本發(fā)明涉及在多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中減少引物二聚體擴(kuò)增的方法。

發(fā)明背景

多重PCR由單個(gè)PCR混合物中的多個(gè)引物組組成，從而生成對(duì)不同DNA序列特異的擴(kuò)增子。通過(guò)一次性靶向多個(gè)基因，可由單個(gè)測(cè)試輪次獲得額外信息，否則需要若干倍的試劑和努力才能完成。

降低多重PCR測(cè)定靈敏度的主要障礙之一是引物二聚體(PD)的累積。PD由彼此雜交的引物分子組成，雜交的原因是成串的互補(bǔ)堿基，特別是在引物的3’端。多重PCR反應(yīng)中極高濃度下許多引物對(duì)的存在提高了引物二聚體形成的機(jī)會(huì)。一旦形成，短的PD傾向于非常有效地?cái)U(kuò)增，通過(guò)大量消耗引物和其他試劑潛在地抑制所需DNA序列的擴(kuò)增?？赏ㄟ^(guò)不同方法的組合來(lái)減少PD形成，包括特別的引物設(shè)計(jì)和修飾方法、使用熱啟動(dòng)Taq聚合酶、PCR添加劑和優(yōu)化的PCR循環(huán)條件。

已報(bào)道多種用于減少PD形成的引物設(shè)計(jì)和修飾方法。Brownie等(Nucleic Acids Res,25(16):3235-41,1997)描述了HANDS(同源標(biāo)簽輔助的無(wú)二聚體系統(tǒng))。在HANDS PCR中，所有靶標(biāo)特異性引物都在低濃度下在其5’端含有共有的尾部序列并在較高濃度下與單個(gè)尾部特異性引物混合。在至少兩個(gè)循環(huán)的靶標(biāo)特異性PCR后，對(duì)完全由尾部特異性引物驅(qū)動(dòng)的后續(xù)擴(kuò)增循環(huán)提高退火溫度。結(jié)果是，來(lái)自所有PCR產(chǎn)物的單鏈(包括所需的擴(kuò)增子和副產(chǎn)物如PD)都具有互補(bǔ)的5’和3’端，其導(dǎo)致形成相同的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。由于尾部序列的高局部濃度，短產(chǎn)物如PD中形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定且穩(wěn)定程度超過(guò)尾部特異性引物的后續(xù)退火，導(dǎo)致PD擴(kuò)增的抑制。然而，在所有引物各端均具有相同尾部序列的情況下，該方法需要靶擴(kuò)增子足夠的長(zhǎng)以最小化真實(shí)靶產(chǎn)物上莖環(huán)的抑制作用。取決于高度多重PCR中靶擴(kuò)增子的長(zhǎng)度和組成，各擴(kuò)增子的莖環(huán)的緊密度也發(fā)生變化，其可導(dǎo)致顯著失衡的擴(kuò)增。此外，該莖環(huán)可能沒(méi)有足夠穩(wěn)定到抑制長(zhǎng)引物之間的PD形成。

美國(guó)專利號(hào)5,792,607(Backman等)和美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20140329245公開了使用內(nèi)切酶IV切除引物的不可延伸3’，從而在特異性引物-模板雜交后激活引物。Dobosy等(BMC Biotechnol.11:80,2011)報(bào)道了RNA酶H依賴性PCR(rhPCR)方法，其使用RNA酶H切除位置靠近阻斷的引物的3’端的單個(gè)RNA堿基，從而在特異性引物-模板雜交后激活引物。該方法最近由IDT(集成DNA技術(shù)公司(Integrated DNA Technologies)，美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2009/0325169，PCT/US2012/030413)商業(yè)化。所有這些方法都需要引物中修飾的堿基和用于引物激活的額外酶，這導(dǎo)致較高的成本。

Peleg等(Appl.Environ.Microbiol.,75:6393–6398,2009；WO/2009/004630)報(bào)道了PCR中的DNA-RNA嵌合引物減少PD形成。雙啟動(dòng)寡核苷酸(DPO)引物(希捷科技(Seegene Technologies))已被報(bào)道用以減少PCR PD形成(Chun等，Nucleic Acids Res.35(6):e40,2007)。DPO包含兩個(gè)單獨(dú)的啟動(dòng)區(qū)域(5’端穩(wěn)定子(stabilizer)和3’端決定子(determiner))，其通過(guò)聚脫氧肌苷接頭接合。由于存在包含聚脫氧肌苷接頭的弱氫鍵的“氣泡”樣結(jié)構(gòu)，DPO引物3’端處的諸如PD的引物非特異性雜交減少。嵌合引物中的上述RNA堿基和DPO引物中的聚脫氧肌苷接頭顯著增加了引物制造的復(fù)雜程度和成本。

Scatterfield(J.Mol.Diagn.,16:163-173,2013)報(bào)道了由兩條DNA序列組成的合作引物(cooperative primer)，這兩條DNA序列通過(guò)5’至5’或5’至3’的聚乙二醇接頭接合。結(jié)果顯示使用合作引物的單重PCR反應(yīng)在添加的引物二聚體存在的情況下顯著減少了引物-引物增殖。

盡管有這些努力，PD形成仍是多重PCR中的大挑戰(zhàn)。具體而言，下一代測(cè)序(NGS)應(yīng)用中靶標(biāo)富集的多重程度極高，此時(shí)同一PCR反應(yīng)池中存在數(shù)百甚至數(shù)千種引物。所有這些引物都可潛在地形成引物二聚體。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A顯示用于擴(kuò)增兩條靶序列的PCR的第一循環(huán)和第二循環(huán)，其中t1F1、t2R1、t3F2和t1F1^R2為引物。圖1B顯示F1和R2的相互作用，以及引物二聚體的形成、擴(kuò)增和抑制。

圖2顯示F1和R2在其3’端具有7個(gè)互補(bǔ)堿基且形成引物二聚體。

圖3顯示1階段PCR擴(kuò)增(頂部小圖)和2階段PCR擴(kuò)增(底部小圖)的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果。泳道1：1重?cái)U(kuò)增子1，泳道2：1重?cái)U(kuò)增子2，泳道3-8：使用引物t1_F1^x_R2的2重，其中x分別為0、3、6、9、12和15個(gè)核苷酸。泳道M：50堿基DNA梯狀條帶。

發(fā)明詳述

定義

“擴(kuò)增子”指一段DNA或RNA，其是天然或人工的擴(kuò)增或復(fù)制事件的來(lái)源和/或產(chǎn)物。在該文義中，“擴(kuò)增”指遺傳片段或靶序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝(具體而言是擴(kuò)增子)的生成。作為擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，擴(kuò)增子可與諸如PCR產(chǎn)物的常用實(shí)驗(yàn)室術(shù)語(yǔ)互換使用。

“引物二聚體”(PD)是PCR的潛在副產(chǎn)物。PD由因引物中互補(bǔ)堿基而彼此雜交的引物分子組成。

本發(fā)明涉及一種減少多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中引物二聚體擴(kuò)增的方法。當(dāng)?shù)谝徽蛞?F1)和第二反向引物(R2)在其3’端具有互補(bǔ)區(qū)域時(shí)，可能發(fā)生引物二聚體的形成。由于引物的高濃度，該互補(bǔ)區(qū)域可以是短至2-3個(gè)核苷酸以導(dǎo)致引物二聚體擴(kuò)增。當(dāng)該互補(bǔ)區(qū)域是至少4或5個(gè)核苷酸時(shí)，不需要的引物二聚體擴(kuò)增幾乎必然會(huì)發(fā)生。

本發(fā)明的方法在第一正向引物(F1)和第二反向引物(R2)在其3’端具有互補(bǔ)區(qū)域時(shí)減少引物二聚體問(wèn)題。該方法包括以下步驟：(a)獲得第一核酸序列，其包含第一標(biāo)簽(t1)和與第一靶核酸片段互補(bǔ)的第一正向引物(F1)，(b)獲得第二核酸序列，其包含第二標(biāo)簽(t2)和與第一靶核酸片段互補(bǔ)的第一反向引物(R1)，(c)獲得第三核酸序列，其包含第三標(biāo)簽(t3)和與第二靶核酸片段互補(bǔ)的第二正向引物(F2)，(d)獲得第四核酸序列，其包含第一標(biāo)簽(t1)、與第二靶核酸片段互補(bǔ)的第二反向引物(R2)以及第一標(biāo)簽(t1)與第二反向引物(R2)之間的第一正向引物的5’端部分序列或全長(zhǎng)序列(F1^)，(e)混合第一和第二靶核酸片段、第一、第二、第三和第四核酸序列以及有效量的進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)必需的試劑；以及(f)進(jìn)行PCR。

F1、R1、F2、R2是基因特異性引物，其與基因組DNA的特定區(qū)域(靶DNA或擴(kuò)增子)互補(bǔ)。這些引物的長(zhǎng)度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。通常，這些基因特異性引物的長(zhǎng)度是6-40、10-50或10-100個(gè)核苷酸。例如，這些基因特異性引物可以是15-30個(gè)核苷酸。

F1^是在R2引物的5’端處具有標(biāo)簽的F1引物序列的5’部分；F1^可以是F1的全長(zhǎng)序列或部分序列。F1^的長(zhǎng)度可取決于其GC含量，這影響其與互補(bǔ)堿基雜交時(shí)的解鏈點(diǎn)(melting point)。在一個(gè)實(shí)施方式中，F(xiàn)2^的部分序列比F2短1-20、1-10或1-5個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，F(xiàn)2^的部分序列含有F2序列的10-50％、20-80％、30-70％、40-90％或50-90％。在另一個(gè)實(shí)施方式中，F(xiàn)2^的部分序列含有3-30或5-20或8-15個(gè)核苷酸。

標(biāo)簽t1、t2和t3是不結(jié)合靶DNA的通用標(biāo)簽序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)簽t2和t3具有相同序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，t2和t3是不同的，即它們不是100％相同的。標(biāo)簽t2和t3均與標(biāo)簽t1不同。各標(biāo)簽均在基因特異性引物的5’端。在本發(fā)明中，這些標(biāo)簽序列的長(zhǎng)度至少為3個(gè)核苷酸，且可以是長(zhǎng)度為5-100、3-40或10-30個(gè)核苷酸。標(biāo)簽通常設(shè)計(jì)為使基因特異性無(wú)標(biāo)簽引物的解鏈溫度增加至少5℃。標(biāo)簽序列可以是修飾的或未修飾的核酸。許多修飾的堿基(例如鎖核酸或肽核酸)的退火溫度高于其相應(yīng)的天然堿基。當(dāng)出于多種原因需要使用較短的標(biāo)簽序列時(shí)，這些修飾的堿基可用于代替天然堿基。

圖1A和1B用于例示目的，不表明本發(fā)明僅限于這些附圖。圖1A顯示使用不具有重疊區(qū)域的兩條靶序列的典型PCR擴(kuò)增。圖1B顯示F1和R2引物的PD形成和莖環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)PD累積的抑制。

圖1B顯示本發(fā)明如何防止引物二聚體的指數(shù)擴(kuò)增。在圖1B中，正向引物F1和反向引物R2在其3’端具有互補(bǔ)區(qū)域。循環(huán)1后，形成PD鏈1和PD鏈2。循環(huán)2中，在左側(cè)，PD鏈2形成莖環(huán)，其中t1和F1^分別退火至其互補(bǔ)對(duì)應(yīng)物以形成莖，且剩余的核苷酸形成環(huán)。由于t1和F1^及其各自互補(bǔ)對(duì)應(yīng)物的高局部濃度，即它們?cè)谕籔D鏈2上且彼此靠近，形成莖環(huán)比與單獨(dú)的t1F1引物退火更為有利。因此，阻斷了進(jìn)一步的引物退火，且不會(huì)獲得PD鏈2的進(jìn)一步擴(kuò)增產(chǎn)物。F1^的存在是重要的，其旨在完全阻斷引物(t1_F1)退火至PD鏈2和隨后的PD鏈2的擴(kuò)增。在不存在F1^的情況下，引物t1_F1可優(yōu)先于僅含t1的莖環(huán)并隨后退火至PD鏈2。通過(guò)添加F1^，對(duì)于退火至PD鏈2，引物t1_F1不再優(yōu)先于含有t1_F1^的莖環(huán)。

圖1B的循環(huán)2中，在右側(cè)，與PD鏈2類似，PD鏈1也形成莖環(huán)，其中t1和F1^分別退火至其互補(bǔ)對(duì)應(yīng)物以形成莖，且剩余的核苷酸形成環(huán)。由于帶標(biāo)簽的R2引物(t1_F1^_R2)的長(zhǎng)度較長(zhǎng)且因此解鏈溫度較高，該引物可優(yōu)先于莖中的t1_F1^進(jìn)行退火，且可針對(duì)PD鏈1獲得可能的線性擴(kuò)增。圖1B顯示具有t1F1和t1_F1^_R2的引物設(shè)計(jì)的發(fā)明，PD將最多針對(duì)一條鏈進(jìn)行線性擴(kuò)增，且不會(huì)被指數(shù)擴(kuò)增。

在本發(fā)明的步驟(f)中，可以一階段(一種循環(huán)條件)或兩階段(兩種不同的循環(huán)條件)的形式進(jìn)行PCR。在兩階段PCR中，退火溫度在第二循環(huán)條件中增加，其進(jìn)一步減少引物二聚體形成。

在一階段中，PCR包括以下步驟：(f1)激活DNA聚合酶并使(e)的混合物中的DNA變性，以及(f2)通過(guò)PCR的變性、退火和引物延伸步驟對(duì)(f1)的混合物循環(huán)多次以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。

在兩階段中，PCR包括以下步驟：(f-i)激活DNA聚合酶并使(e)的混合物中的DNA變性，(f-ii)通過(guò)PCR的變性、退火和引物延伸步驟對(duì)(f-i)的混合物循環(huán)至少兩次，以及(f-iii)在高于步驟(f-ii)中退火溫度的退火溫度下通過(guò)PCR的變性、退火和引物延伸步驟對(duì)(f-i)的混合物進(jìn)行循環(huán)以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。

兩階段PCR中，在步驟(f-ii)中，核酸和試劑的混合物通過(guò)變性、退火和引物延伸的PCR循環(huán)運(yùn)行至少兩次，如2-5次。在步驟(f-iii)中，(f)的混合物經(jīng)歷更多次變性、退火和引物延伸的PCR循環(huán)；此時(shí)是在高于步驟(f-ii)中退火溫度的退火溫度下進(jìn)行的。例如，步驟(f-iii)中的退火溫度比步驟(f-ii)中的退火溫度高約4-35℃，或5-25℃，或6-20℃，或6-15℃。例如，退火和延伸的第一循環(huán)(步驟f-ii)的第一溫度是58-62℃，例如60℃，且退火和延伸的第二循環(huán)(步驟f-iii)的第二溫度是66-70℃，例如68℃。

兩階段PCR中，提高第二階段(f-iii)中的退火溫度以防止引物二聚體的反復(fù)起始。PCR的第一階段(f-ii)后，兩端的標(biāo)簽使得各擴(kuò)增的靶序列產(chǎn)物延長(zhǎng)且因此標(biāo)簽使得退火區(qū)域延長(zhǎng)。因此，提高第二階段中的退火溫度降不會(huì)影響引物退火至特異性靶DNA。然而，提高第二階段中的退火溫度將減少引物二聚體的起始，其中互補(bǔ)區(qū)域保持相同長(zhǎng)度。

以下實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例僅旨在說(shuō)明本發(fā)明而不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。

實(shí)施例

表1顯示用于以下實(shí)施例的寡核苷酸序列。

表1

*小寫字母表示標(biāo)簽序列；下劃線表示R2中插入的部分F1序列；未標(biāo)記的大寫序列是基因特異性序列。

表1中的寡核苷酸1-4是不具有標(biāo)簽序列的針對(duì)BRCA1基因擴(kuò)增子1和擴(kuò)增子2的靶標(biāo)特異性引物；擴(kuò)增子1和擴(kuò)增子2不具有重疊序列。寡核苷酸5-6是標(biāo)簽序列，其來(lái)自億明達(dá)公司(Illumina)TSCA標(biāo)簽序列。寡核苷酸7-15是實(shí)施例1-3中使用的帶標(biāo)簽的引物。

F1和R2在其3’端具有7個(gè)互補(bǔ)堿基且形成圖2所示的雜合二聚體。

表2顯示包括PD的擴(kuò)增子大小，和人基因組19上的位置。

表2

*大小僅反映使用具有t1和t2標(biāo)簽且不具有F1^的引物的擴(kuò)增子。

表3顯示實(shí)施例1、2和3中引物組合的信息。

表3

*含有F1和R2的相互作用的引物以粗體顯示于2重PCR引物混合物中

實(shí)施例1：1階段PCR擴(kuò)增

基因特異性PCR的典型的25μL PCR反應(yīng)混合物包括：2μL人基因組DNA(普洛麥格公司(Promega)目錄號(hào)G3041，使用低TE緩沖液(USB公司目錄號(hào)75793)稀釋至5ng/μL)、12.5μL的2x主混合物(Master Mix)(凱杰公司(Qiagen)目錄號(hào)206413)、8.5μL無(wú)核酸酶水，和2μL的基因特異性引物混合物(各2.5μM，混合信息參見(jiàn)表3，寡核苷酸序列參見(jiàn)表1)。

1重和2重PCR反應(yīng)均如下所述在熱循環(huán)儀上進(jìn)行：

1次循環(huán) 95℃15分鐘酶激活和初始DNA變性

30次循環(huán) 95℃30秒 變性

60℃90秒 退火/延伸

1次循環(huán) 72℃5分鐘 最終延伸

1次循環(huán) 8℃保持

在該實(shí)施例中，退火和延伸溫度在循環(huán)期間保持恒定；因此其稱作1階段PCR擴(kuò)增。

實(shí)施例2：2階段PCR擴(kuò)增

使用與實(shí)施例1類似的PCR反應(yīng)混合物，但在熱循環(huán)儀上使用2階段PCR循環(huán)方案。前五次退火和延伸的循環(huán)在60℃下進(jìn)行，這與實(shí)施例1中使用的溫度相同。后續(xù)的25次退火和延伸的循環(huán)在升高的68℃下進(jìn)行以抑制引物二聚體的起始。

該2階段PCR方案如下所示：

1次循環(huán) 95℃15分鐘 酶激活和初始DNA變性

5次循環(huán) 95℃30秒 變性

60℃90秒 退火/延伸

25次循環(huán) 95℃30秒 變性

68℃90秒 在升高的溫度下進(jìn)行退火/延伸

1次循環(huán) 72℃5分鐘 最終延伸

1次循環(huán) 8℃保持

實(shí)施例3：瓊脂糖凝膠電泳

在E-Base設(shè)備(生命科學(xué)技術(shù)公司(Life Technologies))上分析PCR產(chǎn)物。將2μL的各PCR產(chǎn)物與18μL無(wú)核酸酶水混合并隨后直接加載至2％E-凝膠(E-gel)上。對(duì)稀釋的PCR產(chǎn)物和50bp DNA梯狀條帶(英杰公司(Invitrogen)目錄號(hào)10488-043)進(jìn)行DNA凝膠電泳。在運(yùn)行的末端，通過(guò)E-凝膠成像儀(E-gel Imager)(生命科學(xué)技術(shù)公司)捕獲凝膠的數(shù)字圖像。結(jié)果示于圖3。

圖3中，頂部小圖顯示1階段PCR方案(實(shí)施例1)的結(jié)果，底部小圖顯示2階段PCR方案(實(shí)施例2)的結(jié)果。泳道1和2是1重PCR，顯示靶擴(kuò)增子1和2的大小。剩余的反應(yīng)都是2重PCR(泳道3-8)。當(dāng)這兩種擴(kuò)增子多路復(fù)合在一起時(shí)，由于F1和R2的3’端的強(qiáng)相互作用，在1階段和2階段PCR條件下均形成F1+R2二聚體擴(kuò)增子并且其在PCR反應(yīng)物中占主導(dǎo)(如泳道3所示)。泳道4-8中PD中形成的莖結(jié)構(gòu)除F1序列的5’端部分的3、6、9、12和15個(gè)核苷酸以外還含有t1序列(20nt)。與泳道3(無(wú)F1序列)相比，導(dǎo)入部分F1序列減少了泳道4-8中檢測(cè)到的二聚體含量。當(dāng)二聚體擴(kuò)增被充分抑制時(shí)，靶擴(kuò)增子成為可檢測(cè)的(上方小圖中的泳道6和下方小圖中的泳道5)。當(dāng)兩個(gè)小圖中的泳道7-8中實(shí)現(xiàn)二聚體擴(kuò)增的近乎完全抑制時(shí)，兩種靶擴(kuò)增子產(chǎn)物在反應(yīng)物中占主導(dǎo)。

目前以這類完整、清楚、簡(jiǎn)潔和準(zhǔn)確的形式描述了本發(fā)明以及制備和使用的方式和方法，使得本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)其進(jìn)行制備和使用。應(yīng)理解，前文描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式且可作出修改而不背離權(quán)利要求所涵蓋的本發(fā)明的范圍。為具體指出并明確要求本發(fā)明的主題，以下權(quán)利要求對(duì)說(shuō)明書做出總結(jié)。