一種鄰苯二甲酸二辛酯半抗原及人工抗原合成方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說，本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二辛 酯半抗原及人工抗原合成方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸二（α -乙基己）酯（Di (2-ethylhexyl) phthalate)，英文縮寫 DEHP, 又名鄰苯二甲酸二辛酯，分子量為390. 5, 25°C時(shí)該品在水中溶解度〈0.01%，溶于大多數(shù) 有機(jī)溶劑和烴類，其結(jié)構(gòu)式為：
[0003]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種DEHP半抗原，特征在于分子結(jié)構(gòu)式為：
η為1~6的自然數(shù)。
2. -種DEHP人工抗原，是由權(quán)利要求1所述的DEHP半抗原與載體蛋白結(jié)合而成，其特 征在于：所述DEHP人工抗原分子結(jié)構(gòu)式為：
η為1~6的自然數(shù)；所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白。
3. 如權(quán)利要求1所述DEHP半抗原的合成方法，其特征在于包括以下步驟： (1)按投料比為3:1將濃硝酸與DEHP置于圓底燒瓶中，冰浴條件下滴加到2倍于濃硝 酸量的濃硫酸中，磁力攪拌，反應(yīng)至室溫，再60°C回流反應(yīng)5h，期間用TLC監(jiān)控。用ImoL/ L的氫氧化鈉溶液中和反應(yīng)液至弱堿性，乙酸乙酯萃取3次，有機(jī)相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸 干得到粗的硝化產(chǎn)物DEHP-NO2，過硅膠柱，收集洗脫液為V/V為2:1~3:1的氯仿/環(huán)己烷 洗脫相，洗脫液濃縮至干，得到純化的硝化產(chǎn)物DEHP-NO 2 ; ⑵按投料比為1:2:2將DEHP-N02、NH4CU鐵粉置于圓底燒瓶中，添加到適量的70% 乙醇溶液中，磁力攪拌，50°C回流反應(yīng)5h，期間用TLC監(jiān)控；反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入 IOOmL無水乙醇，濾去鐵粉，收集濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干；向濃縮液中加30mL水，用乙 酸乙酯萃取3次，收集有機(jī)相，蒸干，得到粗產(chǎn)物DEHP-NH 2 ;過硅膠柱，收集洗脫液為V/V為 5:1~4:1的氯仿/甲醇洗脫相，洗脫液濃縮至干，得到純化的還原產(chǎn)物DEHP-NH 2 ; (3)按投料比為1:2~1:3將DEHP-NH2與鹵代酸鹽置于圓底燒瓶中，并將其混合物用 少量的無水乙醇溶解，同時(shí)加入與鹵代酸鹽等量的碳酸鉀，在60°C下回流反應(yīng)，在反應(yīng)過程 中加入適量的碘化鉀作為催化劑，回流攪拌反應(yīng)5h后，停止反應(yīng)，過濾反應(yīng)混合物得到黃 棕色濾液，濃縮得到棕黃色油脂狀物質(zhì)，過硅膠柱，收集洗脫液為V/V為4:1~5:1的氯仿 /甲醇洗脫相，洗脫液濃縮至干，得到產(chǎn)物即為目標(biāo)半抗原。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述DEHP半抗原的合成方法，其特征在于：所述的鹵代酸鹽為鹵代 酸鈉，其結(jié)構(gòu)式為R-(CH2) n-COONa,其中R可為Cl或Br, η = 1~6。
5. 如權(quán)利要求2所述DEHP人工抗原的制備方法為活潑脂法與混合酸酐法，其特征在 于： 所述活潑酯方法為： (1) 將0.1 mmol的DEHP半抗原溶解于ImL的DMF中，然后在該溶液里加入等摩爾的DCC 和NHS，室溫避光反應(yīng)過夜； (2) 4°C離心去除沉淀，取上清液，并將其緩慢加入到5mL ρΗ9. 5的碳酸緩沖液中，其緩 沖液含有載體蛋白BSA或OVA，其中載體蛋白的濃度為10~15mg/mL，在4°C下反應(yīng)過夜； (3)將步驟（2)中的反應(yīng)液裝入透析袋，用0.9%的生理鹽水透析3d，得到人工抗原； 所述混合酸酐法為： (1) 將0.1 mmol DEHP半抗原溶于ImL DMF中，加入80 μ L正三丁胺，冰浴下緩慢滴加 0. 15mmol氯甲酸異丁酯，4°C攪拌反應(yīng)Ih,此為甲液； (2) 將60mg載體蛋白BSA或OVA溶于5mLlmol/L pH9. 6的碳酸氫鈉緩沖液中，此為乙 液； (3) 將甲液緩慢滴加到乙液中，4°C磁力攪拌反應(yīng)過夜，待反應(yīng)完成后，裝入透析袋，然 后用0. 9 %的生理鹽水透析3d，得到人工抗原。
6.如權(quán)利要求2所述的DEHP人工抗原的應(yīng)用，其特征在于，所述的DEHP人工抗原應(yīng)用 于制備抗DEHP多克隆抗體或單克隆抗體的制備。
【專利摘要】本發(fā)明是關(guān)于一種鄰苯二甲酸二辛酯半抗原及人工抗原合成方法及應(yīng)用，屬于免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以DEHP為原料，經(jīng)硝化反應(yīng)和還原反應(yīng)，制得帶氨基基團(tuán)的中間產(chǎn)物，再與鹵代酸鹽等試劑反應(yīng)生成帶羧基基團(tuán)的半抗原；然后通過活潑脂法或者混合酸酐法與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備人工抗原。該人工抗原可用于動物免疫制備抗DEHP的特異性抗體，對建立檢測DEHP的ELISA分析方法，具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
【IPC分類】G01N33-577, C07C229-62, G01N33-535, C07K14-77, C07K14-795, C07K16-44, C07K14-765, C07C227-18, C07K1-107
【公開號】CN104744285
【申請?zhí)枴緾N201410336147
【發(fā)明人】張挺
【申請人】廣州城市職業(yè)學(xué)院
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2014年7月15日