苯乙醇胺a半抗原、抗原及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及苯己醇胺A半抗原、抗原、單克隆抗 體制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]目-受體激動劑在現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中被用于作為飼料添加劑，如之前為人們所熟知的 克倫特羅等，送一類藥物可W減少脂肪，增加瘦肉，提高豬的單位經(jīng)濟(jì)價值，但是它們都有 危險的副作用，輕則導(dǎo)致必律不整，嚴(yán)重一點(diǎn)就會導(dǎo)致必臟病。
[0004] 苯己醇胺A，又稱"克倫己胺"，化學(xué)式；2-[4- (4-硝基苯基）了基-2-基氨 基]-1-甲氧基苯己醇，分子式；C19肥4N204,分子量；344,是新一代的瘦肉精。四川省廣安 市廣安區(qū)要山鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站對某養(yǎng)豬場例行違禁藥物監(jiān)測中，用萊克多己胺測試卡分別檢 測母豬、仔豬和育肥豬尿液，發(fā)現(xiàn)該場育肥豬尿檢呈陽性，之后確認(rèn)是新型添加物苯己醇胺 A。送種瘦肉精新品種棍現(xiàn)市場，再次敲響中國食品安全警鐘。因此被農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第1519 號公告列為"禁止在和動物飲水中使用的物質(zhì)"。公告稱，根據(jù)《飼料和飼料添加劑管理?xiàng)l 例》有關(guān)規(guī)定，禁止在飼料和動物飲水中使用苯己醇胺A等物質(zhì)。各級畜牧飼料管理部口要 加強(qiáng)日常監(jiān)管和監(jiān)督檢測，嚴(yán)肅查處在飼料生產(chǎn)、經(jīng)營、使用和動物飲水中違禁添加苯己醇 胺A等物質(zhì)的違法行為。
[0005] 目前，檢測苯己醇胺A的方法主要為儀器方法--高效液相色譜質(zhì)譜法，送類方法 需要專業(yè)的儀器設(shè)備和專業(yè)的人員進(jìn)行操作，前處理繁雜，費(fèi)時，不適合大量樣本的篩查和 基層人員操作。免疫化學(xué)分析由于在抗原抗體的定性定量方面獨(dú)特的優(yōu)勢和操作簡便快 速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)了理化分析的不足。苯己醇胺A人工抗 原的制備為送一方法的實(shí)施奠定了重要基礎(chǔ)。影響免疫化學(xué)分析質(zhì)量的根本因素是抗體的 特異性與親和性，送些性質(zhì)又決定于免疫半抗原分子的結(jié)構(gòu)，因此免疫半抗原的分子設(shè)計 與合成就是產(chǎn)生特異性抗體和建立小分子獸藥殘留快速檢測技術(shù)的最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵的步 驟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種苯己醇胺A半抗原、抗原、特異性抗體制備方法及其應(yīng) 用。
[0007] 本發(fā)明提供的苯己醇胺A半抗原，其結(jié)構(gòu)為式I所示：
式I 本發(fā)明還保護(hù)式I所示化合物的制備方法，包括如下步驟： 苯己醇胺A138mg溶于IOmlImol/L肥1和4ml二甲基亞諷中；加入 鋒粉100mg，8(TC水浴攬拌反應(yīng)30min，冷卻過濾，濾液調(diào)抑8.0,20ml己酸己醋萃取2 次，合并有機(jī)相，真空干燥；將殘留物IOmlDMF溶解，加入碳酸鐘60mg，賄己酸82mg，9(TC加 熱反應(yīng)化，降低至室溫，加入50ml蒸傭水，IM鹽酸調(diào)抑6. 0, 50ml己酸己醋萃取2次，合并 有機(jī)相，無水硫酸鋼干燥，過濾，真空干燥濾液，殘留物即為半抗原。
[0008] 本發(fā)明所提供的苯己醇胺A抗原，是將苯己醇胺A半抗原與載體蛋白偶聯(lián)獲得的 抗原。
[0009] 所述苯己醇胺A抗原，其結(jié)構(gòu)為式II所示：
本發(fā)明還保護(hù)所述苯己醇胺A抗原的制備方法，包括如下步驟： 稱取半抗原IOmg溶于2mlDMF，加入邸C4. 3mg，N服5.Img,室溫攬拌反應(yīng)化；50mg BSA溶于5ml0.IM碳酸氨鋼緩沖液，將上述活化藥物逐滴 加入到蛋白溶液中，室溫攬拌過夜，PBS4度透析72小時，期間換透析液6 次。將透析液在無菌條件下過0.22Um孔徑的濾膜，分裝于安培瓶中，-2(TC保存。
[0010] 同法合成包被原。
[0011] 常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白度SA)，卵清蛋白（OVA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲狀腺蛋白（TG)或血藍(lán)蛋白（KLH)等。
[0012] 所述苯己醇胺A抗原可W作為免疫原制備苯己醇胺A特異性抗體，也可W作為包 被原制備酶柄板。
[0013] 所述抗體具體可為單克隆抗體。
[0014] 式I所示產(chǎn)物、所述苯己醇胺A抗原、所述抗體均可應(yīng)用于檢測苯己醇胺A。
[0015] 本發(fā)明還公布了應(yīng)用苯己醇胺A抗原和苯己醇胺A單克隆抗體制備得到的酶聯(lián)免 疫試劑盒。
[0016] 所述酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，是由包被有苯己醇胺A抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗體工作 液、苯己醇胺A系列標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色液、終止液、濃縮復(fù)溶液、濃縮洗涂液。
[0017] 本發(fā)明依靠免疫學(xué)、免疫化學(xué)基本原理和殘留分析技術(shù)手段，設(shè)計、合成小分子目 標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)，制備有效人工抗原，免疫動物制備針對小分子分析物 的特異性抗體。利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)，定量的檢測樣本中微量小分子目標(biāo)分 析物，具有特異、靈敏、準(zhǔn)確、快速、方便、廉價等特點(diǎn)。本發(fā)明制備方法簡便可行、成本較低， 半抗原產(chǎn)率較高。本發(fā)明克服了現(xiàn)有檢測技術(shù)中對苯己醇胺A樣品預(yù)處理復(fù)雜、耗時、且需 要大量有機(jī)溶劑萃取，W及在檢測過程中要用到精密昂貴的檢測儀器而不適于推廣使用等 缺點(diǎn)。本發(fā)明的苯己醇胺A人工抗原，通過免疫動物可產(chǎn)生了針對苯己醇胺A的特異性抗 體，用于快速檢測食品中的苯己醇胺A殘留，具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度高、特 異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0018] 圖1為苯己醇胺A酶聯(lián)免疫檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019]W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。W下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置H次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。人血清白蛋白簡稱HSA。
[0020] 實(shí)施例1、制備苯己醇胺A半抗原 苯己醇胺A138mg溶于IOmlImol/L肥1和4ml二甲基亞諷中；加入 鋒粉100mg，8(TC水浴攬拌反應(yīng)30min，冷卻過濾，濾液調(diào)抑8.0,20ml己酸己醋萃取2 次，合并有機(jī)相，真空干燥；將殘留物IOmlDMF溶解，加入碳酸鐘60mg，賄己酸82mg，9(TC加 熱反應(yīng)化，降低至室溫，加入50ml蒸傭水，IM鹽酸調(diào)抑6. 0, 50ml己酸己醋萃取2次，合并 有機(jī)相，無水硫酸鋼干燥，過濾，真空干燥濾液，殘留物即為半抗原。
[0021] 苯己醇胺A半抗原的結(jié)構(gòu)式如式I所示。
[0022] 實(shí)施例2、苯己醇胺A人工抗原的制備和鑒定 一、苯己醇胺A免疫抗原的合成 稱取半抗原IOmg溶于2mlDMF，加入邸C4. 3mg，N服5.Img,室溫攬拌反 應(yīng)化；50mgBSA溶于5ml0.IM碳酸氨鋼緩沖液，將上述活化藥物逐滴加入到蛋白溶 液中，室溫攬拌過夜，PBS4°C透析72小時，期間換透析液6次。將透析液在無菌條件下過 0.22Um孔徑的濾膜，分裝于安培瓶中，-2(TC保存。
[0023] 苯己醇胺A免疫抗原的結(jié)構(gòu)式如式II所示。
[0024] 二、苯己醇胺A包被抗原的合成 稱取半抗原IOmg溶于2mlDMF，加入邸C4. 3mg，N服5.Img,室溫攬拌反 應(yīng)化；50mgOVA溶于5ml0.IM碳酸氨鋼緩沖液，將上述活化藥物逐滴加入到蛋白溶 液中，室溫攬拌過夜，PBS4°C透析72小時，期間換透析液6次。將透析液在無菌條件下過 0.22Um孔徑的濾膜，分裝于安培瓶中，-2(TC保存。
[0025] 二、苯己醇胺A人工抗原的鑒定 按合成苯己醇胺A免疫抗原和包被抗原反應(yīng)所用的半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比 例，分別進(jìn)行紫外（200nnT400nm)掃描鑒定，并通過比較H者在同一波長下的吸光值計算 其結(jié)合比。產(chǎn)物的紫外光譜圖與載體蛋白相比發(fā)生了變化，說明半抗原已經(jīng)與載體蛋白成 功偶聯(lián)制得苯己醇胺A人工抗原。經(jīng)計算，苯己醇胺A半抗原分子與BSA分子的結(jié)合比為 16.8:1，苯己醇胺A半抗原分子與OVA分子的結(jié)合比為11. 5:1。
[0026] 實(shí)施例3、酶標(biāo)單抗的制備和特異性鑒定 一、苯己醇胺A單抗的制備 1、用上述制備出的免疫原按IOOyg/只，W生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體 積混勻，頸背部皮下注射免疫6~8周齡Ba化/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天W免疫原與 弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天W免疫復(fù)合物IOOyg/只，不加 弗氏佐劑再追加免疫一次。
[0027] 2、按常規(guī)方法進(jìn)行，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞 (SP2/0)混合，然后在45s內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑（PEG4000)進(jìn)行融合，用HAT培養(yǎng)基懸 浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37C，5 %C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天 后用HT培養(yǎng)基半換液，9天時候進(jìn)行全換液。
[0028] 3、細(xì)胞融合后，待細(xì)胞長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì) 胞。初選采用間接化ISA方法，W包被抗原（預(yù)先用方陣法常規(guī)滴定其最佳包被濃度和 陽性血清稀釋度）包被酶標(biāo)板，加入被測孔培養(yǎng)上清，賠育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和 IgM-HRP,OPD進(jìn)行顯色反應(yīng)。篩選出的陽性孔再用間接競爭化ISA方法篩選，先將細(xì)胞上 清與100yg/mL的苯己醇胺A等體積混合，37C水浴作用30min，再加入到包被好的酶標(biāo)板 中。同時用PBS取代苯己醇胺A作對照，其余步驟同上。若經(jīng)苯己醇胺A阻斷后的0〇45。皿 值下降到對照孔的50%W下，則判為陽性，經(jīng)2^3次檢測都為陽性的孔，立即用有限稀釋法 進(jìn)行亞克隆化。
[0029] 4、將2^3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液用間接化ISA測定 效價，凍存；并取8~10周齡Ba化/c小鼠腹腔注射液體石蠟0. 5mL/只，7~10日后腹腔注射 雜交瘤細(xì)胞廣2XIO6/只，7^10日后抽取小鼠腹水，離必取上清，測定效價，并凍存?zhèn)溆谩?br>[0030] 二、酶標(biāo)抗體的制備 (1) 稱取辣根過氧化物酶（HRP) 2mg溶解于0.5血水中，加入0.5血0.06mol/L 化1〇4溶液，4°C避光作用30min; (2) 加入160mmol/L的己二醇0. 5mL,室溫作用30min; (3) 加入步驟一制備的苯己醇胺A單抗2mg,混勻后裝入處理過的透析袋中，置1000 血的0. 05mmol/L碳酸鋼緩沖液中透析，4°C過夜； (4) 透析液吸至10血的離必管中，加0. 25血5g/L的NaBH4溶液，混勻后置4°C2h; (5) 加入等體積的飽和硫酸倭溶液，4°C作用30min后4°C下3000r/min離必25min, 棄上清； (6) 將沉淀溶于1. 5血0. 02mol/LpH7. 4的PBS中，吸入透析袋內(nèi)，在0. 02mol/LpH 7. 4PBS透析，4°C過夜（中途更換PBS3次）； (7) 將透析袋中液體吸至微量離必管中，4°C下100(K)r/min離