專利名稱：一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學及分子診斷領域的等溫核酸擴增技術領域，具體涉及一種減少引物間聚合非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術。
背景技術：
基因擴增技術是隨著基因工程技術和分子生物學的發(fā)展而產(chǎn)生的，1987年，美國 PE(Cetus)公司 Kary Mullis 發(fā)明了聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)專利技術(US Patent 4，683，202)。這種通過熱循環(huán)使模板解鏈的DNA擴增技術不僅成為生命科學最關鍵、核心的基礎技術。由于其呈幾何級數(shù)放大的高靈敏度，也開始應用于臨床檢驗等領域，特別是美國ABI公司于1997年推出實時熒光定量PCR(US Patent 6，485，903) 技術將傳統(tǒng)的檢測信號相加的納克(ng)級檢驗(部分技術整合級聯(lián)信號放大可達pg級靈敏度)帶進了信號指數(shù)放大的飛克(fg)級定量檢驗，以實時熒光定量PCR技術為代表的基因擴增技術使臨床檢驗從此進入分子診斷及檢驗分析數(shù)字化時代。與此同時，一系列的不依賴于熱循環(huán)解鏈的等溫(/恒溫)基因擴增技術也有了長足的發(fā)展。核酸等溫擴增術的特點是擴增反應的全過程(除初始的雜交步驟外)均在單一溫度，無需專門的擴增儀器下進行，而不像PCR反應那樣，需要經(jīng)歷幾十個溫度變化的循環(huán)過程。等溫擴增技術的這一特點，使得它們對所需儀器的要求大大簡化，檢測時間顯著縮短，因而適合于現(xiàn)場快檢或床邊檢測。比較代表性的有鏈置換擴增(Strand Displacement Amplification, SDA)，核酸序列依賴擴增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NASBA),轉錄介導擴增(Transcription Mediated Amplification, TMA)，滾環(huán)擴增 (Rolling CircleAmplification, RCA)，連環(huán)恒溫擴增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，解旋酶依賴擴增(Helicase Dependent Amplification, HDA)和寡核苷酸恒溫擴增(Isothermal Amplificatio of Oligonucleotides)等。其中又以 RNA擴增技術靈敏度最高，應用比較成熟。轉錄介導的擴增方法(即轉錄RNA擴增技術)包括TMA 和 NASBA。TMA(PNAS，USA87 :pl874和 US Patent :5，766，849)是一種利用 AMV/M-MLV逆轉錄酶和T7RNA多聚酶2種酶的共同作用，在等溫條件下來擴增RNA或DNA的反應系統(tǒng)，主要擴增原理為目標序列在逆轉錄酶作用下，以與T7啟動子嵌合的引物為引導進行逆轉錄，逆轉錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解以后，合成末端帶T7啟動子的雙鏈DNA，并在 T7RNA多聚酶作用下，一個DNA分子轉錄出七百條目標RNA序列，部分RNA又可以作為模板進行下一個循環(huán)，整個反應是一個自催化過程。NASBA[Nature350(6313)p91和US Patent 7，074，558]的原理與TMA相似，但僅一條引物5，端加上T7啟動子序列，進而DNA僅一條鏈轉錄；在核酸提取和擴增產(chǎn)物及信號檢測方法上也有所不同。轉錄介導的擴增方法擴增效率極高，靈敏度高于實時熒光定量PCR技術，反應條件簡單，無需專門的擴增儀器，且因整個反應在1個試管中恒溫進行，減少了熱循環(huán)PCR產(chǎn)物氣霧膠的交叉污染。與RT-PCR比較，該技術可減少樣品中抑制性物質(zhì)的影響，不受背景中DNA的干擾，單鏈RNA序列是特異的靶序列，產(chǎn)物RNA不易發(fā)生交叉污染，降低檢測交叉污染的假陽性率。整個反應過程由三種酶控制，操作次數(shù)少，并大大縮短檢測產(chǎn)生結果的時間。特異性好，忠實性高，其檢測效率高于PCR。然而，等溫(/恒溫)基因擴增技術反應溫度一般明顯低于熱循環(huán)PCR反應，使一對過量引物間雜交結合幾率明顯高于傳統(tǒng)PCR反應的熱啟動情況，過量的一對引物3’末端少數(shù)互補堿基低溫下更容易雜交、延伸形成引物二聚體，隨后以引物二聚體為理想模板被更多游離的引物非特異性指數(shù)擴增。這種過量引物間的二聚體非特異性聚合隨后被轉錄介導的擴增技術高效放大，導致本底信號高，易假陽性。本發(fā)明“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”根據(jù)大多數(shù)一對引物不同程度地產(chǎn)生引物二聚體非特異性擴增，而單一引物自身(同序)不會形成引物二聚體的普遍現(xiàn)象，采用中間部分同序的一對引物設計(CentralHomogenic Primers)，最大限度地近似單一引物，大大減少引物間聚合的非特異性擴增，也就減少了假陽性。最后擴增產(chǎn)物檢測通過整合成熟的一種分子燈標/信標 Molecular Beacon (Nat. Biotechnol :14，p303 禾口 US Patent :05925517)探針技術，分子燈標探針雜交增加了一道靶特異性檢驗，同時因探針分子內(nèi)兩末端自身結合而不易與過量引物分子間雜交聚合而非特異性擴增，較其他方法特異性高了許多。特異性雜交后釋放出的熒光信號再采用便攜式手持熒光閱讀儀判讀，或常規(guī)實時熒光PCR儀實時檢測，或高通量微納熒光PCR芯片并行分析。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服一對引物間形成二聚體造成的轉錄等溫擴增技術非特異性擴增的干擾， 以及非特異擴增竟爭性消耗轉錄等溫擴增反應成份的局限。本發(fā)明“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”是借助帶啟動子引物將啟動子引入cDNA的一種RNA擴增技術，通過一對中間部分同序引物策略減少了其非特異性擴增。其特征是一個RNA靶模板通過逆轉錄成帶噬菌體啟動子序列的cDNA，再轉錄成大量拷貝RNA并循環(huán)反應大量擴增的過程。所述的逆轉錄生成帶啟動子DNA步驟是指使用逆轉錄酶以RNA為模板合成互補的 DNA鏈并通過引物在其前端引入噬菌體啟動子序列，利用逆轉錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解以后，合成雙鏈cDNA。所述的轉錄RNA擴增過程是指利用噬菌體RNA聚合酶 (Polymerase)特異性地識別并結合模板上噬菌體啟動子序列，催化在雙鏈和單鏈DNA噬菌體啟動子下游基因轉錄合成單鏈RNA。所述的帶啟動子序列的引物是指選擇靶特異性的中間4-Sbase同序的一對引物，其5’端均加上噬菌體啟動子序列，如此高度近似的一對引物存在兩段相同序列，最大程度地限制了過量引物間二聚體的非特異性擴增，大大提高了轉錄介導的恒溫擴增技術可靠性。所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”，其所述的擴增模板選擇靶基因代表性序列，長100-300bp，其兩端選擇有4-SlDase互補且下游取反義鏈后中間4-Sbase同序的序列作為引物。所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”，其所述的逆轉錄酶包括禽類髓母細胞瘤病毒AMV逆轉錄酶、鼠白血病病毒M-MuLV逆轉錄酶和RNase H活性失活的重組M-MuLV鼠白血病病毒逆轉錄酶，另加RNase H酶。所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”，其所述的噬菌體RNA聚合酶包括T7、T3> SP6等RNA聚合酶Polymerase。
所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”，其所述的噬菌體啟動子序列是指Τ7、T3、SP6結合識別序列。所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”，其所述的引物設計原則是在引物距3’末端34base遠的中間部位選取4-8base同序策略，引物3’末端不能有兩個以上互補且最末一個堿基絕不能互補，引物5’端不能有三個以上互補特別是連續(xù)互補，引物5’端均加上噬菌體啟動子序列。所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”，其所述的實驗條件同于一般轉錄介導的等溫擴增技術。酶共同反應條件pH8. 5的4mM Tris-CL, 5mM KCL， 1. 2mMMgCL,0. 2mM DTT 禾口 1. 5% DMSO，引物濃度 3-5 μ Μ。所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”，其所述的燈標熒光探針設計原則是探針環(huán)長16-32baSe，總長最好< 40nt，Tm值比引物的Tm值要高 5-10°C ；選擇的序列接近擴增產(chǎn)物中心，距兩引物> 6base ；探針鍋柄區(qū)/發(fā)夾區(qū)選靶為長 4-8bp互補序列以形成鍋柄樣結構；5’端不能是G堿基，標熒光素，3’端標淬滅劑且必須封閉。所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”，其所述的檢測方式包括便攜式掌上熒光閱讀儀快速即時現(xiàn)場檢測；也可以實時熒光等溫擴增分析，和通過微納PCR芯片對多靶基因、多基因位點進行等溫擴增-陣列快速檢測。所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”，其所述的技術用于基因檢測試劑盒，盒成份包括核酸提取試劑，dNTPs, rNTPs, T7p0lymerase，逆轉錄酶 M-MLV及其緩沖液，燈標熒光探針，帶T7上游引物F/下游引物R，標準對照物，DEPC純化水 dH20, RNasin，礦物油。本發(fā)明“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”是一種基于基因轉錄的擴增(Transcription-based Amplification System, TAS, PNAS, USA87 :pl874) 技術，主要利用噬菌體RNA聚合酶包括T7、T3> SP6等RNA Polymerase依賴DNA模板的合成 RNA的活性，如T7等RNA聚合酶無需啟始引物，能高度特異性地識別并結合T7等噬菌體啟動子序列，催化在雙鏈和單鏈DNA噬菌體啟動子下游基因轉錄合成單鏈RNA，最適條件下1 摩爾的模板DNA可得到大于700摩爾的RNA轉錄產(chǎn)物(Nucleic Acids Res.，18，p83)；再結合逆轉錄酶包括禽類髓母細胞瘤病毒AMV逆轉錄酶、/鼠白血病病毒M-MuLV逆轉錄酶的逆轉錄活性以RNA為模板從引物開始合成互補的DNA鏈，利用逆轉錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解以后，合成雙鏈cDNA。在設計合成引物時有目的地引入T7等噬菌體啟動子序列，一是待測靶模板RNA逆轉錄成cDNA時借預設引物引入了啟動子序列，帶啟動子序列的cDNA在T7等RNA聚合酶作用下大量轉錄RNA產(chǎn)物；二是部分RNA產(chǎn)物又可進入逆轉錄反應成為帶啟動子序列的cDNA，再大量轉錄RNA產(chǎn)物。如此循環(huán)完成自催化DNA擴增和大量轉錄RNA的基因擴增過程，原理見附

圖1。擴增一對引物兩5’端都可加上噬菌體啟動子序列，從而cDNA雙鏈均帶有啟動子序列，雙鏈同時大量轉錄RNA和負鏈(anti-sense) RNA產(chǎn)物，其擴增靈敏度極高，非特異性擴增也容易極度放大；適度采用一條引物5’端帶上噬菌體啟動子序列，而另一條引物不帶啟動子或部分比列帶啟動子使cDNA僅一條或部分鏈轉錄RNA，適當調(diào)低擴增靈敏度，以期適應不同檢測本底要求的靈敏度窗口。等溫擴增反應一般于簡易恒溫金屬浴或水浴箱中進行。
基因擴增技術非特異性擴增主要源于過量一對引物間3’末端互補堿基配對、 3’ _3’對頭式雜交、延伸形成引物二聚體，隨后以引物二聚體為理想模板被更多游離的引物非特異性指數(shù)擴增；而引物末端與非特異性模板雜交、擴增因堿基配對短而隨機、不聚焦和模板濃度低而大大受限。一對引物間3’末端多個連續(xù)互補堿基可以通過引物設計軟件設限而避免，由于基因僅4種堿基排列方式，一對引物間3’末端有1-2個堿基互補就不可避免，引物鏈可彎曲轉向，一對引物3’末端少數(shù)互補堿基就可借助一條鏈轉向后3’末端外的多個互補堿基合力而雜交、延伸形成引物二聚體。所以，按目前僅避免引物間多個連續(xù)互補堿基、沒有二級結構等一般性原則設計的引物均不同程度地存在引物二聚體非特異性擴增現(xiàn)象。不具備常規(guī)PCR熱啟動-熱循環(huán)條件，在等溫擴增技術的低溫擴增條件下，過量的一對傳統(tǒng)引物末端低溫更容易雜交、延伸形成引物二聚體，隨后以此二聚體作為模板被過量游離的引物非特異性擴增；再被轉錄介導的擴增技術高效放大，導致本底信號高，易假陽性。本發(fā)明“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”根據(jù)單一引物自身 (同序)不會形成引物二聚體的普遍現(xiàn)象，通過選擇部分同序的一對引物使其最大限度地近似單一引物從而減少二聚體的程度，并將這種部分相同序列，放在引物最關鍵部位，采用 5’ _3’平行比對中間部分同序的一對引物(CentralHomogenic Primers)策略，中間部分相同序列堿基相互排斥，其分散和抵消了一對引物間少數(shù)互補堿基的氫鍵結合力，大大減少引物間相吸、聚合的非特異性擴增。最后，一對引物兩5’端加上噬菌體啟動子序列，其中一條引物加短一些啟動子序列或部分比列帶短啟動子，中間部分同序的一對引物5’端再加上相同噬菌體啟動子序列，如此高度同序引物對基本上將引物間聚合形成引物二聚體非特異性擴增降到極低限度，結果是克服了轉錄介導的等溫擴增技術難以逾越的引物二聚體非特異性擴增障礙。等溫擴增產(chǎn)物通過分子燈標(信標)的熒光檢測，分子燈標是一種長度為 16-32mer靶特異序列探針的兩端分別加上5-8mer序列互補的鍋柄區(qū)。在自由狀態(tài)時由于鍋柄區(qū)互補序列的結合使探針分子形成鍋柄樣結構，又稱發(fā)夾狀探針。其5'末端及3' 末端分別聯(lián)用熒光素分子及猝滅劑分子。5'端常標記熒光素包括5-碘乙酰胺-熒光素 (5-iodoacetamidofluorescein)，6-羧基-熒光素(FAM)，四氯 _6 羧基熒光素(TET)和六-6-羧基熒光素(HEX)等；3'端標記二甲氨基偶氮苯甲酚Dabcyl-[4-dimethylamin ophenylazo]benzonic acid)為淬滅劑。自由狀態(tài)時，發(fā)夾結構的兩個末端靠近，使熒光分子與淬滅分子靠近(約為7-lOnm)，此時發(fā)生熒光共振能量轉移，使熒光分子發(fā)出的熒光被淬滅分子吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被淬滅。根據(jù)i^oerster理論，中心熒光能量轉移效率與兩者距離的6次方成反比，當分子燈標與特異性靶標序列互補結合形成雙鏈雜交體時，燈標鍋柄互補區(qū)被拉開，熒光分子和淬滅分子相對分離開，燈標分子得以發(fā)射熒光。特異性燈標探針的雜交增加了一道靶特異性檢驗，同時因燈標探針分子內(nèi)兩末端自身結合而不易與過量引物分子間雜交聚合而非特異性擴增，特異性又提高了一層。中間部分同序的一對引物設計原則(1)首先遵守一般引物設計所有原則，選取長度16 24base，無四個或四個以上連續(xù)互補堿基及內(nèi)部二級結構，G+C含量40%~60%, 1值討-561，不以GG、CC夾或T結尾等等；(2)引物中間位置，平行以5' -3'方向選取一段4 lOkise完全相同的序列，優(yōu)選6 Sbase相同序列；(3)引物3'末端(即相同序列下游尾端)為1 5個lDase靶特異性序列，優(yōu)選2 4base雙向都沒有連續(xù)互補的靶特異性序列，也盡量避免不連續(xù)的單個互補堿基，最多允許一對互補，還不能留在最末端；(4) 引物5'端區(qū)(即相同序列上游首端區(qū))為5 9個kise靶特異性序列，優(yōu)選6 Sbase 沒有兩個以上連續(xù)互補的靶特異性序列，盡量選擇較少的不連續(xù)的單個互補，最多允許間隔的3對不連續(xù)互補堿基。( 一對引物兩5'端加上噬菌體啟動子序列。分子燈標(信標)探針設計的一般原則(1)燈標探針環(huán)長16-32baSe ；⑵探針的1值比引物的Tm值要高5-10°C;(3)探針序列接近擴增產(chǎn)物中心，距兩引物彡6base ； (4) 探針鍋柄區(qū)/發(fā)夾區(qū)選靶無關序列，長4-8bp，優(yōu)選5-7bp ； 探針5’端不能是G堿基，直接鄰近的堿基G也具有淬滅標記熒光素作用；(6)避免單一核苷酸成串，尤其是G ； (7)富含 AT的序列要增加長度，以達到符合要求的Tm值，但探針總長最好< 40nt ;(8)探針的3’端必須封閉以防止PCR擴增時延伸；(9)探針鍋柄/發(fā)夾區(qū)序列可變通為一端仍然選擇靶特異序列，另一端就必須選其互補序列以形成鍋柄樣結構。轉錄介導的等溫擴增反應一般于EP離心管密閉在溫度41°C反應，但“閉管操作” 多數(shù)情況下并不完全封閉，除螺旋蓋試管外，大多數(shù)PCR試管扣式蓋不嚴實，加溫條件下總會有一些汽霧溢(擠)出，產(chǎn)生汽霧膠交叉污染，汽霧膠成份不僅包括陽性樣本擴增產(chǎn)物、 陽性對照擴增產(chǎn)物，而且每一個檢測反應管包括大多陰性管都會產(chǎn)生引物二聚體擴增，隨著重復同一 PCR擴增，小分子的二聚體容易反復地擴增、泄漏、積聚……，等溫擴增熒光PCR 不是從零開始而是從上次PCR結束產(chǎn)物開始。一般試驗室環(huán)境污染需要停止同樣試驗一兩月才能自凈。因此反應液表面必須(小心)多加一層礦物油密閉，但是臨檢等應用試驗室大量檢測操作難保所有PCR反應管不被振動、混合，礦物油面上管壁殘留任何一點反應液都仍會有效擴增、汽霧膠溢出、泄漏。所以，應用試驗室在配試劑、加樣本區(qū)外，有必要設置一遠隔的獨立擴增檢測室并專人操作，從物理空間上徹底隔絕擴增產(chǎn)物交叉污染的可能。轉錄介導的等溫擴增技術預防污染還需要在試劑盒作一些防污染挫施，(1)在潔凈環(huán)境下分裝PCR試劑成小包裝一次用完；( 等溫擴增上游引物F緩釋，其不是溶于純化水而是融于 50% PEG6000 (融點55-630C ) 1. 3 μ M再分裝PCR反應管(2-4 μ 1/管)，預制PEG包裹引物 F凝固于管底，這樣礦物油面上殘留的任何反應液因成份不全而不會擴增，緩釋反應液被礦物油密封；(3)下游引物R錨定，其5，端加Oligo-dA通過Oligo-dT微磁球固化，或通過5， 端預聯(lián)的羥基/氨基交聯(lián)微磁球表面，固相化引物R既用于核酸提取又直接逆轉錄。 如果配試劑、加樣本區(qū)/試驗室不慎污染，產(chǎn)物RNA污染可通過常規(guī)清潔衛(wèi)生挫施清除，并用紫外線(UV)照射，10%次氯酸鈉(漂白劑)清潔污染區(qū)及70%乙醇清洗等一般性挫施。疑似產(chǎn)物DNA污染的樣本RNA或反應液Mix (不包括引物)一般加DNaseI (1U/ μ 1 不含RNase) 1 μ 1于37°C消化10分鐘，再74°C酶滅活20分鐘。疑似產(chǎn)物DNA污染的引物一般加核酸外切酶III (lOOU/μ 1) 1 μ 1于37°C消化10分鐘，再74°C酶滅活20分鐘。這些綜合處理能十分有效地彌補操作不慎所帶來的甚至嚴重交叉污染，仍可取得可靠的正確檢測結果。 轉錄介導的等溫擴增產(chǎn)物量經(jīng)分子燈標特異性雜交熒光信號通過(1)便攜式掌上熒光閱讀儀快速即時現(xiàn)場檢測，熒光閱讀儀激發(fā)波長491nm，發(fā)射光515nm讀值；
(2)也可以實時熒光等溫擴增分析，采用激發(fā)波長470nm，發(fā)射光520/550/580nm實時熒光PCR儀通過設置65°C 5分鐘后40-60循環(huán)41°C 1_3分鐘，41°C 30秒并讀取熒光值；
(3)可以通過微納PCR芯片對多靶基因、多基因位點進行等溫擴增-陣列(Isothermalamplification-Array)快速檢測，芯片是利用集成電路光刻工藝在硅片或石英玻璃上刻上許多微腔體，并用納升液體分配系統(tǒng)將不同的試劑準確地分配到納升級的微反應孔中。轉錄介導的等溫擴增反應實施方式(1)恒溫金屬浴反應及便攜式掌上熒光儀閱讀
模板(Template )10 μ 1上游引物 F(5PM)1 Ul下游引物 R(5PM) 1 μ IOmM dNTP 1 μ ι O.lMrNTP, 1 μ J 10 X 反應 buffer 5 μ 1 RNasin ι μ ] JH2O__28 μ 1
50 μ 1IOX 緩沖液(ρΗ8· 5 的 40mM Tris_CL，50mM KCL, 12mM MgCL, 2mM DTT 禾口 15 % DMSO)，于0. 5ml的EP管，水浴65 °C變性5分鐘，再41 °C 5分鐘后加各1 μ 1的T7poIymerase， M-MLV和RNaseH(0. 2U)，最后加40 μ 1礦物油封閉，于金屬浴41°C反應60-90分鐘。反應90 分鐘后加1 μ 1的5 μ M燈標探針檢測，置EP管于便攜式掌上熒光閱讀儀在激發(fā)波長491nm 檢測，發(fā)射光515nm讀值。(2)實時熒光等溫擴增反應分析
模板(Template)10 μ 1上游引物F(5 μ Μ)0.5 U 1下游引物R(5 μ Μ)0.5 μ 1IOmM dNTP0.5 μ 10.1M rNTP,0.5 μ I10 X 反應 buffer2.5 μ 1RNasin0.5 μ 1分子燈標探針(5U Μ)0.5 UldH,09 μ 125 μ ！IOX 緩沖液(ρΗ8· 5 的 40mM Tris-CL, 50mM KCL, 12mM MgCL, 2mM DTT 禾口 15 % DMSO)，于0. 2ml的PCR試管，變性65°C 5分鐘，再41°C 5分鐘后加各1 μ 1的T7polymerase, M-MLV和RNaseH(0. 2U)，最后加20 μ 1礦物油封閉，于41 °C 60-90分鐘。采用激發(fā)波長 470nm,發(fā)射光520/550/580nm的普通實時熒光PCR儀通過設置65°C 5分鐘后40-60循環(huán) 41°C 1-3分鐘，41°C 30秒并讀取熒光值。(3)微納PCR芯片等溫擴增-陣列分析上游引物F/下游引物R(5yM)采用納升液體分配系統(tǒng)將0. 1 μ 1的引物準確地分
配到納升級的微反應孔中；而反應混合液如下配制
權利要求
1.“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”，其特征是借助CDNA步驟的等溫擴增大量RNA產(chǎn)物，靶RNA加入帶噬菌體啟動子序列的引物，以逆轉錄酶催化生成第一鏈或兩條鏈均帶啟動子的cDNA，再以噬菌體RNA聚合酶結合啟動子轉錄大量拷貝RNA 產(chǎn)物并循環(huán)反應大量擴增的過程，擴增產(chǎn)物通過特異性熒光探針檢測。所述的帶啟動子序列的引物是指選擇靶特異性的中間4-Sbase同序的一對引物，其5’端均加上噬菌體啟動子序列，如此高度近似的一對引物存在兩段相同序列，最大程度地限制了過量引物間二聚體的非特異性擴增及轉錄，大大提高了轉錄介導的恒溫擴增技術可靠性。
2.根椐權力要求1所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”， 其所述的擴增模板選擇靶基因代表性序列，長100-300bp，其兩端選擇有4-SlDase互補且下游取反義鏈后中間4-Sbase同序的序列作為引物。
3.根椐權力要求1所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”， 其所述的逆轉錄酶包括禽類髓母細胞瘤病毒AMV逆轉錄酶、鼠白血病病毒M-MuLV逆轉錄酶和RNase H活性失活的重組M-MuLV鼠白血病病毒逆轉錄酶，另加RNase H酶。
4.根椐權力要求1所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”， 其所述的噬菌體RNA聚合酶包括T7、T3> SP6等RNA聚合酶Polymerase。
5.根椐權力要求1所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”， 其所述的噬菌體啟動子序列是指Τ7、T3、SP6結合識別序列。
6.根椐權力要求1所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”， 其所述的引物設計原則是在引物距3’末端3-5kiSe遠的中間部位選取4-Sbase同序策略， 引物3’末端不能有兩個以上互補且最末一個堿基絕不能互補，引物5’端不能有三個以上互補特別是連續(xù)互補，引物5’端均加上噬菌體啟動子序列。
7.根椐權力要求1所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”，其所述的實驗條件同于一般轉錄介導的等溫擴增技術。酶共同反應條件PH8. 5的 4mMTris-CL,5mM KCL, 1. 2mM MgCL，0. 2mM DTT 禾口 1· 5% DMSO，引物濃度 3-5 μ Μ。
8.根椐權力要求1所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”， 其所述的燈標熒光探針設計原則是探針環(huán)長16-32baSe，總長最好< 40nt，Tm值比引物的 Tffl值要高5-10°C ；選擇的序列接近擴增產(chǎn)物中心，距兩引物> 6base ；探針鍋柄區(qū)/發(fā)夾區(qū)選靶為長4-8bp互補序列以形成鍋柄樣結構；5’端不能是G堿基，標熒光素，3’端標淬滅劑且必須封閉。
9.根椐權力要求1所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”， 其所述的檢測方式包括便攜式掌上熒光閱讀儀快速即時現(xiàn)場檢測；也可以實時熒光等溫擴增分析，和通過微納PCR芯片對多靶基因、多基因位點進行等溫擴增-陣列快速檢測。
10.根椐權力要求1所述的“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”，其所述的技術用于基因檢測試劑盒，盒成份包括核酸提取試劑，dNTPs, rNTPs, T7polymerase，逆轉錄酶M-MLV及其緩沖液，燈標熒光探針，帶T7上游引物F/下游引物R， 標準對照物，DEPC純化水dH20，RNasin，礦物油。
全文摘要
本發(fā)明“一種減少引物二聚體非特異性擴增的轉錄等溫擴增技術”為一種RNA擴增檢測技術，其特征是選取靶RNA擴增序列，其兩端引物選中間4-8base同序的引物序列并在其5’端加上噬菌體啟動子序列，通過這種嵌合引物的“引入”，靶RNA逆轉錄成帶啟動子序列的cDNA，利用噬菌體RNA聚合酶識別、結合啟動子并大量轉錄cDNA啟動子下游序列成大量RNA片段。所述的帶啟動子中間部分同序引物限制了過量引物間二聚體非特異性擴增及轉錄，提高了轉錄等溫擴增檢測的可靠性。
文檔編號C12Q1/68GK102533963SQ201010622210
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月27日 優(yōu)先權日2010年12月27日
發(fā)明者廖同兵, 江必勝, 江洪 申請人:北京萬達因生物醫(yī)學技術有限責任公司