本發(fā)明涉及一種半抗原及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及一種多殺菌素半抗原及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多殺菌素(spinosad)是從土壤放線菌刺糖多孢菌(saccharopolysporaspinosa)分離出來的一種廣譜殺蟲劑，具有殺蟲活性高，易降解、對有益生物毒性低等優(yōu)點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用于多種農(nóng)作物害蟲的防治，而多殺菌素殘留超標(biāo)可能會影響食品安全以及環(huán)境安全，因此迫切需要建立靈敏度高，特異性強(qiáng)，簡便易行的多殺菌素檢驗(yàn)方法。

多殺菌素檢測方法包括高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫測定法。高效液相色譜法精確可靠、靈敏度高，檢測極限可達(dá)到0.01μg/g，但前處理步驟多，回收率偏低。酶聯(lián)免疫測定具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、對儀器設(shè)備和人員素質(zhì)要求低以及樣品前處理簡單等優(yōu)點(diǎn)，適于現(xiàn)場監(jiān)控和大規(guī)模樣品篩選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種多殺菌素半抗原及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種多殺菌素半抗原，其分子結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種如本發(fā)明第一個(gè)方面所述的多殺菌素半抗原的制備方法，包括以下步驟：步驟1，取多殺菌素，加入0.8-1.2n硫酸(h2so4)中，75-85℃反應(yīng)完全，純化，得到c-17-多殺菌素，其分子結(jié)構(gòu)式如式(2)所示，其中多殺菌素、硫酸的用量比為：1g︰10-20ml；步驟2，取c-17-多殺菌素，加入二氯甲烷溶解，加入丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶，室溫反應(yīng)完全，純化，得到權(quán)利要求1所述的多殺菌素半抗原，其中，c-17-多殺菌素、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的用量比為：600mg︰100-750mg︰12.2-122mg，

優(yōu)選地，上述步驟(1)中，硫酸的濃度為1n。

優(yōu)選地，上述步驟(1)中，殺菌素、硫酸的用量比為：1g︰12-18ml，更優(yōu)選為1g︰15ml。優(yōu)選地，上述步驟(2)中，c-17-多殺菌素、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的用量比為：600mg︰400-750mg︰80-122mg，更優(yōu)選為：600mg︰750mg︰122mg。

本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供一種多殺菌素抗原，由本發(fā)明第一個(gè)方面所述的多殺菌素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，其分子結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供一種制備如本發(fā)明第三個(gè)方面所述的多殺菌素抗原的方法，包括以下步驟：步驟a，取權(quán)利要求1所述的多殺菌素半抗原，加入無水二甲基甲酰胺(dmf)混勻后，加入二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，室溫反應(yīng)過夜，其中，多殺菌素半抗原、二環(huán)己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的用量比為：0.09mmol︰0.09-0.18mmol︰0.09-0.18mmol；步驟b，離心，取溶液，將溶液緩慢加入載體蛋白溶液中，所用載體蛋白的量按照半抗原與載體蛋白的摩爾比15-40︰1計(jì)；步驟c，反應(yīng)完全后，透析，得到多殺菌素抗原。

優(yōu)選地，上述步驟a中，多殺菌素半抗原、二環(huán)己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的用量比為：0.09mmol︰0.12mmol︰0.12mmol。

本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供一種多殺菌素抗體，由本發(fā)明第三個(gè)方面所述的多殺菌素抗原免疫動(dòng)物制備得到。

本發(fā)明的第六個(gè)方面是提供由本發(fā)明第五個(gè)方面所述的多殺菌素抗體制備的多殺菌素酶聯(lián)免疫試劑盒。

本發(fā)明的第七個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的多殺菌素半抗原或本發(fā)明第三個(gè)方面所述的多殺菌素抗原在制備多殺菌素抗體中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第八個(gè)方面是提供本發(fā)明第五個(gè)方面所述的多殺菌素抗體或本發(fā)明第六個(gè)方面所述的多殺菌素酶聯(lián)免疫試劑盒在檢測動(dòng)物源性食品中多殺菌素殘留的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的多殺菌素半抗原既最大程度地保留了多殺菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，又通過化學(xué)合成改造引入了可以與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的-cooh，合成方法簡單，純度、產(chǎn)率較高；用該半抗原作為原料，制備適于動(dòng)物免疫的抗原體系免疫動(dòng)物，所得抗體的效價(jià)、特異性、親和力都比較好；所得的抗體用于酶聯(lián)免疫試劑盒，使用方便、檢測成本低、檢測方法高效、準(zhǔn)確、快速、可同時(shí)檢測大批量的樣本，適于動(dòng)物源性食品中多殺菌素殘留的現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。本發(fā)明的多殺菌素半抗原在多殺菌素的檢測中發(fā)揮重要作用。

附圖說明

圖1為多殺菌素半抗原合成路線圖。

圖2為多殺菌素半抗原核磁共振碳譜圖。

圖3為多殺菌素elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：多殺菌素半抗原的合成

步驟1：

稱取1g即1.37mmol多殺菌素于50ml茄型燒瓶中，溶解于30ml1n硫酸中，加熱至80℃，磁力攪拌反應(yīng)，tlc板監(jiān)測反應(yīng)完成(展開劑為乙酸乙酯︰石油醚＝7︰3)；用50ml稀硫酸洗滌沉淀，加入30ml二氯甲烷溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用飽和氯化鈉溶液洗滌兩次，收集有機(jī)相；用無水硫酸鈉干燥后，過濾旋干溶劑，經(jīng)200-300目硅膠柱層析純化得到半抗原中間體，洗脫劑為乙酸乙酯︰石油醚，體積比為7︰3，得率為71.4％。

步驟2：

稱取600mg半抗原中間體于棕色瓶中，加入750mg丁二酸酐與122.2mg4-二甲氨基吡啶，溶于20ml二氯甲烷中，室溫?cái)嚢?，tlc板監(jiān)控至反應(yīng)完全(展開劑為乙酸乙酯︰二氯甲烷︰醋酸＝7︰3︰0.1)；氮?dú)獯蹈珊?，?0ml乙酸乙酯溶解沉淀，并用飽和氯化銨溶液洗滌兩次，再用20ml乙酸乙酯反提水相，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥后，過濾旋干溶劑，經(jīng)經(jīng)200-300目硅膠柱層析純化得到半抗原，洗脫劑為乙酸乙酯︰二氯甲烷︰醋酸，體積比為7︰3︰0.1，得率為80％。

實(shí)施例2：多殺菌素半抗原的鑒定

取上述實(shí)施例1的產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜和碳譜測定，核磁共振數(shù)據(jù)如下，說明半抗原合成成功：

1hnmr(500mhz,cd3od)δ7.09(s,1h),5.93(d,j＝9.8hz,1h),5.86(dt,j＝9.8,2.8hz,1h),5.03–4.95(m,1h),4.87(d,j＝1.7hz,2h),4.70–4.61(m,1h),4.34(dd,j＝12.7,7.1hz,1h),3.60–3.52(m,3h),3.52(s,3h),3.48–3.44(m,9h),3.43(t,j＝3.3hz,1h),3.35(s,6h),3.08(dt,j＝18.8,7.2hz,2h),2.98-2.96(m,1h),2.91–2.83(m,1h),2.64–2.58(m,4h),2.47(dd,j＝13.4,3.2hz,1h),2.41–2.30(m,1h),2.22–2.12(m,1h),2.04–1.93(m,1h),1.66–1.27(m,11h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.09(d,j＝6.7hz,3h),0.99–0.88(m,1h),0.83(t,j＝7.5hz,3h).

13cnmr(126mhz,meod)δ203.44,175.96,173.93,173.92,150.37,145.06,130.66,129.74,97.06,83.55,82.52,78.63,77.96,77.91,76.29,69.10,61.14,59.15,57.72,51.06,49.85,47.46,46.72,42.87,42.55,38.54,37.44,35.01,33.58,31.11,30.27,29.84,29.28,22.34,18.13,16.45,9.62.

實(shí)施例3：多殺菌素抗原

向0.09mmol所述琥珀?；鄽⒕匕肟乖屑尤?.6ml的無水dmf，混勻后，加入0.12mmol的dcc和0.12mmol的nhs活化半抗原上的羧基基團(tuán)，攪拌反應(yīng)過夜后，離心去沉淀，將溶液平均分為三份，分別逐滴加入到不同的載體蛋白溶液中，所述載體蛋白為bsa，ova，klh等，所述溶解蛋白的緩沖液為碳酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液，所用蛋白的量按照半抗原與蛋白的摩爾比15-40︰1計(jì)算。待羧基活化的半抗原與蛋白分子上的氨基偶聯(lián)反應(yīng)過夜后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到半透膜中，使用10mm的ph7.2的pbs緩沖液于4℃透析3-5天，得到包被原，經(jīng)紫外鑒定，多殺菌素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。將透析完畢的溶液按照所用載體蛋白的量用pbs稀釋成1mg/ml。

實(shí)施例4：抗血清制備

將1mg/ml的多殺菌素-klh或多殺菌素-bsa作為免疫原與等體積的弗氏佐劑混合攪拌乳化，首次免疫用弗氏完全佐劑，以后免疫使用弗氏不完全佐劑，每間隔10至15天對小鼠免疫一次，第三次免疫后小鼠眼眶采血檢測血清效價(jià)和抗體特異性。

實(shí)施例5：血清效價(jià)及抗體特異性檢測

將1mg/ml的多殺菌素-ova包被原使用碳酸鹽緩沖液稀釋合適的倍數(shù)后，加入到96孔酶標(biāo)板中于37℃包被3小時(shí)，將多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品使用樣品稀釋液(pbs中含有0.1％的吐溫20和明膠)稀釋后，每孔加入50ul，以樣品稀釋液作為非抑制孔對照，隨后加入經(jīng)過樣品稀釋液稀釋合適倍數(shù)的血清，于37℃溫浴30min后，洗脫，再加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗反應(yīng)30min，洗脫酶標(biāo)二抗后，加入含有opd或tmb的底物緩沖液顯色5-10min，于酶標(biāo)儀檢測od值。

本發(fā)明以多殺菌素-ova作為包被原，多殺菌素-klh作為免疫原所獲得的抗血清，所建立的elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，抑制中濃度為287ng/ml。

以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。