(zhì),所以通過使用柱層析技術(shù)將不同組分分離開。濕法裝柱,硅膠高度約為30cm,硅膠上層裝入約0.5cm的無水硫酸鈉,防止添加溶劑時使得樣品層不再整齊。裝柱完備后,在柱子上端使用加壓泵進(jìn)行加壓,使得柱子更結(jié)實。再用展開劑(乙酸乙酯:二氯甲烷:乙酸=7:3:0.1)“走柱子”。將樣品用少量的展開劑溶解后上樣。上樣完畢接著用同樣的展開劑洗脫,用錐形瓶接洗脫液,將不同組分分離開,分離的過程通過點小板來確定樣品是否洗脫及分別收集。將收集好的樣品過濾,除去一同洗下的硅膠后,轉(zhuǎn)移至干凈的圓底玻璃瓶,旋干并稱重。最先洗脫出的物質(zhì),旋干并氮吹后所得質(zhì)量為351.9mg。后洗脫出的產(chǎn)物,旋干并氮吹后所得質(zhì)量為280.6mg。

實施例2:氯霉素半抗原的鑒定

取上述實施例1的產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測定,如圖2所示,核磁共振數(shù)據(jù)如下,說明半抗原合成成功:

1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.29(s,1H),8.57(dd,J=25.4,8.9Hz,1H),8.35-7.91(m,1H),7.61(dd,J=14.3,8.8Hz,1H),6.45(d,J=3.6Hz,1H),5.02(s,1H),4.24(dd,J=7.5,4.9Hz,2H),3.59(s,1H),3.49-3.13(m,3H),2.76(s,1H),2.09(s,3H)。

實施例3:氯霉素抗原

向0.09mmol所述琥珀?;让顾匕肟乖屑尤?.6ml的無水DMF,混勻后,加入0.1mmol的DCC和0.1mmol的NHS活化半抗原上的羧基基團(tuán),攪拌反應(yīng)過夜后,離心去沉淀,將溶液平均分為三份,分別逐滴加入到不同的載體蛋白溶液中,所述載體蛋白為BSA,OVA,KLH等,所述溶解蛋白的緩沖液為碳酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液,所用蛋白的量按照半抗原與蛋白的摩爾比15-40︰1計算。待羧基活化的半抗原與蛋白分子上的氨基偶聯(lián)反應(yīng)過夜后,將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到半透膜中,使用10mM的pH7.2的PBS緩沖液于4℃透析3-5天,得到包被原,經(jīng)紫外鑒定,氯霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。將透析完畢的溶液按照所用載體蛋白的量用PBS稀釋成1mg/ml。

實施例4:抗血清制備

將1mg/ml的氯霉素-KLH或氯霉素-BSA作為免疫原與等體積的弗氏佐劑混合攪拌乳化,首次免疫用弗氏完全佐劑,以后免疫使用弗氏不完全佐劑,每間隔10至15天對小鼠免疫一次,第三次免疫后小鼠眼眶采血檢測血清效價和抗體特異性。

實施例5:血清效價及抗體特異性檢測

將1mg/ml的氯霉素-OVA包被原使用碳酸鹽緩沖液稀釋合適的倍數(shù)后,加入到96孔酶標(biāo)板中于37℃包被3小時,將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品使用樣品稀釋液(PBS中含有0.1%的吐溫20和明膠)稀釋后,每孔加入50ul,以樣品稀釋液作為非抑制孔對照,隨后加入經(jīng)過樣品稀釋液稀釋合適倍數(shù)的血清,于37℃溫浴30min后,洗脫,再加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗反應(yīng)30min,洗脫酶標(biāo)二抗后,加入含有OPD或TMB的底物緩沖液顯色5-10min,于酶標(biāo)儀檢測OD值。

本發(fā)明以氯霉素-OVA作為包被原,氯霉素-KLH作為免疫原所獲得的抗血清,所建立的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示,抑制中濃度為9ng/ml。

以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了詳細(xì)描述,但其只是作為范例,本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此,在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改,都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

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